摘要

細胞內含水量增加被定義為細胞毒性腦組織水腫，是外傷性腦損傷(TBI)和腦卒中的嚴重繼發性臨床並發症，其病因尚不清楚。最近提出了一種神經組織水腫的假說，認為外部動力和內部機械靜態的衝擊力引起的蛋白質折疊導致腦組織含水量增加。計算機模擬試驗證實了這一假設。在本實驗室研究中，我們進一步利用成熟蛋白層粘連蛋白LN521對動態和靜態衝擊力的影響進行了評估。層粘連蛋白被選為代表性的蛋白質，因為它在細胞中普遍和豐富的存在。然後用變性電泳和電鏡分析處理後的層粘連蛋白溶液，顯示層粘連蛋白結構的聚集和破碎。目前的結果首次證實了早期的假設和計算機模擬，即事故中的動態衝擊力和中風中機械靜態力的增加會使成熟蛋白質展開，這些蛋白質具有增加細胞內含水量的潛力，被定義為細胞毒性腦組織水腫。這種臨床情況類似於包括大白鯊在內的彈性鰓目動物在深海中防止細胞承受過高的靜水壓力時的現象。因此，目前的實驗室研究結果和海洋物理的知識可以考慮改善TBI和腦卒中患者的臨床治療和預後。

關鍵字

創傷性腦損傷;中風;細胞毒性腦組織水腫;蛋白質;成年腦損傷

簡介

隨著世界範圍內的人口對包括曲棍球、足球和拳擊在內的各種休閑活動表現出越來越大的興趣，包括創傷和中風在內的傷害的數量在未來十年將是可觀的。創傷性腦損傷(TBI)和中風最嚴重的繼發性臨床並發症之一是細胞毒性腦組織水腫(圖1)，定義為在灰質和白質[1]中發現的神經元、膠質細胞和內皮細胞的細胞內腫脹。細胞毒性腦組織水腫的概念似乎比預期的更為複雜，盡管在一定程度上已提出其病理生理機製[2]。它通常被認為是細胞外和細胞內間室之間的細胞代謝障礙，主要是由於細胞內含水量增加[3]。隨著細胞內含水量的增加，腦組織麵臨不可接受的高顱內壓，導致局部腦血流減少，供氧減少，神經組織緊張水平增加，從而進一步危害大腦代謝。細胞毒性腦組織水腫的問題，尤其體現在最嚴重的情況下，采用神經外科減壓開顱治療，目的是降低顱內壓，緩解導致預後不良的繼發性並發症。對細胞毒性腦組織水腫的病因最近提出了一種新的假說。該假說規定，頭部受到的動態衝擊力和中風後的內部機械靜力會導致蛋白質中非共價鍵和共價鍵的破壞，計算機模擬研究證實了這一點[4-6]。未折疊的蛋白質吸引水分子，導致細胞毒性腦組織水腫，應變水平和顱內壓都增加。此外，核苷酸如三磷酸腺苷的破壞會導致離子止血功能障礙。 Thus, both the increased intracellular water content and nucleotide disruption may tentatively explain the etiology to the cytotoxic brain tissue edema. All proteins influenced by the impact may participate in the edema formation. Thus, a generally existing protein such as laminin was chosen for the present study. The laminins are glycoproteins of 400- 900 kDa and found as a major component of basal lamina in most cells of the human body including brain tissue. The main function of laminin is gluing the cells to each other [7]. Lack of laminin will change the anatomy of cells causing further dysfunction of the cellular metabolism. In marine physics it has been shown that elasmobranchs including white sharks unfold protein structures to compensate for the increased hydrostatic pressure coming from outside when diving into the deep sea and thus interfering with the intracellular compartments [8]. The unfolding of protein structures increases the intracellular water amount by the hydrostatic pressure. By studying the cytotoxic brain tissue edema following TBI and stroke, better insight toward the etiology and, hence, its treatment should tentatively be supported by studying the protein metabolism in white sharks and other elasmobranchs in the ocean. If the earlier hypothesis and computer simulation is true, disruption, aggregation and fragmentation of the protein laminin LG521 should be obvious with the present laboratory investigation. The aims of the two laboratory experiments following both dynamic impact force and mechanical static pressure force were to analyze the presence of protein unfolding in a total amount of sixteen samples of laminin LN521 evaluated with denaturing electrophoresis and electron microscopy (EM), respectively.

