摘要

隨著腎缺血再灌注發病率和死亡率的增加，環氧二碳三烯酸是否對其有保護作用，其作用機製有待進一步探討。

目的:目的探討環氧二碳三烯酸對腎缺血再灌注損傷的影響。

方法:30隻小鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組、環氧二碳三烯酸缺血再灌注組、toll樣受體4抑製劑缺血再灌注組、環氧二碳三烯酸缺血再灌注toll樣受體4抑製劑組。術後24 h觀察腎髒功能及病理改變。采用ELISA法檢測血清白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α和結節樣受體3水平。western blot檢測活化B細胞p65中節點樣受體3、裂解半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1、白細胞介素-1β、白細胞介素-1β、toll樣受體4和核因子kappa-光鏈增強子的蛋白表達。

結果:與假手術組比較，缺血再灌注組腎小管上皮細胞壞死嚴重(P<0.05)。BUN、Scr、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子α、節點樣受體3、toll樣受體4、裂解型天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶1明顯高於假手術組(P<0.05)。此外，環氧二碳三烯酸在缺血/再灌注引起的腎功能損傷和上述蛋白表達均有所緩解(P<0.05)，在toll樣受體4抑製劑和環氧二碳三烯酸聯合給藥後，各蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。

結論:環氧二碳三烯酸可減輕腎髒缺血/再灌注損傷，其機製可能與通過toll樣受體4通路調節節點樣受體3的產生和焦亡有關。

關鍵字

腎缺血/再灌注損傷;Epoxyeicosatrienoic酸;nod樣受體3;Pyroptosis;toll樣受體4

簡介

腎缺血/再灌注(I/R)損傷是急性腎損傷(AKI)的主要原因之一，多由移植、心肺複蘇、休克、造影劑腎病等事件引起[1-5]。由於預後差，缺乏有效的治療，AKI的發病率和死亡率明顯較高[6,7]。nod-like receptor 3 (NLRP3)炎症小體作為I/R重要的病理生理過程，作為無菌性炎症的觸發因子，刺激免疫細胞和炎症因子的層流反應，進而導致小管損傷[8-10]。最近的研究表明，焦亡是一種特殊形式的程序性細胞死亡，依賴於炎症反應，在I/R損傷中起著重要作用[11,12]。因此，抑製炎症和減少焦亡可能是預防I/ r致腎損傷的必要靶點。

環氧二烯二酸(EETs)由花生四烯酸通過細胞色素P450環氧化酶途徑代謝而來，在多種疾病的治療中具有舒張血管、抗炎、抗凋亡等保護作用[13-15]。我們之前的證據表明，EETs可以緩解腎髒I/R誘導的炎症細胞浸潤[16-18]。本研究采用雄性C57/BL6小鼠建立I/ r誘導的AKI模型，預給藥為1415 - eet。通過檢測EET中NLRP3、cleaved-caspase-1、IL-1β等蛋白的表達，分析EET對腎I/ r相關炎症反應的影響及機製，為改善AKI提供一種新的有效治療方法。

材料和方法

小鼠實驗方案經中山大學附屬第五醫院動物倫理委員會批準，10周齡C57/BL6小鼠隨機分為假手術組、I/R組、I/R+EET組、IR+TLR4抑製劑(tako -242)組、IR+EET+ tako -242組，每組n=6隻。小鼠經異氟醚麻醉後，於I/R術前1 h腹腔注射EET、TAK-242。在整個手術過程中，小鼠的體溫保持在37℃。I/R小鼠模型采用雙側腎蒂夾閉18min，取出夾閉後再灌注。假手術組采用相同方法，不夾緊腎蒂。術後24小時處死小鼠，采集血液和腎髒標本作進一步分析。

試劑

14,15- eet類似物購自開曼化學公司(項目:10009286)。NLRP3 (#13158)， cleaved-caspase-1 (#89332)， pro-IL-1β (#12703)， IL-1β (#12703)， NF-κB p65 (#8242)， GAPDH(#2118)和山羊抗兔均購自CST。toll樣受體4 (TLR4) (A5258)購自ab克隆。ELISA試劑盒購自武漢博斯特生物科技有限公司。

動物

雄性C57BL6小鼠(10周齡)，體重20-25 g，購自南京大學-南京生物醫學研究所，編號:SYXK (Su) 2015-0001。在中山大學附屬第五醫院分子成像中心的SPF環境中，定期給予食物和自來水，維持12小時的明暗循環。

生物化學分析

用生化試劑盒檢測血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)水平(圖1)。

圖1:測定小鼠的BUN和Scr
*P <0.05 vs假手術組;#P <0.05 vs I/R組;與I/R+EET組相比，&P <0.05。平均數±標準差。N = 6 /組。

