圖1:BV2細胞中Trem2基因的CRISPR/Cas9 nickase修飾。
一個。小鼠Trem2位點和CRISPR/Cas9 nickase修飾策略示意圖。gRNAs與Trem2基因外顯子2上的目標序列對齊。每個gRNA的原間隔相鄰基序(PAM)用藍色線標記,切口位置用綠色箭頭表示。
b。WT Trem2序列與Trem2 CRISPR突變體的序列比對。克隆A7和C8在第一輪CRISPR修飾中獲得,克隆B5和G4在第二輪CRISPR修飾中獲得,克隆C8作為起始細胞係。核苷酸的缺失和新生成的停止密碼子(*)都用紅色標記。
全文
亞曆山德拉E M菲利普斯1克勞迪奧·Villegas-Llerena1、2托馬斯·米碼頭1凱瑟琳Cosker1約翰·哈迪2詹妮弗·M可以排除1 *
1英國倫敦大學學院神經學研究所神經炎症學係2分子神經科學係,倫敦大學學院神經學研究所,倫敦,英國
*通訊作者:Jennifer M Pocock,倫敦大學學院神經學研究所神經炎症學係,英國倫敦WC1N 1PJ韋克菲爾德街1號,電話:+44 20 7679 4031,電子郵件:j.pocock@ucl.ac.uk
最近的全基因組關聯研究(GWAS)強調骨髓細胞2 (TREM2)上表達的基因觸發受體突變是遲發性阿爾茨海默病發展的危險因素。基於此,我們利用CRISPR/cas9基因組編輯技術在齧齒動物BV2小膠質細胞係中獲得雜合和純合敲除克隆。雜合子和純合子克隆的特征是,qPCR顯示較少的TREM2 mRNA, Western blot檢測顯示較少的TREM2細胞表達,ELISA檢測顯示較少的可溶性TREM2脫落,免疫定位檢測顯示細胞表達減少。此外,雜合子和純合子的BV2細胞表現出與野生型細胞明顯不同的形態,phalloidin染色後進一步分析顯示,在ATP或MCSF刺激後,絲狀體長度和膜皺折缺陷發生了變化。此外,與野生型細胞相比,雜合子和純合子克隆中電離鈣結合適配器分子(Iba1) mRNA的qPCR表達量和蛋白Western blot表達量均顯著降低。此外,通過FACS分析,純合子無性係對pH rodo大腸杆菌顆粒的吞噬能力顯著降低。綜合這些數據,提供了TREM2突變如何在雜合性疾病(如遲發性阿爾茨海默病)和純合性疾病(如納蘇-哈科拉病)中促進功能失調性小膠質細胞的證據,這兩種疾病都可導致癡呆。
小膠質細胞;Nasu-Hakola疾病;老年癡呆症;TREM2
ATP:三磷酸腺苷;CRISPR/cas9:聚類規則間隔短回文重複序列/ CRISPR-相關蛋白9核酸酶;DAPI: 4 ',6-二氨基-2-苯基吲哚;胎牛血清;GWAS:全基因組關聯研究;Iba1:電離鈣結合適配器分子1;負荷:遲發性阿爾茨海默病;有限合夥人:脂多糖;MCSF:巨噬細胞集落刺激因子;區域:Nasu-Hakola疾病; PBS: Phosphate Buffered Medium; PNGase: Peptide:N-Gycosidase; PFA: Paraformaldehyde; RPMI: Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium; RT: Room Temperature; SN: Cell Culture supernatant; TNFα: Tumour Necrosis Factor Alpha; TREM2: Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells 2; sTREM2, Soluble/Shed TREM2; WT: Wild-type
小神經膠質反應是與進行性神經退行性疾病(如阿爾茨海默病AD[1])相關的病理過程的重要基礎。在健康的大腦中,調節炎症對清除碎片、凋亡細胞和中和感染至關重要。然而,長時間的炎症,通常歸因於調節失調的小膠質細胞激活,可能對大腦的長期健康有害,並與多種神經退行性疾病的發病機製有關。最近的全基因組關聯研究(GWAS)已經確認,骨髓細胞(TREM2)上表達的觸發受體編碼基因中的單核苷酸多態性(SNPs)可能是晚發性阿爾茨海默病(LOAD)的危險因素[2,3]。TREM2是一個主要的小膠質細胞特異性基因,在高表達的小膠質細胞基因中排名第31位,並作為小膠質細胞[4]的樞紐基因。TREM2基因突變被認為導致了LOAD[2,3,5]中TREM2功能的喪失以及Nasu-Hakola病(NHD;也被稱為多囊脂膜性骨異常增生伴硬化性白質腦病(PLOSL),這兩種疾病都會導致進行性、持續性癡呆[6,7]。
