摘要

乳脂球表皮生長因子8 (MFG-E8)在神經炎症的調節中起著重要作用。研究表明，它改變了一些神經退行性疾病的表達，包括阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)。進展性核上麻痹(PSP)是一種神經退行性疾病，tau蛋白聚集在神經元和膠質細胞中。到目前為止，人們對這種疾病的潛在機製知之甚少。為了研究MFG-E8是否可能在PSP的病理過程中發揮作用，我們對6例PSP患者和6例匹配對照的屍檢腦組織進行了免疫組化研究。我們發現MFG-E8在PSP患者黑質(SN)神經元(P<0.01)、橋腦(P=0.02)和髓質(P=0.04)的表達明顯增加。而其在額葉、顳葉、尾狀核、殼核、小腦的表達無明顯變化(P>0.05)。結果表明，MFG-E8可能與PSP的發病機製部分相關。對MFG-E8的進一步研究可能為PSP的新療法提供新的見解。

關鍵詞:

阿爾茨海默病;帕金森病;黑質;腦橋;髓質

簡介

乳脂球表皮生長因子8 (MFG-E8)是一種由不同細胞類型分泌的糖蛋白。它通過抑製免疫反應參與調節中樞神經係統穩態[1-3]。據報道，它在神經退行性疾病中發揮重要作用，包括阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)[4,5]。研究表明，它可以通過清除澱粉樣β (Aβ)斑塊[4]來緩解AD病理。PD中MFG-E8表達增強。但體內實驗表明，[5]不參與黑紋狀體損傷。這說明MFG-E8在不同的神經退行性疾病中可能有不同的作用。

進展性核上麻痹(PSP)的特征是細胞內錯誤折疊tau蛋白的形成增加。黑質(SN)、橋腦被蓋、動眼核和髓質優先受累。雖然tau陽性的神經纖維纏結(NFTs)、卷曲體、螺紋和簇狀星形膠質細胞已被顯示為[6]，但其潛在機製仍不清楚。我們分析了MFG-E8在PSP患者和正常患者腦組織中的表達，以探討其是否與PSP病理有關

方法

人類大腦樣本

大腦樣本在死者死後不久獲得，然後儲存在神經學研究親屬實驗室的人類腦庫中。對照組和PSP病例的診斷均經認證神經病理學家仔細確認。

共評估6例PSP患者。PSP病例均為Richardson型，確診為向上凝視性麻痹，對多巴胺能刺激無反應。他們都患有嚴重的運動障礙。他們的認知都很清醒，沒有癡呆的跡象。病例1為62歲男性，有7年進展性PSP病史。他對所有形式的治療都沒有反應，包括多巴胺能刺激，並最終無法移動。病例2為68歲女性，表現為不穩定。她在終止Sinemet治療後在醫院好轉，但17個月後在家中死亡。病例3為66歲女性，有6年進展性PSP病史。她對利脲治療無反應，最終無法行動。 Case 4 was a 75 year old female with a progressive movement disorder that did not respond to Sinemet leading to the conclusion she was suffering from PSP. She had previously been PET (positron emission tomography) scanned verifying changes consistent with a movement disorder. She had trouble swallowing and suddenly expired. Case 5 was a 73 year old male with progressive motor impairment causing frequent falls. He showed absolutely no improvement on 8 pills a day of Sinemet. He was confined to a wheelchair and expired in a nursing home. Case 6 was a 64 year old male who suffered from advanced immobility. He was tried on Sinemet which was later discontinued as being ineffective. He expired following 18 months in a hospital extended care unit.

將這些病例與6例對照進行比較。對照病例從死於與神經係統疾病無關的死亡病例中選取，死後研究證實與中樞神經係統無關。簡單地說，病例1是一名78歲的男性，死於心髒驟停。病例2為80歲男性，因慢性阻塞性肺疾病猝死。病例3為一名72歲男性，死於肺癌。病例4為65歲女性，死於甲狀腺癌。病例5為80歲女性，死於支氣管癌。病例6為69歲女性，死於心髒驟停。

死後延遲在PSP組和對照組之間沒有顯著差異。選取額葉、顳葉、尾狀核、殼核、黑質、橋腦、髓質和小腦進行研究。將這些區域切成約5mm厚度的塊，然後在4°C、0.1 M磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中4%多聚甲醛中浸泡2-3天。然後將它們轉移到0.1 M PBS中含有15%蔗糖的維持溶液中。切片按30 μm厚度切割，收集並保存在維護液中使用。對照表1列出了控製組和PSP組的年齡和性別的比較資料。

	年齡	性
控製	78	米
控製	80	米
控製	72	米
控製	72	F
控製	80	F
控製	67	F
PSP	62	米
PSP	68	F
PSP	66	F
PSP	75	F
PSP	73	米
PSP	64	米