腎損傷的組織學分析

腎髒組織用10%福爾馬林固定後石蠟包埋，置於載玻片上，蘇木精、伊紅(H&E)染色，顯微鏡下觀察染色切片。

ELISA

按照藥品說明書，用ELISA試劑盒檢測血清IL-1β、TNF-α和NLRP3水平。

免疫印跡分析

腎髒組織提取和蛋白濃度檢測采用BCA蛋白檢測試劑盒(Beyotime, China, P0010)。樣品經15% SDS-PAGE、10% SDS-PAGE分離後轉入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，每道30 μg。用5%脫脂乳汁在室溫下阻隔膜1小時後，在4℃下塗抹兔抗NLRP3多克隆抗體(1:1000)、cleaved-caspase-1(1:1000)、pro-IL-1β(1:1000)、IL-1β(1:1000)、NF-κB p65(1:1000)、TLR4(1:1000)和GADPH(1:1000)一抗過夜，然後與山羊抗兔在室溫下孵育1小時。采用ECL化學發光檢測蛋白表達，用Image J軟件量化條帶密度。

統計分析

實驗數據用均數±均數標準誤差(SEM)表示，用SPSS 22.0進行分析。多組間差異分析采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

EET可減輕I/ r誘導的腎功能損害

為了評價EET在I/R損傷中的作用，I/R組BUN和Scr水平明顯高於假手術組(P<0.05)。與I/R組相比，EET給藥前BUN和Scr顯著降低(P<0.05)。

EET可減輕I/ r誘導的腎小管壞死

假手術組腎小球、腎小管及間質結構正常(圖2)。I/R組出現刷壁脫離及部分腎小管上皮細胞壞死(P<0.05)。然而，在I/R手術後，EET治療腎小管損傷不明顯。與I/R組相比，EET組腎損傷明顯改善(P<0.05)。

圖2:不同組均有代表性腎組織組織學(HE染色，× 400)。
答:假組;B:缺血再灌注(I/R)組;C:帶EET的I/R組;D: TAK242 I/R組;E:帶有EET和TAK242的I/R組。
平均數±標準差。N = 6 /組。

EET降低血清炎症因子和NLRP3水平

為了觀察炎症變化，采用ELISA試劑盒檢測血清炎症因子水平，以了解EET對腎髒炎症的影響(圖3)。與Sham組相比，I/R組血清IL-1β、TNF-α和NLRP3水平明顯上調(P<0.05)。而與I/R組相比，EET治療後血清水平明顯降低(P<0.05)。

圖3:小鼠血清IL-1β、TNF-α、NLRP3水平。
*與假手術組比較P<0.05;#與I/R組比較P<0.05;與I/R+EET組比較，&P<0.05。
平均數±標準差。N = 6 /組。

EET可能通過TLR4途徑調節NLRP3的表達和焦亡

western blot檢測炎症小體及熱解相關NLRP3、cleaved-caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β、TLR4的表達(圖4)。與假手術組比較，I/R組NLRP3、cleaved-caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β表達明顯升高(P<0.05)，而EET組則出現降低上述蛋白表達的情況(P<0.05)。此外，為了進一步探討EET結果對NLRP3和焦亡激活的機製，我們檢測了EET和/或TLR4抑製劑(TAK-242)在I/R術後TLR4和NF-κB p65的表達。結果表明，EET可減輕上述蛋白的表達，而EET與TAK-242聯合給藥可增強EET單用對NLRP3和熱亡的抑製作用(P<0.05)。

圖4:免疫印跡法檢測NLRP3、cleaved-caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β、TLR4、NF-κB P65蛋白表達及定量。
平均數±標準差。N = 6 /組。
*與假手術組比較P<0.05;#與I/R組比較P<0.05;與I/R+EET組比較，&P<0.05。

結論

AKI是中國一種發病率較高的重症，給患者帶來了巨大的身體和經濟負擔。AKI的病理生理機製複雜，可由多種因素引起，包括手術、缺氧、炎症等。腎缺血缺氧過程中，損傷的血管內皮細胞刺激炎症級聯，導致腎小管和間質損傷。已有證據表明，炎症小體是炎症中介導細胞死亡的關鍵核心，其中NLRP3炎症小體是這一炎症級聯的關鍵因子，通過自身低聚化和信號轉導，引起腎髒損傷。在抑製炎性小體發生後，可調節促炎細胞因子的成熟和釋放，減輕腎髒損傷。在本研究中，I/R組明顯表現為BUN、Scr升高，管狀損傷、刷緣脫落。然而，當EET治療時，BUN、Scr、NLRP3、IL-1β和TLR4下降，提示EET可緩解I/ r誘導的炎症和腎功能障礙。