通常情況下,TREM2可能起到抑製小膠質細胞促炎活性的作用,同時促進保護性小膠質細胞反應,如趨化和吞噬。在目前的研究中,使用CRISPR/cas9n基因編輯小鼠BV2小膠質細胞係生成TREM2敲除小膠質細胞係。這些細胞係隨後被用於功能實驗,試圖進一步了解TREM2的作用。TREM2雜合或純合敲除後,小膠質細胞出現膜皺折、絲狀延伸和吞噬功能的缺陷。此外,還觀察到電離鈣結合適配器分子1 (Iba1)的表達減少,這表明在缺乏TREM2的細胞中,細胞骨架控製存在缺陷。
經過一輪CRISPR-Cas9n修飾和隨後的Sanger測序,我們選擇了2個BV2克隆,我們稱之為克隆A7和克隆C8。這些被指定為擊倒(KD)。使用克隆C8進行的第二輪CRISPR修飾產生了兩個敲除克隆(KO),我們稱之為B5和G4(圖1a和1b)。這些克隆與野生型(WT)細胞一起用於後續的所有實驗。這些細胞的特征顯示,A7和C8克隆的去糖基化TREM2水平顯著降低,而G4和B5克隆的去糖基化TREM2水平缺乏(圖2a和2b)。與WT相比,可溶性TREM2 (sTREM2)的mRNA表達量也顯著降低(圖2c),(圖2d)。細胞TREM2的免疫定位表明,在WT細胞中,TREM2似乎高度定位於高爾基體,靠近細胞核;然而,在A7和C8克隆(圖3a)以及G4和B5敲除克隆(圖3b)中沒有這種染色。隨後,我們觀察了這些細胞在鍍膜後的形態差異(圖4a和4b),並確定TREM2敲除和敲除是否對絲狀體的形成有不利影響。對絲狀長度的分析表明,敲除和敲除克隆的整體絲狀長度顯著減少到約2 μm,而WT的平均絲狀長度為3.5 μm(圖4c)。 This was not reflected in a reduction in filopodial number for any of the clones compared with WT (Figure 4d) but further analysis revealed that the ability of the clones to produce filopodia of 5-10 μm or 10-15 μm was also significantly reduced compared with WT (Figure 4e).
圖2:利用CRISPR/Cas9修飾生成的TREM2敲除和敲除克隆的特性。
一個。代表性Western blot檢測野生型(WT)、TREM2敲除(A7和C8克隆)和TREM2敲除(G4和B5克隆)crispr編輯的BV2細胞中TREM2的表達。用PNGase處理裂解物至去糖基化蛋白,以準確定量TREM2蛋白總水平。以重組細胞外小鼠TREM2作為陽性對照。
b。TREM2蛋白表達水平的密度分析。圖表示相對於WT的蛋白質水平。值歸一化為β-肌動蛋白水平。3個獨立實驗的值用平均值±SEM表示,***ρ<0.001;單因素方差分析與Dunnett多重比較檢驗。
c。Trem2 mRNA表達歸一化為Gapdh mRNA表達。3個個體實驗中相對於WT水平的值表示為平均值±SEM (**p<0.01;單因素方差分析與Dunnett多重比較檢驗)。
d。ELISA法測定可溶性TREM2 (sTREM2)的分泌水平。圖表示strerem2水平相對於野生型(WT)。3個獨立實驗的值以平均值±SEM表示,***ρ<0.01;單因素方差分析與Dunnett多重比較檢驗。
圖3:通過免疫定位檢測TREM2在WT、敲除和敲除BV2小膠質克隆中的細胞表達。TREM2(紅色)、高爾基複合體(Golgin97;綠色)和DAPI(藍色)說明了TREM2染色強度和細胞定位的差異
一個。野生型(WT), TREM2敲除(A7和C8)
b。WT, TREM2敲除(G4和B5)細胞係。頂部麵板顯示合並後的圖像。標尺為25 μm。
圖4:trem2kd /KO對BV2小膠質細胞骨架結構的影響
一個。crispr編輯的野生型(WT)、TREM2敲除(A7和C8)和TREM2敲除(G4和B5) BV2小膠質細胞株的代表性相位對比圖像。比例尺代表100µm。
b。具有代表性的共聚焦顯微鏡圖像,標記phalloidin-568的BV2細胞係(紅色)顯示f-actin,標記DAPI(藍色)顯示細胞核。比例尺代表20µm。箭頭表示絲狀足。
c。細胞表麵絲狀偽足長度的定量,f -肌動蛋白用phalloidin染色觀察。
d。每個細胞表麵絲狀偽足數量的量化。
e。每個細胞係的絲狀偽足長度分別為0-5µm、5-10µm或10-15µm。為了進行統計分析,對每個長度類別的絲狀偽足百分比進行檢驗。
