摘要

目的:細胞凋亡和氧化應激被認為是許多神經退行性疾病進展和發病的關鍵因素。本研究旨在評估α -生育酚對綿羊腦組織氧化應激的改善作用。

方法:用10 μ M α -生育酚預處理綿羊大腦額葉腦片1h，再分別用2.5mM和5mM過氧化氫處理1h。測定對照和預處理樣品的總還原型穀胱甘肽和脂質過氧化水平。采用二苯基和瓊脂糖凝膠破碎法測定DNA損傷百分率。

結果:研究表明，α -生育酚能顯著增加還原型穀胱甘肽的水平，並降低腦組織中“脂質過氧化”的水平。DNA片段化實驗顯示，α -生育酚處理的樣本DNA片段化明顯減少，提示維生素E對過氧化氫誘導的神經元死亡具有抗凋亡作用。

結論:這些結果提示-生育酚對“過氧化氫誘導的氧化應激”具有神經保護作用。這項研究進一步強調了α -生育酚作為一種治療多種神經退行性疾病的潛在作用。

關鍵字

α-生育酚(在);氧化應激;大腦切片文化;神經保護;脂質過氧化作用

簡介

氧化應激(Oxidative stress, OS)是帕金森、阿爾茨海默病等多種神經退行性疾病的主要致病過程[1,2]。一般來說，生物組織需要氧氣來滿足身體的能量需求。然而，這種氧消耗也導致自由基的產生，具有破壞細胞的能力。由於活性氧(reactive oxygen species, ROS)的高度活性，它有強烈的傾向與生物分子相互作用，通過DNA片段化[3]引起凋亡，並損害抗氧化防禦係統[4]。

為了防止脂質過氧化過程，保護氧自由基免受這些自由基的不利影響，人體內存在“酶抗氧化防禦係統”。不同的化合物被列入非酶抗氧化劑的範疇，例如尿酸、類胡蘿卜素、抗壞血酸和α-生育酚。然而，酶防禦係統包括過氧化氫酶、“超氧化物歧化酶”(SOD)、“穀胱甘肽依賴性酶係統”和“穀胱甘肽過氧化物酶”(GPx)等酶。近年來，維生素E及其活性成分α -生育酚備受關注，被認為是治療多種神經退行性疾病的藥物[5-7]。維生素E在臨床上被認為是一種潛在的“自由基清除劑”，它可以阻止氧化應激的過程。此外，它還可以作為“斷鏈抗氧化劑”，阻止“自由基反應”的擴散[8,9]。

本研究旨在評估α -生育酚對新生羊大腦額葉短期腦切片培養的神經保護作用。結果發現，用維生素E預處理腦片培養1小時，再用過氧化氫(2.5mM和5mM)處理，可以顯著降低腦組織的“氧化應激”(oxidative stress, OS)。這反映在還原穀胱甘肽濃度的增加和脂質過氧化水平的降低。用維生素E預處理腦片培養物可以促進神經元存活和DNA完整性，正如“DNA片段化實驗”所證明的那樣。

材料和方法

化學物質

d - α-生育酚(α-TP)購自Al - Aesar (Cat。不。A17039)。將其溶解在二甲亞碸(DMSO)中，並使用100倍稀釋。所有使用的其他化學品都是從“Sigma-Aldrich Co.， St Louis, MO, USA”購買的。

大腦切片文化

新生羊的頭蓋骨從當地屠宰場新鮮獲得。在無菌條件下，用無菌鑷子和剪刀切開顱骨，取出腦膜。大腦額葉被切成1-2mm的小塊^3.並在無菌條件下稱重。將腦切片保存在模擬腦脊液成分的碳酸氫鹽緩衝溶液中，即俗稱的人工腦脊液(ACSF)，其中含有“12.4mM氯化鈉、2.5mM氯化鉀、1.3mM氯化鎂、2mM氯化鈣、1.25mM磷酸氫二鉀、26mM碳酸氫鈉”。pH調至7.4”。使用前加10mM無菌過濾葡萄糖(Sigma)。緩衝液用二氧化碳和氧氣(95% O₂, 5%的公司₂)，持續20至30分鍾，以確保氧飽和度(O₂)和二氧化碳(CO₂使用前)。

