摘要

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性神經退行性疾病，主要發生在老年人群中，伴有記憶衰退。目前，其確切的發病機製尚不清楚。一些研究表明，可誘導tau蛋白過度磷酸化的可溶性低聚Aβ (β-澱粉樣蛋白)可能是AD發病的最初環節。然而，目前尚不清楚Aβ如何影響tau磷酸化;結果:在本研究中，可溶性低聚物a β42肽以生理鹽水注入小鼠海馬區作為對照。蘇木精和伊紅(HE)染色顯示，Aβ42主要沉積於角氨1區(CA1)。術後7 ~ 21 d, Aβ42麵積逐漸減小。與對照組相比，磷酸化tau蛋白(p-tau)的表達顯著增加，這表明可溶性Aβ寡聚物激活了tau蛋白的磷酸化並增加了總tau蛋白。同時，我們發現Cdk5的升高(主要在CA1區和SGZ)與tau蛋白磷酸化的增加相關。因此，結果表明可溶性澱粉樣蛋白Aβ誘導的tau蛋白過度磷酸化與Cdk5水平的升高有關。

關鍵字

阿爾茨海默病;β澱粉樣蛋白;τ;Cdk5

縮寫

一個β42:β澱粉樣蛋白42;Cdk5:細胞周期蛋白依賴性激酶5;DG:齒狀回;GAPDH:甘油醛3-磷酸脫氫酶;NS:無菌生理鹽水;HE:蘇木精和伊紅;NS:無菌生理鹽水

背景

AD是老年或衰老期中樞神經係統的進行性退行性疾病[1-3]。AD的主要病理表現為細胞[4]外澱粉樣斑塊積累、神經元[5]內神經纖維纏結、突觸[6]減少、神經元[7]丟失等，多見於海馬、大腦皮層及皮層下組織。

目前，AD的發病機製一直存在爭議。研究者提出了許多假說，包括膽堿能損傷[8]、Aβ神經毒性[9-14]、tau蛋白過度磷酸化[15-20]、氧化應激[21,22]以及金屬誘導氧化神經毒性或澱粉樣蛋白聚集的機製[23,24]。最近的證據表明，AD不是由單一的致病因素引起的，而是由多種並發效應[25]引起的。此外，a β和tau蛋白的聯合作用可能是主要的病因。

在Aβ神經毒性的發展過程中，發現Aβ的可溶性低聚物(即β澱粉樣蛋白衍生的擴散配體(ADDLs)， Aβ42衍生的非纖維配體)誘導的毒性最強[26-29]。ADDLs的存在導致tau蛋白的過度磷酸化，然後過度磷酸化的tau蛋白從神經微管分離。由於遊離tau蛋白數量的增加，細胞骨架的穩定性被破壞。細胞骨架的異常變化產生大量神經纖維纏結是AD的另一個主要病理改變。此外，Aβ被認為可以通過磷酸化激酶等中間產物催化tau蛋白的過度磷酸化[30,31]。

Tau蛋白是一種微管相關蛋白，主要存在於軸突中，在神經元發育早期位於細胞體中，在神經元成熟後向軸突移動。tau蛋白還具有穩定神經元的作用。神經纖維纏結(NFT)是AD的主要病理特征，與tau蛋白的相關性顯著。最近的臨床試驗顯示，AD患者血液和腦脊液中tau的總量和p-tau的含量明顯高於正常和非神經係統組患者[33]。

此外，細胞周期蛋白依賴性激酶5 (Cdk5)可以抑製微管與tau蛋白的結合，從而觸發tau蛋白的過度磷酸化。最近的證據也證實，與Aβ共孵育的原代培養海馬神經元刺激tau蛋白磷酸化，並導致Cdk5的不尋常激活，改變了神經元[34]中tau蛋白的分布和磷酸化tau蛋白的水平。

綜上所述，由於AD發病機製複雜，本研究將著重研究Aβ對tau磷酸化的影響。研究人員發現a β在tau磷酸化中起著重要作用在體外；然而，它並沒有直接描述在活的有機體內．在本研究中，我們的數據表明ADDL治療通過增加Cdk5誘導tau蛋白的過度磷酸化。