LPS刺激(1 μg/ml, 24 h)後的形態學變化分析也顯示,與WT相比,無性係之間也有變化(圖5);與WT相比,LPS刺激後,所有克隆中顯示雙極性形態的細胞數量均顯著減少(圖5a和5b)。此外,研究細胞對ATP (50 μ M, 5分鍾)或MCSF (100 ng/ml, 5分鍾)的響應,發現細胞產生褶皺的能力發生了變化,這是由擴展的細胞邊緣[8]的分離和移動形成的波狀結構(圖6a)。雖然在未受刺激的基礎條件下,具有褶皺形態的細胞比例沒有顯著改變,但與WT刺激的細胞相比,敲除和敲除克隆中ATP(圖6a和6b)或MCSF(圖6a和6c)產生褶皺的能力被顯著抑製。MCSF處理誘導的膜褶皺中的F-actin與BV2細胞中的Iba1共定位,證實了本研究中看到的結構是其他文獻報道的膜褶皺[8,9]。由於Iba1已被證明對皺褶的形成至關重要,我們分析了該蛋白的表達水平(圖7a-7d)以及該基因的mRNAAif1它為Iba1編碼(圖7b)。在所有KD/KO克隆體中Aif1mRNA(圖7b)和Iba1蛋白與WT相比顯著減少(圖7c和7d)。有趣的是肌動蛋白基因的mRNA水平Actb顯示克隆間無顯著差異(圖7e)。由於strerem2的分泌在所有克隆中都顯著減少(圖2d),我們分析了是否從WT BV2細胞中添加小膠質條件培養基(MGCM),其中含有150 ng/ml strerem2(圖2d),到B5小膠質細胞中,在我們的試驗中MGCM中幾乎可以檢測到3ng/ml的strerem2水平(圖2d),並顯示出最極端的膜皺折缺陷(圖6b和6c),能夠拯救B5克隆,因為它能夠在MCSF反應時產生膜皺折(圖7f)。WT- mgcm和B5- mgcm預處理都不能恢複B5細胞對MCSF處理的膜皺褶形成能力,在所有處理條件下,B5細胞皺褶形態的百分比仍然顯著低於WT細胞(圖7f)。此外,兩種細胞類型的MGCM預處理對WT細胞形成膜褶沒有影響(圖7f)。
圖5:trem2kd /KO對脂多糖刺激後小膠質雙極形態的影響。
一個。用phalloidin(紅色)在脂多糖(LPS, 1µg/ml)處理24小時的BV2細胞中進行f -肌動蛋白免疫熒光標記的代表性圖像。箭頭表示具有兩極形態的細胞。
b。用1µg/ml LPS刺激24小時後,定量雙極性形態細胞的百分比。對於3個獨立實驗,每個實驗最少分析5個視場,其數值以平均百分比±SEM表示,*ρ<0.05, **ρ<0.01;單因素方差分析與Dunnett多重比較檢驗。
圖6:trem2kd /KO對ATP或MCSF刺激後小膠質皺褶形成的影響
一個。用phalloidin-568(紅色)和DAPI反染色(藍色)對BV2細胞進行f -肌動蛋白免疫熒光標記的代表性圖像,BV2細胞用50 μ M ATP或100 ng/ml MCSF處理5分鍾。箭頭表示膜褶的形態。比例尺代表20 μm。
b。用50 μ M ATP刺激5分鍾後,定量細胞膜皺褶形態的細胞百分比。5個獨立實驗,每個實驗最少分析5個視場,以平均百分比±SEM表示的值,*ρ<0.05, **ρ<0.01;單因素方差分析與Dunnett多重比較檢驗。為了進行統計分析,我們將每個細胞克隆經ATP處理後皺褶形態的細胞百分比與同一克隆未處理的細胞百分比進行比較。
c。用100 ng/ml MCSF刺激5分鍾後,定量細胞膜皺褶形態細胞的百分比。5個獨立實驗,每個實驗最少分析5個視場,以平均百分比±SEM表示的值,*ρ<0.05, **ρ<0.01, ***ρ<0.001;單因素方差分析與Dunnett多重比較檢驗。
圖7:TREM2 KD/KO對膜皺褶、Iba1表達和sTREM2挽救嚐試的影響。
一個。F-actin(紅色)、Iba1(綠色)和DAPI(藍色)的免疫熒光標記的代表性圖像表明,在WT BV2細胞中,用100 ng/ml MCSF刺激5分鍾,Iba1在富F-actin膜皺褶中共定位。標尺代表10 μm。
b。qPCR檢測野生型(WT)、TREM2敲除型(A7和C8)和TREM2敲除型(G4和B5) BV2細胞中Aif1 mRNA表達水平。圖表示相對於WT水平歸一化後的Aif1 mRNA到Gapdh mRNA的表達。
c, d。代表性的western blot和隨後的密度分析Iba1在WT、TREM2敲除(A7和C8)和敲除(G4和B5)細胞中的表達。圖表示相對於WT的蛋白質水平。值歸一化為β-肌動蛋白水平。**ρ<0.01, ***ρ<0.001, ****ρ<0.0001;單因素方差分析與Dunnett多重比較檢驗。
e, f。WT vs KD和KO克隆β-actin mRNA (Actb)表達水平的qPCR分析,值為3個個體實驗的平均值±SEM。數據分析顯示,單因素方差分析與Dunnett多重比較檢驗無顯著差異。