腦培養的治療

按照上述方法，每一種孵育類型，取約1gm的腦切片，在10ml ACSF溶液中，37°C慢搖水浴中孵育。以下是腦切片培養的不同孵育條件。腦片培養(BSC)按如下方法處理。

組1:BSC是在沒有任何處理的情況下培養的。

組2:BSC是與DMSO單獨孵化的。

第三組:BSC與維生素E單獨孵育。

第四組:BSC不加維生素E處理孵育1小時後，再加2.5mM H處理₂O₂．

組5:用10 μ M α - coperol預孵育BSC 1小時，然後用2.5mM H處理₂O₂再加一個小時。

第六組:BSC不加處理孵育1小時，再加5mM H處理₂O₂一小時。

第七組:BSC在10 μ M維生素E中孵育1小時，然後用5mM H處理₂O₂．

生化實驗用腦組織的製備

孵育後，從腦組織切片中取出條件培養基，保存以進行還原性穀胱甘肽測定。腦組織用無菌冷PBS清洗，然後用5ml冷無菌PBS勻漿。每次生化測定用約1ml腦勻漿。

DNA片段化和定量分析

采用Taylor[10]法評估“DNA片段化”程度。腦組織勻漿用等量的裂解緩衝液“5mM Tris/ HCl pH 8, 20mM EDTA, 0.5% triton X-100”裂解，裂解液離心分離染色質片段和完整的染色質。用“12.5%三氯乙酸”(TCA)濃度沉澱上清液和微球，然後用1ml 5% TCA, 90℃下處理10 min。此外，在室溫下過夜進行了二苯胺的定量分析。在600nm處對空白進行光密度測量。破碎率分析為“上清液中DNA與總DNA(上清液加顆粒)之比”。

DNA提取和電泳

H的影響₂O₂通過凝膠電泳的方法對DNA片段進行分析，如Lee等人所證明的[11]。組織勻漿在溶解緩衝液(10mM Tris-KCl pH 8.0, 10mM NaCl, 10mM EDTA, 100µg/ml蛋白酶K, 1% SDS)中重新懸浮。苯酚/氯仿按1:1,v/v的比例提取裂解液，乙醇沉澱DNA片段。在緩衝液中，DNA顆粒被測定為“10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0”。然後，將緩衝液裝載的DNA樣品引入1.8%的瓊脂糖凝膠中。然後，對DNA進行拍照，然後通過溴化乙錠進行可視化。

減少穀胱甘肽測定

本實驗采用Beutler等人[12]的方法進行。本實驗使用了約1ml的腦勻漿和1ml的條件培養基。然後，在組織勻漿和條件培養基中加入1.5 ml“雙蒸餾水”(DDW)，然後在0.6 ml含有“1.67 g冰偏磷酸，0.2 g EDTA和30.0 g NaCl”的沉澱化學物中保存，DDW最多為100 ml。將混合物以1200xg的速度放入離心機中離心10分鍾。取0.3 ml上清液，2 ml鈉₂HPO₄加入0.3 M、0.25 ml的5,5 '二硫代二-2-硝基苯甲酸(DNTB)和0.4%的1%檸檬酸鈉”，用DDW配製至3 ml。在空白412 nm處測定OD值，以每克組織中還原穀胱甘肽的µg表示。

脂質過氧化作用分析

“脂質過氧化”(LP)的計算采用Garcia等人[13]的方法，采用TBARS(硫巴比妥酸反應物質)測定法。取約1ml的大腦勻漿，置於37°C培養箱中培養1小時。加入20% TCA約1.5 ml, 600 xg離心10分鍾，1ml上清中加入新排列的“硫代巴比妥酸”(TBA) 0.67%，在沸水浴中加熱10分鍾。與空白試劑比較，在535nm處記錄吸光度。這些值以組織中丙二醛形成小時/克的mM表示。

