神經學與神經生物學

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研究文章
甘氨酸受體α3亞基在不同疼痛類型中的表達受不同調控

特立尼達的Mariqueo

塔爾卡大學醫學院神經藥理學實驗室,醫學研究中心,塔爾卡,智利

*通訊作者:智利塔爾卡大學醫學院醫學研究中心神經藥理學實驗室特立尼達·A·馬裏奎奧電話:56 - 948875520;電子郵件:tmariqueo@utalca.cl


摘要

作品簡介:越來越多的證據表明,興奮性/抑製性神經傳遞平衡的改變與大多數慢性疼痛形式的發展有關。在這種情況下,甘氨酸介導的抑製性神經傳遞的損傷被認為在導致中樞性疼痛超敏反應的發展和維持的去抑製中起著關鍵作用

目的:本研究的目的是評價甘氨酸受體α3亞基(α3GlyR)在神經性(慢性縮緊性損傷,CCI)和炎症性(Zymosan A注射)慢性疼痛動物模型中的表達。

結果和結論:脊髓標本的RT-qPCR分析顯示,在CCI 3天和Zymosan 4小時後,glra3基因表達無變化。一個注入。然而,我們發現Western blot檢測的蛋白水平在炎症性疼痛後升高。這些數據表明,中樞敏化的調節取決於疼痛的類型。

關鍵字

中樞敏化;神經性;炎症;超敏反應;甘氨酸受體


簡介

慢性疼痛是一個主要的健康問題,影響著全世界數百萬人。僅在美國,至少有1.16億成年人受到某種形式的慢性疼痛的影響,對受影響個人的家庭來說是一項重要的醫療和經濟負擔。越來越多的證據表明,外周和中樞痛覺通路興奮性的改變是大多數慢性疼痛形式[2]的發展原因。在這種情況下,GABA和甘氨酸介導的抑製性神經傳遞的損傷被認為在導致疼痛超敏反應[3]的發展和維持的抑製解除中起著關鍵作用。甘氨酸是脊髓和腦幹的主要抑製性神經遞質,在運動呼吸控製和疼痛敏化[4]中發揮著重要作用。甘氨酸受體(GlyR)亞基由glra和glrb基因[5]編碼。在成熟脊髓中,甘氨酸激活GlyRs,這是一種主要由α1, α2, α3和β亞基[6]組成的五聚體。α3GlyRs表達於疼痛信號整合的背角脊髓[7]。有報道稱,α3GlyRs參與炎性疼痛增敏,其機製與前列腺素E2信號轉導和α3GlyRs活性降低有關[8,9]。

慢性疼痛包括幾種不同類型的疼痛,包括組織損傷後的炎症性疼痛(如關節炎)、癌症疼痛和神經損傷後的神經性疼痛、脊髓損傷和腦損傷(如中風和創傷)[10-12]。神經性和炎症性疼痛的發病機製涉及興奮性/抑製性神經傳遞平衡,這一過程與神經免疫界麵改變有關[13-15]。重要的是,持續性神經性疼痛[16-18]和炎症性疼痛[19-21]均有脊髓背側抑製活性降低的報道。然而,GlyR亞基基因在不同疼痛類型中表達的相關信息還沒有得到精確的表征。

因此,我們評估了神經性(慢性縮窄性損傷,CCI)和炎症性(Zymosan A注射)疼痛致敏動物模型中α3GlyR亞基的表達。

材料和方法
動物模型的選擇

皮下Zymosan致慢性縮窄性坐骨神經損傷(CCI)及炎症性痛覺過敏。在Sprague Dawley大鼠的左後爪上注射是眾所周知的和廣泛驗證的神經性和炎症性疼痛模型[20,8]。在智利大學的動物設施中飼養了約4周的老鼠。因此,我們優先使用成年雄性動物,因為有報道稱,不同類型的痛覺處理通道的調節和表達存在性別差異[22-24]。所有程序均符合智利大學動物使用機構委員會(n°17027-MED-UCH)規定的條例,並根據美國貝塞斯達國家衛生研究院製定的倫理協議進行。

定量聚合酶鏈反應

CCI大鼠術後3天進行脊髓組織qPCR,並與Sham(大鼠無結紮手術)的數據進行比較。Zymosan A注射液(0.06 mg, 20 μL PBS)和對照組(生理鹽水)脊髓組織在後爪注射後4小時提取定量PCR。采用硫氰酸胍-苯酚氯仿萃取法(Trizol, Life Technologies, USA)從脊髓(L3-L5腰椎段)中分離總RNA。從這些組織中製備總RNA和cDNA合成後,在Stratagene Mx3000P設備(Agilent Technologies, USA)中使用0.5 ng/uL的cDNA和SYBR green Master mix (Sigma)進行α3GlyR亞基的qPCR,最終反應體積為20 uL。PCR擴增周期為:95°C/5min 1個,95°C/30s 40個,56°C/30s和72°C/45s。所有反應均重複進行。使用Pfaffle方法[25]計算每個基因的相對表達量,並根據GAPDH的表達量歸一化(表1)。