方法

β準備

Aβ42(可溶性Aβ寡聚物)購自AnaSpec (San Jose, CA)。500 μg Aβ42溶於100 μl 1% nhh中₄OH製成5 μg/μl原液，置於-20°C的等分溶液中。加入NS後，將工作溶液稀釋至2 μg/μl, 4℃孵育24小時，得到a β低聚物。

一個βintrahippocampal注入

109隻9周齡雄性BALB/c野生型小鼠，體重20 ~ 28 g，廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。所有動物手術均經動物倫理審查委員會批準，並確認廣東藥科大學《實驗動物護理和使用指南》。這些小鼠應該在單獨的通風籠子的特定病原體無(SPF)環境中繁殖。

將小鼠隨機分為正常組(n=20)、ns注射組(n=40)和a β42注射組(n=40)。立體定向注射用0.4%戊巴比妥鈉0.2 mL/10 g麻醉小鼠。Aβ42注射組小鼠雙側海馬CA1區均注射Aβ42肽2 μl (2 μg/μl)， NS注射組為2 μl，正常組小鼠不接受任何手術和治療。從bregma用於CA1區域的坐標如下:前後，-2.3 mm;中側的±1.8毫米;背腹側的,-2.0毫米。注射使用25 ml漢密爾頓注射器，由小型泵(KDS Model 310 Plus, KD Scientific, Holliston, MA)驅動，流速為0.8 μl/min。注射完成後，針在該區域再停留2分鍾，然後緩慢後退，以防止溢出。注射後第7、14和21天，小鼠被麻醉並立即解剖大腦。右半球在4%多聚甲醛中固定48小時，進行組織學檢測。 The left hippocampus was snap-frozen in a pre-cooling vial in liquid nitrogen and finally stored at -80°C for western blot analysis and transcription polymerase chain reaction (RTPCR) testing.

組織學染色

石蠟包埋組織切片，取厚度6 μm的冠狀切片。選取距海馬-1.8 mm ~ -3.2 mm之間60 μm間距的連續切片(每個海馬6個切片)。安裝切片用蒸餾水衝洗，用蘇木精明礬染色，然後用0.3%酸性酒精鑒別。然後用蒸餾水衝洗，切片用伊紅染色2分鍾，脫水安裝。

免疫組織化學染色

水脫蠟後，切片用3% H孵育₂O₂室溫(RT)下靜置15分鍾，置於封閉溶液(10% BSA在0.3% Triton X-100/0.1M PBS pH 7.4中)中靜置30分鍾，然後在4℃下與未標記的主抗體結合過夜。使用以下一抗和工作條件:兔多克隆抗a β42 (ab10148, Abcam, Cambridge, UK, 1:250)、兔多克隆抗cdk5 (ab151233, Abcam, Cambridge, UK, 1:100)進行免疫熒光，兔多克隆抗p-tau (ab10891, Abcam, Cambridge, UK, 1:300)進行免疫熒光。第二天，洗滌三次後，切片與二抗體:生物素化山羊抗兔(ab128978, Abcam, Cambridge, UK, 1:1000)在RT下孵育1小時。陰性對照孵育無一抗。免疫染色通過使用親和素生物素複合物(Vectastain: Vector Laboratories, Burlingame, CA)和二氨基聯苯啶加鎳(DAB Kit: Vector Laboratories)作為顯色劑實現。

對於Aβ42、Cdk5和p-tau的密度，在海馬CA1和DG區域內隨機選擇區域，使用Olympus BX51光學顯微鏡成像(Olympus, Tokyo, Japan)。