表1:本研究中檢查的病例摘要
年齡(平均值±SEM):對照組:74.83±2.17，對照組:68±2.08。采用單因素方差分析檢驗顯著性。* P對照組與PSP組比較<0.05。

免疫組織化學

使用特異性多克隆對MFG-E8進行免疫染色(圖1)抗體(Abnova、台灣)。使用人抗HLA-DR小鼠單克隆抗體CR3/43 (DakoCytomation)對神經炎症標誌物HLA-DR進行免疫染色(圖2)。

使用先前描述的方案進行免疫染色[7]。簡單地說，切片用1.5% H2 O2在PBS中預處理15分鍾，然後在5%脫脂牛奶和稀釋的正常兔血清的1/50稀釋的混合物中阻斷非特異性蛋白幹擾1小時。然後在室溫下與小鼠多克隆MFG-E8抗體(1:1000稀釋;Abnova，台灣)或小鼠單克隆CR3/43 (DakoCytomation 1:1000)與正常兔血清1/50稀釋劑60 μl混合。然後用生物素化兔抗小鼠抗體(1:2000稀釋;DakoCytomation)在室溫下處理1小時，然後根據製造商的說明使用Vector ABC試劑盒(Vector, US)處理1小時。過氧化物酶標記在0.01% 3,3-二氨基聯苯含1%硫酸鎳銨，50 mM咪唑和0.001% H2 O2在0.05 M Tris-HCl緩衝液中孵育後可見。當出現深紫色時，通過在PBS中洗滌切片來終止反應。然後晾幹，蓋上蓋子。使用Olympus bx51顯微鏡，在恒定和預先設定的光線和曝光設置下，使用Image Pro軟件(美國沃爾瑟姆市的即景公司)獲得圖像。

MFG-E8評價

如果反應產物存在於細胞內，則認為切片上的MFG-E8表達呈免疫陽性。本研究采用免疫組化評分(IHS)方法。簡單地說，IHS結合了免疫反應細胞的量化(數量評分)和強度評分(染色強度評分)。用於評估MFG-E8陽性細胞，5張10 ×物體放大倍數(0.567 mm)的隨機圖像²)從每個區域的染色切片中獲取。為了量化，使用Image J 1.49將圖像轉換為8位模式(美國貝塞斯達國家衛生研究所)。然後調整閾值水平，使MFG-E8陽性細胞與非染色細胞分離。使用“已分析粒子”命令對100-500像素之間的所有粒子進行計數。每個圖像的粒子數量被獲取為數量評分。未染色的細胞評分為0,0-25%，染色為1,26 -50%的細胞評分為2,51 -75%的細胞評分為3,76 -100%的細胞評分為4。目測測定MFG-E8免疫反應細胞的強度，得到強度評分。所有這些都是針對每個案例單獨進行的。未染色的強度評分為0;1、弱細胞質染色無背景染色; 2, moderate cytoplasmic staining; 3, strong cytoplasmic staining. The IHS was calculated by multiplying the quantity and intensity scores.

統計數據

所有值均表示為平均值±平均標準誤差(S.E.M.)。采用SPSS 19.0軟件進行Mann-Whitney U檢驗。顯著性是建立在p< 0.05。

結果

MFG-E8在正常和PSP患者中的表達比較

我們對6例對照組和6例PSP患者的腦區進行了免疫組化研究。MFG-E8在所有腦區膠質、神經元和上皮細胞中均有檢測到。在兩組的額葉、顳葉、尾狀核、殼核和小腦中，我們僅發現MFG-E8在細胞質中有微弱至中度的表達。在這些方麵，PSP患者與正常患者之間沒有顯著差異(P>0.05)(表2)。然而在SN (P< 0.01)、腦橋(P=0.02)和髓質(P=0.04)， MFG-E8的表達顯著升高(表2)。更多細節可在補充表1中找到。

地區	控製	PSP	P價值
額	1.17±0.31	1.33±0.50	0.2
時間	1.50±0.62	0.50±0.22	0.8
＊SN	1.00±0.37	4.50±1.09	< 0.01 *
尾狀	0.83±0.31	1.67±0.56	0.24
硬膜	0.67±0.33	1.33±0.21	0.07
＊腦橋	2.17±0.48	5.83±1.17	0.02 *
＊髓質	1.67±0.33	1.83±0.31	0.04 *
小腦	1.33±0.33	1.17±0.40	0.79