統計分析

數值以均數±標準差表示，數據以數字、標準差(SD)、均數表示。各組間比較采用獨立樣本T-Test，使用Microsoft Excel程序2010進行兩組比較。以“概率值”(p值)<0.05為顯著。統計分析采用SPSS軟件(v22.0.0.0)。

結果

α -生育酚對H₂O₂誘導細胞毒性

采用二苯胺裂解法測定腦組織DNA片段，結果表明，經維生素E預處理後的腦組織在0.25mM和0.5mM H與維生素E共孵育後，DNA片段率顯著降低₂O₂(圖1)。與對照組相比，用維生素E預處理腦培養的DNA片段%降低到5%。當在α -生育酚存在和不存在的情況下用2.5mM過氧化氫處理培養物時，2.5mM處的DNA片段率降低到約4%。當預處理培養物與對照培養物比較時，5mM DNA碎裂率降低至12%。瓊脂糖凝膠電泳進一步支持了這項研究，從樣本中提取基因組DNA，然後用1.8%的瓊脂糖凝膠進行處理。這說明H處理後DNA出現了廣泛的片段化₂O₂(圖2);然而，維生素E的存在保護DNA不發生斷裂，如圖2所示。

圖1不同培養條件下DNA片段%直方圖:采用材料和方法部分所述的二苯胺分析方法計算DNA片段率。單獨用DMSO(載體)處理的腦組織DNA損傷，單獨用維生素E處理的腦培養，不加任何處理的對照腦培養。腦培養分別用10 μ M α生育酚單獨預處理和10 μ M α生育酚預處理，誘導2.5mM H的氧化應激₂O₂和5毫米₂O₂．

圖2:1.8%瓊脂糖凝膠電泳:從不同處理組的腦組織中分離基因組DNA，使用1.8%的瓊脂糖凝膠。溴化乙錠染色觀察DNA條帶並拍照。帶1是從第一組中分離出來的基因組DNA帶2是從第2組中分離出來的基因組DNA(隻含有α生育酚)，帶3基因組DNA是否從第5組(5mM H₂O₂單獨治療),4和5波段是否從第6組和第7組中分離出基因組DNA(用α生育酚預處理，然後2.5mM, 5mM H₂O₂分別)。

在所有這些實驗中，研究了單獨使用DMSO的效果，並將其用作處理的載體。根據本研究的實驗，單獨DMSO並不能減輕H誘導的氧化應激水平和DNA片段量₂O₂．研究了維生素E對過氧化氫誘導的氧化應激的神經保護作用對脂質過氧化水平的影響(表1)。脂質過氧化水平以每小時/克丙二醛形成量mM計算。

	TBARS (mM of Malondehyde forming / hour/gm (tissue)	還原穀胱甘肽(µg GSH/gm)
		條件培養基	組織
組1(控製)	7.526±0.64	2.32±0.09	1.73±0.06
第二組(有DMSO)	6.255±0.07	2.24±0.07	1.64±0.03
組3(α-生育酚)	3.782±0.08 *	2.66±0.01	1.865±0.02
第4組(2.5mM H2O2）	9.519±0.03	0.1595±0.07	0.449±0.06
第5組(2.5mM H2O2）+α-生育酚)	5.301±0.37 *	1.392±0.06 *	1.116±0.10 *
Group6 H(5毫米2O2）	10.183±0.05	0.2285±0.05	0.409±0.03
第7組(5mM H2O2）+α-生育酚)	4.375±0.09 *	0.6165±0.05 *	1.902±0.05 *