西方螺栓分析

用RIPA裂解緩衝液(Beyotime，上海，中國)(50 mM Tris (pH 7.4)， 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1%去氧膽酸鈉，0.1% SDS，蛋白酶抑製劑雞尾酒(原釩酸鈉，氟化鈉，EDTA, leupeptin)和1 mM苯甲基磺酰氟)分離海馬蛋白提取液。用BCA蛋白測定試劑盒(Beyotime, Shanghai, China)對蛋白進行定量分析。蛋白質樣品在12% SDS-PAGE凝膠上分離，以0.8 mA/cm的速度電子轉移到PVDF膜上²為1.5小時。然後，用5%脫脂幹乳在20 mM Tris-HCl (pH 7.4)中與0.05% Tween20(TBS-T)在RT中衝洗1小時，並與主要抗體:兔抗ptau多克隆抗體(sc-101813, Santa Cruz Biotechnology, 1:50 00)、兔抗antiCdk5多克隆抗體(sc-173, Santa Cruz Biotechnology, 1:50 00)和小鼠抗β-Actin單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, 1:10 00)在4℃下孵育過夜。用TBS-T洗滌後，將膜與HRPconjugated IgG (13688-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, 1:1000)在RT中孵育1小時，再次用TBS-T洗滌。用增強化學發光技術開發的印跡(ECL, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)。用Image J軟件(NIH, Bethesda, MD, USA)進行密度定量分析，用β-Actin進行標準化。上述樣本一式三份。

rt - pcr分析

收集組織提取物，在相應時間點用磷酸緩衝鹽水(PBS)衝洗，根據總RNA提取試劑盒(AM1830, Life Technologies)提取處理切片中的總RNA。溶液中加入2 μL (5 mmol/μL) dNTP, 1 μL oligo(dT)， 1 μL (200 U/μL) m-mulv, pH 8.3 RT緩衝液(250 mmol/L Tris-HCl, 250 mmol/L KCl, 20 mmol/L MgCl^2，50mmol DTT)和去離子水。樣品總體積為20 μL。樣品在42°C培養1小時，在70°C加熱10分鍾後停止反應。按照製造商的說明，使用逆轉錄酶從等量的RNA樣品中合成第一鏈cDNA。PCR反應的40個循環覆蓋了PCR擴增的線性範圍。帶密度用密度計(Bio-Rad，美國)掃描。

統計分析

結果采用SPSS 16.0軟件進行分析(IBM, Armork, NY, USA)，差異有統計學意義(P <0.05)。定量數據記錄為平均值±標準差。對分類數據進行Fisher精確檢驗，分別驗證Aβ42注射組和ns注射組退行性神經元、Aβ聚集、tau蛋白過磷酸化和Cdk5表達的差異。當a β42注射組與ns42注射組比較時，采用雙尾t檢驗檢測海馬區tau蛋白和Cdk5蛋白水平。采用Kruskal-wallis單向檢驗檢測正常組、ns注射組和a β42注射組間tau mRNA水平。

結果

注射a β42可引起神經元變性

為了確定Aβ42是否足以引發海馬神經退行性變，我們用HE染色分析了Aβ42治療7天後的形態學結構變化。正常組(圖1A)， HE染色顯示神經元排列整齊(圖1B)。無菌生理鹽水(NS)注射組(圖1C)，手術誘導的損傷僅限於針道區域(圖1D)。然而，在注射Aβ42的區域明顯顯示神經退行性變(圖1E)。此外，注射了a β42的動物在氨角2區(CA2)有退化的神經元(圖1F)。結果表明，Aβ42可引起海馬錐體神經元神經退行性變的神經毒性。

圖1:海馬體的組織學變化。(A) BALB/c小鼠正常海馬HE染色。(C) ns注射海馬HE染色。(E)注射a β42的海馬HE染色。(B, D, F)分別代表(A, C, E)的高倍區域。(F) HE染色顯示Aβ肽周圍注射部位的神經元丟失。比例尺= (A, C, E)為200 μm， (B, D, F)為50 μm。

海馬中可溶性Aβ寡聚物的沉積

將Aβ42注射到海馬體後，Aβ42沉積並代謝。采用抗a β抗體檢測海馬組織中Aβ42的水平。觀察7天、14天和21天Aβ的表達，我們發現在第7天Aβ的積累遠遠高於其他天(數據未顯示)。因此，我們選擇注射Aβ 7天後的小鼠。在ns注射組(圖2A)， Aβ在注射部位幾乎沒有表達(圖2B)。相反，Aβ在齒狀回(DG) SGZ中顯著表達，40隻注射Aβ的動物中約94%表達(圖2C和2D)，而40隻注射ns的動物中無Aβ表達(P<0.0001, Fisher確切檢驗)。