表2:PSP患者與正常對照組腦區MFG-E8免疫組化評分
免疫組化評分=數量評分×強度評分;＊P< 0.05。SN,黑質;PSP，進展性核上麻痹。

在PSP病例的SN中，著色的多巴胺能神經元明顯減少，並伴有來自丟失神經元的細胞外神經黑色素(圖1C和1D)。對照病例SN正常(圖1A、1B)。PSP殘黑神經元中MFG-E8表達較強。與對照組(圖1E和1F)相比，PSP病例的SN區也有嚴重的神經元耗損，MFG-E8表達增加(圖1G和1H)。在PSP病例的髓質中(圖1K和1L)，我們在被蓋中觀察到較強的MFG-E8信號。在下橄欖核中僅見弱表達。

圖1:正常和PSP受試者SN (A, B, C, D)、橋腦(E, F, G, H)和髓質(I, J, K, L)的MFG-E8免疫染色。典型PSP病例的SN (C, D)、橋腦(G, H)和髓質(K, L)其餘神經元可見較強的MFG-E8免疫染色。比例尺=50 μm (A, C, E, G, I, K)和20 μm (B, D, F, H, J, L)。

圖2顯示了PSP和對照組的橋足區HLA-DR免疫染色對比。抗體CR3/43是這種小膠質蛋白的一個很好的標記物。如圖2A所示，PSP病例1(女性，75歲)和2B所示，PSP病例2(男性，64歲)的炎症導致激活的小膠質細胞急劇上調。對照病例1(男性，78歲)的圖2C和對照病例2(女性，80歲)的圖2D提供了典型靜息小膠質免疫染色的比較。所有6例PSP病例和所有6例對照均顯示免疫染色與所述示例無區別。這些數據表明，在PSP病例中，MFG-E8的表達上調與炎症反應一致。

圖2:典型PSP和對照組腦橋CR3/43免疫染色。A、PSP案例2例;B、PSP案例4例;C、控製案例4;D，控製組6。注意，與對照組相比，PSP病例中激活的小膠質細胞有強烈的免疫染色。比例尺= 100μm。

討論

在目前的研究中，我們首次證實了MFG-E8在PSP大腦中的表達。它在所有被研究的大腦區域都有不同程度的表達。其廣泛表達與先前報道的抑製神經炎症的作用一致[1,8]。MFG-E8最初被描述為一種具有獨特抗炎作用的乳腺上皮細胞表麵蛋白[9]。最近，它被確認為一種參與一些神經退行性疾病病理的糖蛋白[4,5]。例如，在AD病例中，與老年斑形成[4]相關的MFG-E8整體表達下降。這暗示了在減輕病理方麵的可能作用。該蛋白在PD的SN中表達增加，盡管沒有發現其調節作用。這提出了MFG-E8在不同神經退行性疾病中的不同作用的可能性。

因此，我們對其在PSP中的作用進行了研究。我們從PSP和對照大腦的不同區域選取了一係列切片，發現PSP切片中SN、橋腦和髓質有較強的MFG-E8表達。這表明與病理有關。而在額葉、顳葉、尾狀核、殼核和小腦區域的表達未見明顯變化。由於PSP和對照組的大腦是匹配的，這些差異不能歸因於性別和死後退化。在年齡上有輕微的差異(PSP組為68，對照組為74)，但年齡尚未被確定為MFG-EB表達的一個影響因素。

我們推測，在對照組織中檢測到的MFG-E8的低表達水平與備用功能和對免疫刺激的快速反應能力一致。一旦被激活，它就能調節免疫反應。然而，MFG-E8的作用可能在不同的大腦區域有所不同。

我們發現，在PSP中，MFG-E8在廣泛的神經元丟失區域與剩餘的神經元共定位。因此，MFG-E8可能對這些神經元細胞有保護作用。這可能會抑製炎症細胞因子如TNF-α、IL-1β的產生，從而誘導神經細胞產生這種保護作用。

MFG-E8的上調已知發生在阿爾茨海默病和帕金森病大腦的影響區域。他們有完全不同的病理與脊髓炎的肌腱病。所有這些疾病的共同點都是對神經炎症的反應。在PSP中，受影響區域的存活神經元強烈表達MFG-E8，提示其具有重要的神經元保護作用。

對MFG-E8及其對受攻擊神經元的保護潛力的進一步研究可能為PSP和其他神經退行性疾病的新療法提供新的見解。

確認

本研究得到了廣州市科學技術計劃(資助號1561000166)和不列顛哥倫比亞省個人的資助。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:石霞，於思，McGeer E, McGeer PL(2016)乳脂球表皮生長因子8 (MFG-E8)在進展性核上麻痹中的表達。神經生物學雜誌2(5):doi http://dx.doi.org/10.16966/2379-7150.131

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出版的曆史:

收到日期:2016年10月01

接受日期:2016年10月24日

發表日期:2016年10月28日