表1:研究氧化應激(降低GSH)和脂質過氧化水平對α -生育酚預處理、2.5mM H誘導氧化應激和不誘導氧化應激的影響₂O₂和5毫米₂O₂．取3次獨立實驗的平均值，計算±SD。(*)表示與單獨過氧化氫處理的培養物相比，在α -生育酚存在和預處理的過氧化氫誘導氧化應激的培養物的值有顯著差異(p小於0.05)。

與對照組相比，單獨使用維生素E的處理顯示出減少的脂質過氧化量。而脂質過氧化率隨每小時丙二醛形成量的變化，對照培養物與2.5mM和5mM過氧化氫處理培養物相比差異不顯著(p<0.05)。經維生素E預處理後再經H₂O₂與單獨過氧化氫處理培養物相比，在2.5mM和5mM濃度下。

本研究還研究了氧化應激的另一個標誌，即降低穀胱甘肽水平(GSH)。在條件培養基中以及細胞內測定還原型穀胱甘肽水平。經預處理並與維生素E和H共孵育的腦培養物中，還原性穀胱甘肽水平顯著增加₂O₂與H相比₂O₂單獨處理培養物(表1)。維生素E預處理後與2.5mM H共孵育的細胞內降低的GSH水平增加了8倍₂O₂與單獨2.5mM過氧化氫處理培養物相比。腦組織中還原性穀胱甘肽的水平也顯示，與第6組相比，用維生素E預處理的腦組織中還原性穀胱甘肽的水平增加了三倍₂O₂獨自一人)。在第6組(5mM H₂O₂處理組(0.25mM H₂O₂)，這可能是由於在OS增加的情況下，腦組織分泌更多的GSH到培養基中以對抗OS增加，從而耗盡細胞內的GSH。然而，在2.5mM和5mM的OS誘導下，經維生素E預處理的腦培養物中GSH水平顯著升高(p< 0.05)₂O₂．

討論

本研究采用短期腦片培養的方法來研究維生素e的治療潛力。在體外而且在活的有機體內“實驗模型”，因為這保持了具有完整功能的“局部突觸回路”的神經元活性，並允許通過能夠調節反應的藥物進行直接治療[14-16]。α -生育酚有能力穿過“血腦屏障”(BBB)，並通過“氧化應激”(OS)保護神經元細胞，這可以被認為是各種神經退行性疾病的主要促成因素，在許多研究[5]。

以前進行的大多數研究，都檢查了維生素E對維生素E與激動劑共孵育誘導的OS的影響。與此相反，這項研究檢驗了維生素E對神經保護的一種假設功能，因此在用H治療腦切片之前，大腦切片仍然與維生素E預孵育₂O₂誘導氧化應激。這是特別有趣的，因為維生素E的神經保護特性不僅主要歸因於其固有的抗氧化作用，而且可能通過其他細胞功能介導。該處理的濃度為10 μ M，其他處理的最佳濃度為10 μ M在體外研究[17]。

H₂O₂被認為是一種主要的活性氧，也被稱為ROS，在氧化還原反應過程中產生，作為信使[18]在“細胞內信號級聯”中起作用。這種化合物也被用作操作係統的啟動器在體外因為它會導致“線粒體膜功能障礙”、脂質過氧化和DNA結構[19]的巨大損傷。

此外，膳食抗氧化劑對預防“內源性活性氧”誘導的毒性作用也有重要意義，而許多研究斷言，維生素E對OS具有潛在的作用。此外，維生素E缺乏可能會增加os誘導的神經元毒性的易損性。許多研究都研究了維生素E的補充對降低DNA損傷和OS的作用[20-22]。維生素E由α -生育酚、β -生育酚、γ -生育酚和δ -生育酚異構體組成。然而，本研究選擇α -生育酚作為研究對象，α -生育酚是維生素e的異構體之一。α -生育酚由於其較高的生物利用度和生物活性，被普遍認為是一種強大的抗氧化劑。從結構上看，α -生育酚的氯酚環上有供電子的甲基，可以抑製脂質過氧化[23]。