注射a β42誘導tau蛋白過度磷酸化

上述結果表明，Aβ42主要沉積在DG中。我們問注射Aβ42到海馬體是否增強了tau磷酸化。我們用免疫熒光法評估注射Aβ42後磷酸化tau蛋白的水平(圖3D)。與ns注射相比(圖3A-3C)，在CA1(圖3E)和DG(圖3F)中，40隻注射a β42的動物中有35隻出現了tau蛋白過度磷酸化，而40隻注射ns的動物中有8隻出現了tau蛋白過度磷酸化(P<0.0001, Fisher確切檢驗)。因此，Aβ42加速了tau蛋白的過度磷酸化。

a β42注射液通過誘導tau蛋白過度磷酸化激活Cdk5

Cdk5是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)家族的一員，當其異常時可導致神經功能障礙並引發神經退行性疾病。此外，Cdk5的增加可能會加速tau蛋白磷酸化[35]。我們用免疫熒光法檢測海馬區a β42注射組和ns注射組中a β42注射組的初級皮質神經元中Cdk5的表達(圖4)。我們觀察到40隻(P<0.05, Fisher精確檢驗)a β42注射動物(圖4D)中有32隻(圖4E)分別在CA1(圖4E)和DG(圖4F)中有Cdk5，而40隻ns注射動物中有8隻(圖4A-4C, P< 0.0001, Fisher精確檢驗)有Cdk5。在之前的研究中，他們指出，與p35相比，p25存在時磷酸化tau蛋白的Cdk5激酶活性顯著增加在體外[36]。Cdk5/p25的增強觸發了tau蛋白過度磷酸化[37]。推測Aβ42可能通過激活Cdk5促進tau蛋白磷酸化，導致AD病理中tau蛋白過度磷酸化。

圖2:海馬區Aβ免疫染色。(一)NS-injected組。(B, D)分別代表(A, C)的高倍放大區域。(B) ns注射海馬注射部位Aβ負聚集的高倍放大。(C)一個β42-injected組。(D) Aβ42注入海馬的DG在SGZ中的聚集。比例尺= (A, C)為200 μm， (B, D)為100 μm。

圖3:海馬體高磷酸化tau蛋白的免疫熒光表達。(A)對照組(BALB / c + NS) Tau蛋白染色。(B, C)表示(A)的高倍率區域。(B)位於CA1的au陰性表達。(C)位於DG中的tau蛋白表達為陰性。(D) Aβ42注射組Tau蛋白染色(BALB / c + Aβ42)。(E, F)分別表示(D)的高倍率區域。(E)位於CA1的p-tau。(F)位於DG的p tau。比例尺= (A, D)為100 μm， (B, C, E, F)為50 μm。

圖4:免疫熒光檢測海馬區Cdk5的表達。(A)對照組(BALB / c + NS) Cdk5染色。(B, C)表示(A)高倍率區域。(B) Cdk5陰性表達位於CA1。(C) Cdk5在DG中的表達為陰性。(D) Aβ42注射組Cdk5染色(BALB / c + Aβ42)。(E, F)分別代表(D)中的高倍率區域。(E) Cdk5位於CA1中。(F)位於DG的Cdk5。比例尺= (A, D)為100 μm， (B, C, E, F)為50 μm。

圖5:注射Aβ42後7d海馬tau蛋白和Cdk5蛋白水平(A) western blot檢測tau和Cdk5蛋白水平。(B)直方圖表示tau的相對密度。星號表示數據與NS注射液有顯著差異(*P <0.01，學生雙尾t檢驗)。N =10隻/組;誤差線,SEM。(C)直方圖表示Cdk5的相對密度。星號表示數據與NS注射液有顯著差異(*P <0.01，學生雙尾t檢驗)。N =10隻/組;誤差線,SEM。