因為吞噬是小膠質細胞的主要功能,需要細胞骨架重組在活的有機體內,我們分析了不同克隆吞噬pHrodo的能力大腸杆菌微粒的優點是在酸性環境中,如溶酶體環境中,隻發出一次熒光,因此從微粒結合的細胞表麵去除背景信號。此外還使用了細胞鬆弛素- d治療的進一步控製,它抑製肌動蛋白聚合,從而防止吞噬所需的細胞結構的變化。與WT相比,A7和C8 KD克隆在吞噬pHrodo的能力上沒有顯著差異大腸杆菌(圖8)。然而,TREM2 KO克隆G4和B5的吞噬能力明顯低於WT細胞,從細胞FACS分析的平均熒光信號可以看出(*p<0.05, **p<0.01,圖8b)。
圖8:trem2kd /KO對吞噬作用的影響。
一個。pHrodo green吞噬BV2的代表性FACS直方圖大腸杆菌顆粒作為吞噬作用的測量。細胞鬆弛素d (cytochalasin-D)治療作為陰性對照。
b。每種細胞類型的單個細胞的平均pHrodo熒光表示為WT值的百分比。6個個體實驗的數值表示為平均值±SEM (*ρ<0.05, **ρ<0.01;單因素方差分析與Dunnett多重比較檢驗)。
我們已經確定了TREM2基因KD和KO對小膠質細胞的影響。與WT細胞相比,小膠質細胞顯示該蛋白表達減少或不表達,sTREM2不分泌,TREM2與高爾基體的亞細胞共聚明顯減少或不存在。此外,TREM2 KD/KO細胞的絲線長度減少,絲線數量增加。進一步的分析顯示,在ATP或MCSF刺激下,皺褶的形成減少,Iba1的表達也隨之減少。這些影響不是由於β-actin蛋白或mRNA表達的減少,但不能通過添加WT sTREM2逆轉。KD A7和C8克隆的吞噬能力未見明顯缺陷大腸杆菌與WT相比,KO克隆G4和B5的吞噬能力顯著降低。小膠質細胞對微環境的變化反應強烈,激活後可以顯示其形狀、運動和吞噬特性的巨大變化。膜皺折和絲狀偽足在這些過程中很重要[10- 12]。這種細胞反應是肌動蛋白細胞骨架[13]和Rho家族GTPases (Cdc42、Rac和Rho)動態重構的結果,已知它們是組織肌動蛋白細胞骨架[14]重構的分子開關。特別是Rac,已被證明參與了小膠質細胞[9]的膜皺折,在伴有TREM2雜合子和純合子敲低的BV2細胞中Rac信號傳遞能力的缺陷可以解釋這裏發現的膜皺折和吞噬作用的結果。Actin信號被認為是TREM2激活[15]的下遊。沒有發現肌動蛋白表達本身減少,因此排除了肌動蛋白表達差異是導致富肌動蛋白絲狀足形成中發現的變化的原因。F-actin已被證明與Iba1在膜皺褶中共同定位,Iba1對皺褶的形成和[9]吞噬作用很重要[13,16]。我們發現在KO和KD克隆中Iba1的mRNA和蛋白都明顯減少。在B5 KO克隆中觀察到最極端的膜皺褶缺陷,但試圖通過添加含有sTREM2的WT細胞上清來挽救這一缺陷並不有效,這表明質膜運輸受體是細胞內細胞骨架信號接合所必需的。細胞吞噬大腸杆菌能力的缺陷與之前的報道一致,表明TREM2在吞噬作用中發揮作用[17,18]。 It will be important to determine whether phagocytosis of other particles such as apoptotic cells is also affected since activation of TREM2 results in phagocytosis of apoptotic neuronal debris [19]. We have recently shown that phagocytosis and migration are impaired in human induced pluripotent stem cell derived microglia expressing Nasu-Hakola variant of TREM2, indicating that cytoskeletal reorganisation is thus abnormal in NasuHakola microglia [20]; human cases of Nasu-Hakola show cytoskeletal changes [21]. Furthermore in mice lacking TREM2, and in humans with heterozygous TREM2 mutations, microglia express a reduced ability to envelop amyloid deposits as TREM2, which is normally enriched on microglial processes, is lacking or dysfunctional, again supporting our findings of process changes