就α -酚的“自由基清除特性”而言，目前的研究旨在評估維生素E在新生兒羊腦片培養中的神經保護潛力。本研究利用二苯胺法DNA片段測定法，從維生素E對神經元細胞活力的影響方麵探討了維生素E的神經保護潛力。在測量細胞凋亡時，“二苯胺測定法”被認為是確定寡體大小的片段中已知DNA片段量百分比的一個重要工具。另一個好處是，在實驗或治療之前，這種二苯胺分析是脫落細胞和貼壁細胞DNA片段的凋亡分析。該方法於20世紀30年代首次提出，但被其他研究人員大量修改[10,24]。通過加入乙醛和硫酸，以及允許在室溫下過夜進行“比色反應”，這些修改使易感性提高了近五倍。這種改變表明通過某些物質減少了界麵，這些物質最初被認為是最初標記方法的缺陷，這反過來提高了分析的靈敏度。同時，二苯胺的反應發生了，強調了脫氧核糖和嘌呤結合的好處，這是非常不穩定的。一旦化學鍵斷裂，整個DNA中的無機磷酸鹽就會釋放出來，釋放出底物產物，通過這個反應進行評估。瓊脂糖凝膠上的DNA片段分析進一步支持了這項研究，該研究清楚地顯示了來自維生素E處理的培養物的基因組DNA的完整性和穩定性，盡管它們用H誘導氧化應激₂O₂與暴露於H₂O₂一個人。

在這種“脂質過氧化”中，ROS的這種有害作用可以顯著地用於治療幾種急性和慢性腦部疾病[25,26]。最常見和流行的“脂質過氧化法”被認為是TBARS法，它涉及到測量脂質過氧化導致的最終產物的反應性，即MDA與TBA反應產生紅色加合物，可以用分光光度法定量。在這項研究中，發現“脂質過氧化”在維生素存在的條件下有所減少。在其他研究中，維生素E被認為是與脂質過氧化產生的過氧自由基發生反應的主要抗氧化劑。

因此，從目前的研究結果可以推測，在OH分子形成之前，氧分子和α-生育酚之間發生了反應。然而，細胞內氧的徹底破壞被認為是一個重要的神經保護作用機製，包括α -生育酚在大鼠紋狀體培養中。

α -生育酚通過抗氧化和非抗氧化途徑發揮神經保護作用在活的有機體內［9］．據觀察，過氧化氫處理可引起穀胱甘肽水平的耗盡和細胞內過氧化物酶的積累。然而，H的還原₂O₂維生素E預處理後的細胞毒性提示神經保護作用是通過細胞作用，其中可能包括調節穀胱甘肽代謝。

總之，本研究表明，用維生素E預處理腦片培養物可以通過增加抗氧化酶(如降低穀胱甘肽的量)和顯著降低“脂質過氧化水平”來顯著提高神經元細胞的活力。

結論

細胞凋亡是一種氧化應激，在許多神經退行性疾病的發病機製中發揮重要作用。α -生育酚對H₂O₂研究-誘導的短期新生羊腦組織培養中OS的變化。結果表明，H₂O₂此外，這些發現還表明，維生素E存在時，“脂質過氧化”水平顯著降低，表明維生素E可能對氧化應激具有神經保護作用。穀胱甘肽水平也顯著升高;因此，減輕過氧化氫引起的氧化應激。該研究提示α-生育酚可能通過降低氧化應激直接參與神經元存活在體外．

確認

我們非常感謝沙特國王大學理學院生物化學係對這項研究的推動。我們也感謝女性研究中心院長的支持。

感興趣的宣言

沒有利益衝突需要聲明。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:黃曉燕，陳曉燕，陳曉燕(2018)α -生育酚在H2O2誘導的新生綿羊腦組織氧化應激中的神經保護作用。神經生物學雜誌4(1):dx.doi。org/10.16966/2379 - 7150.145

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出版的曆史:

收到日期:2017年12月14日

接受日期:2018年1月17日

發表日期:2018年1月23日