海馬注射a β42後Cdk5增加，tau蛋白過度磷酸化

為了進一步證實Aβ是否可能激活磷酸化tau-Cdk5的酶，導致tau蛋白過度磷酸化的機製，我們評估了海馬中tau蛋白的磷酸化狀態(p-tau)和Cdk5水平，培養7天後用表位特異性抗體進行定量western blotting檢測(圖5A)。western blot灰色值分析顯示注射a β42 7天後海馬區p-tau蛋白升高約3.9倍(圖5B)，提示p-tau蛋白水平升高可能與a β42誘導的神經退行性變有關。同時，我們發現a β42注射液和ns注射液的Cdk5酶差異約2.3倍(圖5C)。因此，Cdk5催化tau蛋白過度磷酸化，與AD中的積極作用一致。

Q-RT-PCR驗證總蛋白tau

神經元中tau蛋白的過度磷酸化導致tau蛋白與神經微管分離，成為遊離tau蛋白，從而增加了神經元中tau蛋白的總量。為了驗證tau蛋白的總量是否受Aβ寡聚體的調控，采用Q-RT-PCR進行了熔融圖和擴增圖。Aβ42注射後7 d Tau mRNA顯著高於對照組和鹽注射組(P<0.05, Kruskal-Wallis檢驗)。

a β42注射組tau蛋白的δ循環閾值(CT)為10.32，而對照組和鹽注射組tau蛋白的δ循環閾值約為11(表1,P<0.05, Kruskal-Wallis檢驗)。三組間相對數量比較，Aβ42注射後7d tau蛋白表達顯著升高，其餘各組差異無統計學意義(P<0.05, Kruskal-Wallis檢驗)。

討論

本研究發現了Aβ與tau蛋白之間的特異性關係，進一步豐富了AD病因學。在此，我們將合成的低聚物Aβ42注射到小鼠海馬中，觀察到這一單一因素足以引起海馬皮層的神經退行性變，並誘導DG的CA1和SGZ中tau蛋白的過度磷酸化。同時，我們發現Cdk5被Aβ42激活，提示這個新的靶點可能參與AD的發生。

樣本	CT值 (τ)	CT值 的GAPDH	ΔCT	ΔΔCT	相對 數量(2 -ΔΔCT)
控製	16.91	6.14	10.77	0	1
NS-injection	16.99	6.15	10.84	0.07	0.952637998
β42 - 注射	20.37	6.05	10.84	3.45	0.091505355 *

* P與對照組比較< 0.05,Kruskal-Wallis檢驗

表1:實時Q-RT-PCR的周期閾值(CT)

鑒於Aβ促進tau蛋白過度磷酸化的觀點早已被提出，我們無法確定Aβ在這一過程中起何種直接作用，是作為自由態、寡聚肽還是澱粉樣斑塊。此外，有研究表明，低聚a β具有較高的毒性，是AD過程中的一個重要因素[23,24,38,39]。而且，任何AD動物模型都表現出認知障礙，特別是AD轉基因小鼠，基因背景不同，tau位點變化，澱粉樣蛋白沉積的各種不同特征或行為異常，都可能導致神經發生的不一致。例如，有研究發現，使用七氟醚麻醉的AD轉基因新生小鼠腦組織中Aβ42的表達較未用藥的新生小鼠明顯增強。因此，本研究選取BALB / c-野生型雄性小鼠[40]作為實驗對象。將Aβ42注射到小鼠體內後，tau蛋白向樹突移動，導致神經元生理特性發生一些變化。神經元樹突中的Tau蛋白可抑製細胞器的運輸，減少ATP的供應，誘導突觸關節衰退。與正常神經元相比，注射了Aβ42的神經元棘突減少了約75%。同時，由於tau蛋白的重新分布，神經微管數量也明顯減少。因此，Aβ42通過誘導樹突中tau蛋白的重新分布而影響神經元功能，從而誘導神經元凋亡[41,42]。