and cytoskeletal dysfunction linked with TREM2 mutations [22]. The processes of phagocytosis, namely engulfment, internalisation and degradation of particles, rely entirely upon the ability of the actin cytoskeleton to modify the structure of the plasma membrane [10]. Filopodia are implicated in the early steps of engulfment by dragging particles towards the cell and can extend 10 μm from the cell [23]. The particle engulfment then occurs within the phagocytic cup is mediated by Rac and Cdc42. The shortened filopodial lengths observed here for the KD/KO clones are therefore likely be linked with the reduced phagocytosis as the microglia are less able to identify, bind to and pull particles towards the cell body for effective phagocytosis. Since baseline surveillance mechanisms in microglia have been shown to be modulated by ambient ATP levels, TREM2 variants may show an alteration in their ability to respond to ATP. One reason for the differences in process formation may be the lack of ATP or of a reduction in ATP receptors as this has been shown to lead to shorter, slower finger-like processes. The gene edits in the KD and KO cell lines may be predicted to result in heterozygous and homozygous loss of function of the receptor, which aims to replicate the heterozygous mutations implicated in Alzheimer’s disease and the more severe homozygous loss of function mutations that cause Nasu-Hakola disease. Interestingly despite the detection of TREM2 by Western blot following deglycosylation, WT BV2 showed low surface expression of TREM2 but Golgi localised TREM2 by immunocytochemistry. Similar findings for other microglial lines have been reported with strong staining in the Golgi complex [24,25]. Taken together these data provide evidence of how TREM2 mutations may manifest to promote dysfunctional microglia in heterozygous disease (such as occurs in late-onset Alzheimer’s disease) and homozygous disease (such as Nasu-Hakola disease), both of which lead to dementia.