圖1:腦卒中後左半球細胞毒性腦水腫的計算機斷層攝影。

材料和方法

動態的衝擊力

基底金屬板包括位於中心位置的0.2 ml體積空間，填充等量的層粘連蛋白LN521溶液(BioLamina AB)。另一塊金屬板被固定在基底金屬板的頂部。然後將雙金屬套固定在底板上(圖2a)，並使用頭盔跌落試驗台(圖2b)[9]受到Hybrid III頭型的衝擊。假人頭的下落高度設置為57厘米，撞擊速度為3.1米/秒或11.2公裏/小時。假頭形式被引導通過跌落和衝擊前釋放，以獲得一個控製接觸點指向中心位置的金屬設置，包括層粘連溶液。該假頭配備了一個係統的九個加速度計[10]安裝在假頭形式內部。其中三個加速度計被用來測量所有軸的平移加速度。然後使用25000 Hz CFC 1000濾波器對加速度數據進行濾波。總共有8個假頭撞擊對金屬組內的8個層粘連蛋白溶液進行了撞擊。作為對照，兩種層粘連蛋白溶液被放置在金屬裝置中，但在分析之前沒有進行動態衝擊力測試。 After each impact the metal set was opened to collect the laminin solutions for further analysis with denatured electrophoresis and EM, respectively. In the meantime, the impact results from the test rig were analyzed.

圖2:假頭在(a)和(b)對白色金屬組(包括位於中心位置的層粘連溶液)的衝擊之前和之後。

靜態的衝擊力

在第二個實驗中，使用相同的金屬板，填充0.2 ml的蛋白層粘連蛋白LG521溶液，然後集成壓力傳感器分析輸出電壓，並轉移到mmHg[11]。0伏= 0 mmHg作為對照，1伏=15 mmHg, 2伏=30 mmHg, 3伏=45 mmHg和4伏=65 mmHg，分別持續15分鍾。每個伏特實驗包括兩個解決方案，因此兩個控製和八個解決方案與靜壓力。在暴露於各種電壓後，所有10個樣品被收集並進一步用變性電泳和EM進行分析。

變性電泳

用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對樣品進行分析。在變性電泳中，處理過的和未處理的層粘連蛋白樣品都與含有十二烷基硫酸鈉(SDS)的5倍負載緩衝液混合，在65°C加熱10分鍾，然後加載到4-20%的tris -甘氨酸凝膠(賽默飛世爾科學公司)[12]上。然後通過施加150 V開始電泳，一直運行到藍色前端到達凝膠[13]的末端。用silver quest silver進行銀染色，觀察凝膠中的條帶^TM染色試劑盒(賽默飛世爾科學公司)。

電子顯微鏡(EM)

將衝擊試樣的1-3µl等份放置於發光放電的碳包覆銅柵極上，用2% (w/v)醋酸鈾酯印跡30 s[14,15]。用日本JEOL JEM-2100f型透射電子顯微鏡(JEOL, Japan)在200kv電壓下對柵極進行了檢測。使用TVIPS TemCam-F415 4k × 4k ccd相機(Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gauting, Germany)采集圖像，標稱放大倍率為80,000。

結果

動態的衝擊力

平移加速度:8種衝擊對層粘連蛋白樣品的合成平移加速度在473,7和535,5 g之間，在0.004秒的動態衝擊中，平均加速度為519,8 g。正如預期的那樣，所有動態衝擊的峰值之後的振蕩是加速度計底座振動的結果(圖3)。

圖3:8個假人頭對層粘連蛋白溶液的平移加速度(左)和8個層粘連蛋白樣品測試加速度的結果(右)。

電泳:采用變性PAGE法分析力處理對層粘連蛋白的影響。用兩親性去汙劑SDS對層粘連蛋白進行變性。SDS的烴尾與層粘連蛋白結合，暴露出隱藏的疏水區域。SDS的硫酸鹽端會破壞層粘連蛋白折疊的三級結構。樣品與含有SDS的負載緩衝液混合並加熱後，層粘連蛋白破碎成亞基。PAGE就像一個分子篩，小的亞基比大的亞基遷移得更快。8個力處理的樣品，其中4個層粘連蛋白的結果顯示在Lane 2-5中，與沒有力處理的對照樣品有很大的不同，如Lane 1(圖4)。在所有動態力處理的樣品(Lane 2-5)中都觀察到層粘連蛋白的破碎。動態力處理的層粘連蛋白(Lane 2-5)的大部分碎片亞基約為45 kDa(圖4為*)，可能是層粘連蛋白β 2亞基片段，包含alpha結構域(約為3 kDa)和38.5 kDa結構域I。另一個主帶約為66 kDa(圖4為¤)，可能是層粘連蛋白γ 1亞基的II和I結構域，計算分子量為65 kDa。