此外，在正常情況下，tau蛋白修飾隻有2-3個磷酸基，因此tau蛋白可以在磷酸化和去磷酸化之間保持平衡，從而調節細胞骨架。相反，與9-10個磷酸基團連接，Aβ42和tau蛋白共表達導致tau蛋白過度磷酸化增強，然後tau蛋白聚集導致病理情況下神經營養因子(NFTs)的形成。由於tau蛋白失去了生物學功能，過度磷酸化的tau蛋白不足以促進微管積累，維持細胞骨架的穩定。與微管分離後，過度磷酸化的tau蛋白競爭性地與正常tau蛋白結合，導致遊離tau蛋白增加，但降低了tau蛋白的正常生理功能[43,44]。證實這種Aβ誘導海馬神經元tau蛋白過度磷酸化，進而引起微管細胞骨架破裂和神經元退變[45]。因此，我們假設Aβ的可溶性寡聚形式可能在觸發細胞骨架變化和神經元毒性中起主要作用

我們觀察到Aβ42對tau蛋白過度磷酸化的影響，這與Cdk5活性的增加有關。據我們所知，大腦皮層內非細胞周期蛋白p35的存在是Cdk5的激活因子，但其分布的局限性限製了Cdk5[35]的激活。當受到Aβ42刺激時，p35被裂解成p25，而另一個片段則具有calpain活性。p25的半衰期是p35的5-10倍，完全激活Cdk5。p25-Cdk5複合體在切割後缺乏膜錨定信號基序，導致其在細胞內的位置發生變化[46-48]。一方麵，Cdk5可以直接觸發tau蛋白[49]的磷酸化，但另一方麵，Cdk5可以通過調節相關的激酶或磷酸酶[50]在tau中發揮作用。因此，Cdk5對AD發生發展相關的tau蛋白異常磷酸化有很大影響。

我們在這項研究中仍然發現了一些局限性。主要的局限性是無法證明是Aβ觸發了p-tau還是p-tau通過還原到荒謬的方式觸發了Aβ。我們無法評價缺乏Aβ時Cdk5和p-tau的變化。進一步的限製是不同的行為類型的分析;然而，這些數據是前瞻性的。

綜上所述，我們的研究證實了Cdk5參與了神經退行性疾病的疾病過程，其長時間過表達可導致細胞死亡。Aβ誘導的Cdk5活性因p25而升高，進一步觸發tau蛋白的過度磷酸化，導致神經元變性和細胞死亡[51,52]。近年來的研究證實，在AD[53]的發病機製中，除了Cdk5表達水平顯著增加外，Aβ的發育和代謝紊亂以及tau蛋白過度磷酸化的加速。相反，上述三者之間的這種聯係具有很強的啟發性。

結論

在本研究中，我們證實了a β是AD的一個來源，其代謝異常導致a β的有毒可溶性低聚形式在大腦中過度積累，可能通過提高Cdk5表達和tau蛋白過度磷酸化對AD的病理特征產生深遠影響。

致謝

我們感謝美國波士頓斯伯丁康複醫院物理醫學與康複科的W. Qing Mei教授就神經元中tau蛋白和總tau蛋白的過度磷酸化提供的建議，感謝馬宇欣和劉靜提供的出色技術支持。

作者的貢獻

李珊珊女士主要負責動物模型的製備和神經組織化學實驗。田蘇敏老師負責western blot和PCR。孫靈芝女士協助李珊珊女士和田蘇敏女士進行所有實驗。梁誌浩老師、程曉輝老師、王晗老師協助動物模型的製備和動物術後護理，馬玉新老師、劉靜老師指導免疫組化、熒光化學等。李國英博士負責本課題的設計與實施。王慶梅博士為設計提供建議。

相互競爭的利益

所有作者都聲明他們沒有競爭利益。

資金

本研究得到國家自然科學基金項目(No.30840073)的資助。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:李鬆，田鬆，孫麗，梁錚，程旭，等。(2015)Cdk5與β-澱粉樣蛋白誘導Tau蛋白過度磷酸化的可溶性低聚物的關係。神經生物學雜誌1(3):doi http://dx.doi.org/10.16966/2379-7150.108

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出版的曆史:

收到日期:2015年7月8日

接受日期:2015年7月20

發表日期:2015年7月25日