BV2小膠質細胞培養
所有組織培養液均為最高組織培養等級,內毒素規格較低,除非另有說明,否則均由Life Technologies公司提供。用PCR常規檢測細胞支原體感染。除非另有說明,所有化學品和試劑均來自英國西格瑪化學公司。本論文所有研究均使用小鼠BV2小膠質細胞係(BV2)[23]。母係BV2從Banca bioe Cell工廠(Genova, Italy)獲得,常規鍍於羅斯威爾公園紀念研究所(RPMI) 1640培養基中,加入10% (v/v)熱滅活胎牛血清(FBS)和100 U/ml青黴素,100µg /ml鏈黴素,37℃,5% CO2.細胞保持低傳代數,傳代數為20後丟棄。
代TREM2+/-和TREM2-/-通過CRISPR/ cas9n介導的基因組編輯BV2細胞係
利用CRISPR/cas9n基因編輯技術從小鼠BV2小膠質細胞係中生成TREM2敲除係。用靶向TREM2基因第二外顯子的CRISPR/Cas9n nickase質粒轉染BV2細胞(SC-429903-NIC;Santa Cruz Biotechnology Inc.)使用NucleofectorTMSFKit 4 dnucleofectorTM(龍沙)根據製造商的建議。轉染48小時後,使用熒光激活細胞分選器對GFP陽性克隆進行篩選和單細胞分選。然後用RPMI完全培養基培養和擴增單細胞克隆2周,然後通過PCR擴增和Sanger測序(Source Bioscience)篩選TREM2基因修飾。PCR擴增用於測序分析,反應體積為25 μl。PCR混合物由以下組成:前後引物各5 μl × 1 μM (Fw-sT2;ACCCAAGGACCAGAACTTATC Rv-sT2;tcccatccgcttcttcag) 12.5 μl 2 × KAPA HiFi HotStart Ready Mix (KAPA Biosystems, Cat # KK2601)和2.5 μl gDNA (~12.5 ng)。PCR在Mastercycler台式熱循環儀(Eppendorf,德國)中進行。循環條件如下:95ºC 3分鍾,然後35個循環(95ºC 30秒,62ºC 30秒,72°C 30秒),72°C 5分鍾。 No full Knock-Out (KO, TREM2-/-) clones were obtained in the first round of CRISPR/ Cas9n modification. We obtained 6 cell clones with partial TREM2 KO (TREM2+/-1 allele KO and 1 WT allele); of those we selected two for further experimentation; clones BV2-A7 (4bp deletion) and BV2-C8 (34bp deletion). Confirmation of heterozygous mutations was done by single colony Sanger sequencing of PCR products. A second round of CRISPR/Cas9n modification was carried out using the previously modified clone BV2-C8. The second round of CRISPR/ Cas9n modification was performed as described for the lines above. Selection of clones was done by PCR amplification, enzyme restriction and Sanger sequencing. After selection, we obtained 3 clones with homozygous 23 bp deletions in TREM2, rendering these clones complete TREM2 KO (TREM2-/-). We only selected two for further experimentation; clones BV2-B5 and BV2-G4.
從cDNA中PCR擴增TREM2基因2 ~ 5外顯子並測序
cDNA由研究的5個細胞係的總RNA(0.5µg)合成,使用高容量RNA-to-cDNA™Kit (Life Technologies, Cat# 4387406),按照製造商推薦的總體積為20 μl。5個細胞係的cDNA產物在無核酸酶的水中以1:1000稀釋。隨後,從每個稀釋2μl擴大了使用設計引物PCR擴增外顯子2到5鼠標TREM2基因的900個基點(擴增子大小同種型1和/或同種型2 845個基點)。放大反應了在一卷50μl,含有2×KAPA HiFi HotStart準備,0.3μM的底漆(Ex2_5正向引物:5 - CTGTCCCAAGCCCTCAAC-3和Ex2_5反向引物:5 ' - ACAACCATCCAGCTGTCTTC-3 '),和2μl 1:1000 cDNA稀釋。使用來自每個細胞係的基因組DNA (50 ng)作為擴增的陰性對照進行了類似的反應。PCR循環條件如下;初始變性在95°C 3分鍾,然後30個循環,98°C變性20秒,65ºC退火15秒,72ºC延伸30秒;最後在72°C下延伸1分鍾。隨後在1.5%瓊脂糖凝膠上觀察PCR,以驗證擴增子的大小。最後,用QIA快速PCR純化試劑盒(Qiagen, Cat# 28104)純化PCR產物,然後進行商業測序(Source Bioscience, Nottingham, UK)。使用SnapGene軟件(GSL Biotech,版本3.3.3)進行序列比對和分析。