圖4:變性PAGE分析顯示動態衝擊力導致層粘連蛋白碎裂。Lane 1為未受衝擊前的層粘連蛋白對照樣品，Lane 2 ~ 5為衝擊力處理後的層粘連蛋白樣品。

在含有對照樣品的Lane 1中沒有看到碎片。這表明力處理引起了層粘連蛋白的碎裂。對比在變性凝膠中進行動態力處理和未進行動態力處理的樣品之間的條帶圖(圖4)，可以看出力處理對蛋白質破碎的影響，這可能改變層粘連蛋白周圍的水分子排列，導致聚集。

電子顯微鏡(EM):層粘連蛋白由於其分子尺寸大，在電子陰性染色顯微鏡下很容易被發現。未處理的對照蛋白顯示為附著的球狀區域的長螺紋(圖5a)，描述了層粘連蛋白結構中的臂狀結構和球狀結構域。在對照和力處理的樣品中，偶見層粘連蛋白自組裝成單一的近似六邊形結構。與對照組相比，力處理增加了蛋白質的聚集(圖5b)。同時，部分層粘連蛋白仍呈線性排列。

圖5:陰性染色對照(a)和強力處理標本(b)的電子顯微圖顯示強烈的蛋白質聚集。比例尺為50納米。

靜態的衝擊力

電泳:采用Denaturing PAGE分析靜壓力對8個層粘連蛋白樣品(圖6)的影響。對比5巷對照樣品與1 ~ 4巷靜壓力樣品，分別用1 ~ 4伏處理15分鍾，顯然，增加靜壓力處理產生了新的碎片，最突出的條帶可見於Lane 3和Lane 4，並記為¤(圖6)。然而，與動態衝擊後的結果相比，新的碎片不太明顯。如B節所述，隻有還原劑才能破壞二硫鍵在體外在SDS - PAGE變性和不加還原劑的情況下運行凝膠可以保持二硫鍵。將以往的變性PAGE動態衝擊力試驗結果與靜壓力試驗結果進行比較，可以有把握地得出結論，試驗樣品中看到的新碎片是由於施加靜壓力導致層粘連蛋白中的二硫鍵斷裂而形成的。由於二硫鍵導致的SDS - PAGE碎片化總是與蛋白質聚集[16]有關，這在動態衝擊力之後的第B&C節中可以清楚地看到。

圖6:變性PAGE分析顯示，在1 ~ 4伏分別處理15分鍾後，層粘連蛋白在Lane 1-4處因靜壓力而碎裂，並與對照樣品在Lane 5處進行比較。

電子顯微鏡(EM):使用機械靜壓力也通常增加了層粘連蛋白的聚集(圖7)，用EM進行評估。在測試的最低靜壓力時，1伏轉換為15毫米汞柱，與未處理的對照標本相比沒有觀察到主要差異(圖7a)，而使用2伏轉換為30毫米汞柱的壓力時，蛋白質聚集略有增加(圖7b)。最明顯的影響是檢測到較高的靜壓衝擊力，3伏轉換為45 mmHg和4伏轉換為65 mmHg，可以看到大量的蛋白質聚集(圖7c)。