引物 5ˈ- 3ˈ序列 放大子(堿基對大小)
GAPDH-R GGCCTCTCTCTTGCTCTCAGTA

141

GAPDH-F TTGTGAAGCTCATTTCCTGGTA
Alpha3-R GCCTTCTGATTGTCATTCTGTC

109

Alpha3-F CTCTGCGTGGTCATCGTAAG

表1:qPCR實驗用引物序列。

免疫印跡

使用微BCA蛋白測定法(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)量化總蛋白。SDSPAGE使用60 μg蛋白質在NuPAGE凝膠(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)上進行。蛋白質轉移到PVDF膜上(BioRad, Hercules, CA),然後用含有0.1% Tween 20 (TBS)的tris緩衝鹽水中的5%幹牛奶孵育過夜。TBS洗滌後,用抗α3GlyR亞基(1:300,兔;微孔)主要抗體。單克隆抗gapdh抗體作為負荷對照。

數據分析

所有數據均以均數±均數標準誤差(SEM)表示。使用圖板prism 6軟件進行統計分析。單因素方差分析。p值<0.05為顯著性。

結果與討論

為了了解α3GlyR在中樞敏化過程中的作用,我們分析了神經性和炎症性疼痛動物模型脊髓組織中α3GlyR亞單位的表達水平。從圖A可以看出,在CCI 3天後,glr3基因表達水平沒有變化。Zymosan A注射4小時後也有相似的結果。我們評估了此時glr3基因的表達,因為據報道,在CCI 3天和Zymosan A 4小時後,痛覺閾值[20]發生了顯著變化。兩者都曾作為動物模型用於研究慢性和急性神經性炎症性疼痛[26,27]。

圖1:神經性和炎症性疼痛中α3GlyR基因和蛋白表達的差異。(A)中glr3基因表達和(B)中蛋白表達。

然而,數據顯示炎性疼痛後α3GlyRs蛋白表達增加,CCI 3天後無變化(圖B)。這些結果表明,中樞疼痛敏化過程受glr3基因表達的不同調控。先前的研究已經描述了在慢性疼痛條件下抑製甘氨酸能神經傳遞被改變。為了了解α3GlyRs對中樞敏化的貢獻,Harvey RJ等人(2004)生成了Glra3-/-敲除小鼠。行為學研究表明,在Glra3-/-敲除小鼠[20]中,鞘內PGE2和外周炎症引起的疼痛敏化減輕。與這些結果一致的是,Reinold H等(2005)表明EP2受體缺乏的小鼠完全缺乏脊髓PGE2介導的[21]痛覺過敏。電生理實驗表明,PGE2可抑製α3GlyR介導的電流。這些作用被絲氨酸346位點的細胞內環突變和PKA抑製所消除,表明α3GlyRs的磷酸化一致決定炎性疼痛致敏[26]。與這些報道一致的是,我們的數據顯示α3GlyRs蛋白隻在炎症環境中增加,這表明在不同類型的疼痛條件下存在調節蛋白表達的精細調節機製。事實上,Harvey VL等在2009年發現,神經性疼痛手術[27]後,Glra3-/-敲除小鼠的疼痛行為與對照組小鼠相比沒有差異。此外,GlyRs的其他亞單位也與神經痛的建立有關。 Imlach WL, et al. showed that α2GlyR subunit expression was increased in the dorsal horn of spinal cord after neuropathic pain [29]. We have evidence that regulatory beta auxiliary subunit of glycine receptors play important role in neuropathic pain (under publication). On the other hand, previous studies have demonstrated that the activation of GlyRs triggers the chloride ion influx, which results in the membrane hyper polarization needed to control the excitability of neural circuits. Chloride homeostasis is regulated by co-transporter KCC2 [29]. One of the critical steps in the central pain sensitization that accounts for disinhibition is related with the KCC2 down regulation [30]. It has been reported that KCC2 expression is altered in the central pain sensitization process, leading to the collapse of chloride ionic gradient and shifting the glycine receptor reversal potential to more depolarized values [31]. In terms of the molecular mechanism involved in this process, Coull JA, et al. (2005) showed that ATP-stimulated microglia produce a depolarizing shift in anion reversal potential in spinal neurons [17]. The authors conclude that molecular mechanisms involved in these changes are associated with the activation of TrkB receptors by BDNF because blocking these signaling with anti-TrkB antibody or siRNA anti BDNF abolished the changes in the anion reversal potential. On the other hand, Zhou HY, et al. (2012) demonstrated that a shift in glycine current reversal potential is mediated by KCC2 calpain cleavage [32]. A recent study showed that morphine tolerance is induced by the down regulation of KCC2, impairing the chloride homeostasis in rat spinal neurons [33]. How the expression of different GlyRs can be influenced by KCC2 changes is a question not addressed yet. Future studies are necessary to propose new therapeutics alternatives for the management of chronic pain.

結論

我們的研究結果表明,α3GlyRs蛋白在炎性疼痛條件下增加,表明中樞疼痛增敏調節了不同類型疼痛環境下的基因表達調控。

確認

我感謝Nicole Cespedes收集部分qPCR數據的專業幫助,感謝Gabriela Améstica和Nicolas Sepulveda收集Western blot數據的專業幫助。

支持工作的資金來源

這項工作得到了Talca的iei QUIMBIO大學(Mariqueo TA)和FONDECYT撥款No. 3170690 (Mariqueo TA)的支持。

任何利益衝突的披露

作者聲明沒有利益衝突


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條信息

文章類型:研究文章

引用:Mariqueo TA(2020)甘氨酸受體α3亞基的表達在不同類型的疼痛中受到不同的調控。神經生物學雜誌6(2):dx.doi.org/10.16966/2379-7150.161

版權:©2020 Mariqueo TA。這是一篇開放獲取的文章,根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布,該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製,前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2020年1月29日

  • 接受日期:2020年2月14日(

  • 發表日期:2020年2月21日(