定量聚合酶鏈式反應(qPCR)評估mRNA表達水平
為了進行mRNA表達水平的qPCR分析,在處理或收集樣本之前,將BV2細胞培養24小時,並使用QIAzol緩衝液(QIAGEN, Hilden, Germany)進行裂解和均質。使用miRNeasy迷你試劑盒(QIAGEN)提取總RNA,並附加一個柱上dna酶消化步驟,使用RNase-free dna酶集。提取的總RNA濃度用納米滴分光光度計測定。根據製造商的說明,使用高容量RNA- cdna試劑盒(賽默飛世爾科學公司)生成相當於500ng RNA的樣本量的互補dna。定量PCR采用Stratagene Mx3000p qPCR係統中的TaqMan Universal Mastermix II (Thermo Fisher Scientific)和MxPro qPCR軟件進行。表達探針來自賽默飛世爾科技,表達歸一化為gapdh。
TREM2蛋白印跡表達
Western blotting使用標準技術進行。細胞以8 × 10的密度被鍍46個井板/井。將細胞溶解在冰冷裂解緩衝液中(1% NP-40, 150 mM NaCl, 50 mM TrisHCl (pH 7.2) + Halt蛋白酶和磷酸酶抑製劑),用SDS-PAGE (4-20% BIO-RAD mini-PROTEAN TGX預製凝膠)分離可溶性蛋白(35 μg/孔)。蛋白轉移到硝化纖維素膜上,與一抗(最終濃度:1:50 00羊多克隆抗trem2,研發係統#AF1729;1:10 0000小鼠抗-β-actin單克隆抗體,Sigma #A5441, 1:1000兔抗- iba1, Wako #019-19741),然後分別用適當的熒光偶聯二抗體(1:6 0000驢抗-羊Alexa Fluor 790偶聯物,Jackson免疫研究#713-655-147;1:150山羊抗小鼠Alexa Fluor 680共軛,Life Technologies #A21058;1:15000山羊抗兔Alexa Fluor 790共軛,生命技術#A11369)。使用奧德賽紅外成像係統(奧德賽V3.0軟件)對膜進行可視化,並使用ImageJ軟件對產生的條帶進行密度分析。處理條件重複3次,量化進行統計分析。為了準確定量高糖基化的TREM2蛋白,將等效體積的35µg蛋白用肽:n糖苷酶(PNGase,按廠家說明書)處理,誘導樣品去糖基化。然後製備樣品進行凝膠電泳。
BV2克隆體中TREM2的免疫定位
細胞被鍍在13毫米的玻璃蓋玻片上,每個蓋玻片的密度為5000個細胞,在4%的多聚甲醛(PFA)中固定20分鍾,用50毫米氯化銨(NH4然後用0.2% Triton-X100在RT中滲透5分鍾,然後用適當的阻塞溶液在RT中洗滌並阻塞30分鍾,TREM2為5%正常驢血清,其餘為3%牛血清白蛋白。一抗製備在塊(最終濃度:10µg/ml羊抗trem2,研發係統#AF172;1:100兔抗golgin 97,細胞信號技術#13192;1:50小鼠抗calnexin, Santa Cruz Biotechnology, #sc23954;1:500兔抗iba1, Wako# 019-19741)與細胞在rt條件下孵育2小時。適當的熒光偶聯二抗與細胞在rt條件下孵育1小時。將覆蓋片安裝在含有4 ',6-二胺基苯基吲哚(DAPI)的Vectashield安裝介質的載片上,用於核染色,並在蔡司LSM710共聚焦顯微鏡上獲得圖像。golgin97染色用甲醇固定和滲透代替PFA和Triton-X100;細胞在-20℃的冰甲醇中固定並滲透20分鍾。衝洗覆蓋物,在BSA中阻塞,繼續PFA固定。
可溶性TREM2 (sTREM2)脫落的ELISA檢測
從密度為8 × 10的細胞中收集不同克隆的BV2細胞裂解液424孔板中的細胞/孔。將細胞培養上清液(SNs)短暫離心,使任何漂浮的細胞或碎片成粒,然後將細胞培養上清液倒入另一個小瓶並迅速冷凍。SNs隻解凍一次,以減少凍融變質。可溶性TREM2 (sTREM2)的定量使用內部生成的ELISA進行。MaxiSORP 96孔板在4℃下包覆1 μ g/ml大鼠抗人/小鼠TREM2單克隆抗體(R&D Systems;# MAB17291)。用0.1% PBS- t洗滌3次,在RT條件下用1% BSA在PBS中阻塞45分鍾,然後再用0.1% PBS- t洗滌3次。重組小鼠TREM2-Fc (R&D Systems;使用#1729-T2-050)製備標準曲線,以便測定樣品中strerem2的濃度。