圖7:靜壓力對層粘連蛋白的影響以陰性染色em為例。a)無靜衝擊力對照試樣和受靜衝擊力b) 2伏和c) 4伏試樣。比例尺50納米。

討論

選擇層粘連蛋白是因為它在人體中廣泛存在，應該被視為蛋白質結構的代表，當涉及到評估分子結合之後的影響。我們的結果首次表明，在3.1米/秒或11.2公裏/小時的動態衝擊力和30毫米汞柱及以上的機械靜壓力下，蛋白質結構被展開，並通過變性電泳和EM評價為聚集和破碎。這一結果將對解釋TBI和卒中在臨床治療細胞毒性腦組織水腫引起的應變和顱內壓增加的後果具有重要影響。因此，在開發臨床神經外科新藥時，應考慮白鯊的代謝作用。如果蛋白質代謝在如此低的速度下受到動態衝擊力的負麵影響，並分別受到這裏所示的低機械靜壓力的負麵影響，似乎很自然地建議代謝應該受到更大的動態和靜態力的危害。最近有研究表明，足球運動員的死後分析顯示了慢性創傷性腦病[17]的證據。此外，在臨床神經科學中，腦外傷和中風後顱內壓升高約30毫米汞柱及以上可能導致不可接受的腦腫脹。神經外科治療的最終選擇是減壓開顱術，目的是降低顱內壓。雖然這種神經外科治療減少了死亡人數，但殘疾患者的人數卻增加了[18]。因此，無論是對頭部和神經組織的動態和靜態力，都需要更好地了解其後果，以改進臨床治療。

蛋白質結構的穩定性受到吸引力和排斥力的影響，包括非共價鍵和共價鍵在折疊態、中間態和展開態之間切換時的平衡[19,20]。由於動態力和靜態力的幹擾，其正常環境可能導致不穩定，從而有利於蛋白質的展開。對頭部的衝擊可能導致蛋白質結構從折疊轉向折疊，水分子積累增加，覆蓋部分折疊和疏水結構[21]。細胞中的水可以被看作是負責細胞代謝活動的主要部分之一[22]。細胞內水的結構和氫鍵對蛋白質代謝尤其重要，因為它可能在蛋白質變化後對細胞內體積有廣泛的輸入。然而，神經組織中不受控製的積水可能會造成毀滅性的後果。

人們似乎很自然地認為，包括撞擊位置及其附近的層粘連蛋白在內的蛋白質結構被破壞，導致細胞之間的分裂，不僅失去了彼此之間的緊密連接，也失去了細胞代謝。同時，由於事故發生時的動態衝擊力，以及隨後增加的應變水平和機械靜壓力，被折疊的蛋白質結構會吸引水分子進入被破壞的蛋白質內部和周圍。其結果是細胞內結構域的水積累增加，可能導致被定義為細胞毒性腦組織水腫。當應變水平足夠高時，神經組織中的應變水平和顱內壓的增加與患者的臨床惡化一起用神經影像學分析來定義。目前的結果清楚地表明，即使在3.1米/秒或11.2公裏/小時的低衝擊下，在幾毫秒內約500克的平動加速度也有能力將層粘連結構展開為聚集和碎片結構。這種動態衝擊力是在輕微到中度的頭部事故之後所能預期的。當這種輕微到中等程度的撞擊有能力展開層粘連蛋白時，這種蛋白質結構的紊亂可能在某種程度上解釋了曲棍球、足球和拳擊運動中頭部受傷患者的並發症。輕度和中度的影響不一定會導致細胞毒性水腫，而隻會導致蛋白質的聚集和碎裂(圖8)。

圖8:圖示蛋白質展開後水分子的初步積累和充血，導致細胞毒性細胞內水腫。這種情況在經過準確的臨床治療後，部分蛋白質結構可恢複正常，部分未展開的蛋白質結構可永久聚集和破碎。

施加較低的機械靜壓力打破蛋白質外層的氫鍵，而需要較高的力展開位於更中央的結構域[19]。因此，推測蛋白質展開、聚集和碎裂的速度越快，其結果就越強烈，這是嚐試性的。我們早期的研究表明，在12 - 30米/秒或43.2 - 108公裏/小時的動態衝擊力下，吸收的能量分別按比例增加到不同的顱骨和腦組織組織。在這裏，非共價鍵和共價鍵的破裂與計算機模擬評估的應變和顱內壓水平的增加有關[5,6]。因此，在不同的休閑活動中，蛋白質折疊與細胞內水積累的潛在增加不僅是由動態衝擊力引起的，而且在中、重度TBI中也是如此。同樣，由於機械靜壓力的增加，中風後神經組織的應變水平增加，這也可能是對其次級後果級聯的幾個合理解釋之一(圖8)。例如，聚集和碎片化的蛋白質結構可能導致各種認知缺陷。重要的是，在目前的研究中，蛋白質的展開已經顯示在30毫米汞柱。這與患者神經係統狀況開始惡化時的顱內壓水平大致相同。對於在較高的實驗壓力下所呈現的蛋白質的展開，有可能蛋白質的展開在某種程度上可能與壓力的強度成正比，因此類似於靜水壓力，而靜水壓力與海中的深度成正比。細胞毒性腦組織水腫由動力衝擊力或機械靜壓力引起，缺血代謝減少合成代謝環境，而分解代謝環境增加。 Although unfolded proteins may regain their functional status to some extent as folded ones, some of the altered proteins may continue as aggregated and fragmented structures (Figure 8). When such forces influence the head in a repetitive way often seen in leisure activities, it may be speculated that such repetitive injuries interfere with the normal protein metabolism and to some extent explain what happens to the human nervous tissue [24].