細胞培養上清液和TREM2標準品孵育2小時,在RT下,然後洗滌3次。 Then 0.2 µg/ml anti-mouse TREM2 biotinylated polyclonal antibody (R&D Systems; #BAF1729) was incubated on the plates for 2 h at RT, washed and then incubated with 0.1 µg/ml streptavidin-HRP for 45 min at RT. Following 3 washes with 0.1% PBS-T, a chromogenic substance (TMB, Invitrogen) was added to the plates. The reaction was terminated by the addition of 0.5M H2所以4在H2O和吸光度在450 nm (TecanGenios)讀取。
卵泡延伸、數量和膜的細胞骨骼分析
為了研究BV2小膠質細胞的形態表型,根據製造商的說明(Biotium),使用phalloidin CF568和標準方案[27]對F-actin進行phalloidin染色。細胞被放置在13mm的玻璃封麵上,每封麵密度為5000個細胞。治療後小鼠巨噬細胞集落刺激因子(MCSF 100 ng / ml)或三磷酸腺苷(ATP, 50μM)血清中免費RPMI 5分鍾,細胞被洗的PBS和固定的4% PFA在PBS 20分鍾。細胞permeabilised Triton-X100 0.5% (PBS)組成RT 10分鍾,洗和孵化1稀釋的熒光phalloidin RT在黑暗中20分鍾。蓋玻片是安裝在幻燈片Vectashield安裝介質+ DAPI複染色。圖像采集在蔡司LSM710共聚焦顯微鏡上,使用蔡司Zen顯微鏡軟件。使用ImageJ軟件(1.50版本)進行細胞骨架分析。為了分析絲狀偽足形成,對樣品(3個獨立實驗,每個樣品40-50個細胞)進行了盲法測量絲狀偽足長度和每個細胞絲狀偽足數量的定量。樣本(5個獨立實驗,每個樣本40-50個細胞)對膜褶皺形成進行盲法形態學評分:無褶皺,0,褶皺反應1。膜皺折被定義為細胞延伸邊緣的f -肌動蛋白染色的波狀區域。免疫組化證實皺褶區域具有文獻[9]中報道的F-actin和Iba1共定位。
吞噬作用分析
細胞以1 × 10的密度被鍍5在測定前24孔板中每孔24小時。作為陰性對照,細胞與10µM細胞鬆弛素- d預孵育30分鍾,這是一種有效的肌動蛋白聚合抑製劑,對吞噬顆粒所需的細胞結構變化至關重要。細胞用50µg pHrodo green孵育大腸杆菌粒子(Life Technologies)在37℃下洗滌30分鍾,在PBS中漂洗,在冰冷的FACS緩衝液(0.5% BSA, 0.05%疊氮化鈉和2 mM EDTA在不含氯化鈣的PBS中洗滌兩次2或MgCl2).用BD FACS Calibur流式細胞儀分析細胞,並用流動軟件(Turku Centre for Biotechnology, flowingsoftware.btk.fi)分析結果。計算每個樣品的平均熒光強度。
統計分析
使用Prism軟件(Version 7, Graph Pad)分析結果。除非另有說明,采用Dunnet校正的單因素方差分析進行多次比較。
a . Phillips得到了來自Complement UK/Alexion的博士生J.M. Pocock、J Hardy和S Lovestone的資助。C Villegas-Llerena得到了來自秘魯政府的學生的資助,T M Piers得到了J M Pocock和J Hardy的資助,資助資金來自創新藥物計劃2聯合項目,資助協議編號115976。這一聯合項目得到了歐盟“地平線2020”研究和創新計劃以及EFPIA的支持。K Cosker由衛材:UCL治療創新集團(TIG)資助JM Pocock和J Hardy。我們感謝Dimitra Schiza博士對共焦成像的協助。
JM Pocock構思了最初的項目,研究由A. Phillips和C Villegas Llerena進行,TM Piers協助進行了Western blot和ELISA檢測sTREM2, K Cosker進行了皺紋分析,JM Pocock在所有作者的輸入下撰寫了論文。所有作者都閱讀、評論並批準了最終稿。
作者聲明沒有競爭利益。
- 倫理批準和參與同意:不適用
- 發表同意書:不適用
數據和材料的可用性:本研究期間產生或分析的所有數據都包含在這篇發表的文章中。
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文章類型:研究文章
引用:Phillips AEM, Llerena CV, Piers TM, Cosker K, Hardy J等。(2018)TREM2功能喪失導致小膠質細胞細胞骨骼功能障礙。神經生物學雜誌4(3):dx.doi.org/10.16966/2379-7150.152
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