有趣的是，在下麵的示意圖中，將白鯊增加的靜水壓力與患TBI和中風的人增加的動、靜壓力進行比較，以發現兩者之間的相似性(圖9)。

圖9:白鯊靜水壓力增加引起的細胞水壓力示意圖，以及人類腦外傷和中風後動態和靜態衝擊力增加引起的細胞水壓力示意圖。雖然大白鯊用尿素和氧化三甲胺來平衡水的積累，以避免水的壓力，但人類缺乏處理細胞含水量增加的能力。

當大白鯊潛入深海時，細胞受到外部靜水壓力增加的影響，細胞內體積減小(圖9A)。為了防止有害的水脅迫條件，大白鯊利用尿素破壞氫鍵，從而展開蛋白質，以平衡增加的靜水壓力(圖9B)。當尿素引起的水分積累增加恢複了正常的細胞內水環境時，TMAO被激活重建蛋白質。平衡細胞中水分積累的需求，避免了水脅迫的情況(圖9C)。

有人認為，當動態衝擊力和機械靜壓力分別導致TBI和中風時，神經組織會產生細胞應激，定義為細胞內體積增加，導致細胞毒性腦組織水腫(圖9D)。早期的神經外科治療細胞毒性腦組織水腫使用尿素。然而，這種物質不再是藥物的選擇，因為它被認為有反彈作用，可能是由於它在受幹擾的血腦屏障區域的滲透作用。事實上，尿素增加了水腫(圖9E)。尿素對臨床的負麵作用更現實的解釋是其對蛋白質的展開作用[19-22]。雖然尿素作用的確切機製還不完全清楚，但很明顯，它破壞了非共價相互作用，從而使折疊的蛋白質變性為更展開的結構。但是，如果在人腦的臨床治療中能夠找到有機的解決方案，考慮白鯊的代謝，則可能避免細胞毒性腦組織水腫(圖9F)。

結論

眾所周知，機械力在人體生理中普遍存在，在蛋白質結構[25]的正常生理中具有重要意義。先進的計算機模擬技術和實驗室結果的結合，可能會對生物機製提供更可靠的原子層麵的洞察，並將進一步增加生物力學知識。這些研究結果在臨床神經科學中具有重要價值。在這裏，當涉及到防止神經組織含水量增加時，大白鯊體內的尿素和氧化三甲胺代謝可以初步指示尋找TBI和中風的相關臨床治療方法。因此，如果蛋白質的展開和水的積累是細胞毒性腦組織水腫病因的答案，那麼從個體角度製定最佳治療方案應該更容易，這可能會預防TBI和中風後最嚴重的殘疾患者。

作者的貢獻

漢斯·馮·霍爾斯特提出了假說，設計了實驗並起草了手稿。HvH和DL負責動態和靜態實驗室測試。P.P.和H.H.用電子顯微鏡分析了結果。R.B.K.用電泳分析了結果。所有作者都對稿件進行了反饋和修改。

相互競爭的利益

作者聲明沒有競爭的經濟利益。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:von Holst H, Purhonen P, Lanner D, Kumar RB, Hebert H(2018)白鯊蛋白質代謝可能是改善創傷性腦損傷和中風後細胞毒性腦組織水腫和認知缺陷結局的模式。神經生物學雜誌4(2):dx.doi.org/10.16966/2379- 7150.151

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出版的曆史:

收到日期:09年9月,2018年

接受日期:2018年9月26日

發表日期:03年10月,2018年