與壞死和凋亡不同，焦亡是細胞程序性死亡的一種特殊的炎症方式。在內源性和外源性效應的刺激下，切割-caspase-1作為一個重要因子的激活促進了IL1β和其他炎症細胞因子的成熟，伴隨炎症級聯和細胞死亡的過程。此外，TLR4和NLRP3炎症小體通路在外源性病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)和內源性危險相關分子模式(hazard -associated molecular patterns, DAMPs)的觸發下被激活，從而介導炎症反應和焦亡。NLRP3作為pro-IL-1β裂解的調控因子，激活TLR4通路誘導pro-IL-1β的轉錄。因此，TLR4通路與NLRP3炎症小體在激活IL-1β方麵可能存在協同作用。同時，炎症小體和焦亡症之間也可能有很強的聯係。最近的研究表明，通過NLRP3-caspase-1途徑，腎髒疾病的關鍵是焦亡。本研究設計小鼠建立I/R模型。與假手術組相比，I/R組NLRP3、cleaved-caspase-1、IL-1β水平明顯升高。而EET作用後NLRP3、cleaved-caspase-1、IL-1β水平降低，說明EET作用抑製了NLRP3炎症小體的激活，western blot證實，EET顯著降低了炎症相關蛋白水平，減輕了炎症小體的形成和焦萎。

TLR4途徑是激活NLRP3炎性小體的經典途徑。激活的TLR4最終通過複雜的級聯反應激活NF-κB，介導其他炎症和免疫反應。TLR4通路的激活誘導pro-IL-1β的轉錄，而NLRP3炎症小體的激活誘導IL-1β的裂解。綜上所述，TLR4通路與NLRP3炎症小體在激活IL-1β方麵存在協同作用。同時，焦亡引起的炎症損傷因子的釋放可以繼續作為TLR4的內源性配體，形成正反饋，加重炎症損傷。考慮到TLR4通路、NLRP3炎症小體與焦上症的關係和機製，本實驗采用EET或/和TAK-242給藥小鼠手術誘導I/R。結果顯示，EET可降低BUN、Scr、NLRP3、TNF-α、TLR4、cleaved-caspase-1和IL-1β水平，對減輕炎症反應和焦亡有一定作用。而EET和TAK242聯合給藥更能降低上述水平，並增強有用作用，說明TLR4途徑在腎I/R損傷中被激活，可能與NLRP3炎症小體在I/R誘導的炎症和焦亡途徑中發揮重要作用。說明EET對腎髒I/R具有一定的保護作用。其確切的藥理機製可能與NLRP3和焦亡症有關。

獎助金

本研究得到國家自然科學基金(NSFC No.81600529)、中央高校基本科研業務費專項資金(17ykpy64)、珠海科技計劃項目(20181117E030069)的部分資助。

參考文獻

1. Aiyegbusi O, Witham MD, Lim M, Gauld G, Bell S(2019)在初級保健中引入電子急性腎損傷警報的影響。臨床腎髒病雜誌12:253-257。［Ref。］
2. Borasino S, Kalra Y, Elam AR, Carlisle O 'Meara L, Timpa JG等。(2018)溶血對體外膜氧合支持兒童急性腎損傷和死亡率的影響。J額外公司技術50:217-224。［Ref。］
3. Cima L, Nacchia F, Ghimenton C, Valotto G, Boschiero L，等(2019)嚴重急性腎損傷供體腎移植的組織病理學和長期預後。Prog transplantation 29: 36-42。［Ref。］
4. Di Bacco L, Montisci A, Miceli A(2019)評論:急性腎損傷:100萬塊拚圖。中華胸心血管雜誌157:2367-2368。［Ref。］
5. 李恩珠，Ha Nee Jang, Hyun Seop Cho, Eunjin Bae, Tae Won Lee，等(2018)與靜脈注射阿昔洛韋相關的急性腎損傷(采用RIFLE分級)的發生率、危險因素和臨床結果。Ren Fail 40: 688-693。［Ref。］
6. Chatterjee S, LeMaire SA, Amarasekara HS, Green SY, Price MD等(2019)早期急性腎損傷對胸腹主動脈瘤修複結果的不利影響。Ann Thorac外科107:1720-1726。［Ref。］
7. Mohammadi Kebar S, Hosseini Nia S, Maleki N, Sharghi A, shshhgelani A(2018)危重症患者急性腎損傷發生率、危險因素及臨床轉歸。伊朗J公共衛生47:1717-1724。［Ref。］
8. 雷強，易婷，陳晨(2018)NF-κB-Gasdermin D (GSDMD)軸偶聯氧化應激與NACHT、LRR和PYD結構域含蛋白3 (NLRP3)炎症小體介導的心肌細胞焦亡心肌梗死。醫學科學監測24:6044-6052。［Ref。］
9. 李強，葉濤，龍濤，彭霞(2019)銀杏素通過TLR4/NF-κB信號通路對大鼠腦缺血/再灌注損傷模型發揮抗炎作用。生物技術與工程學報33(5):583 - 583。［Ref。］
10. 王鬆，袁玉華，陳寧華，王海紅(2019)NLRP3炎性小體/焦亡激活機製及其在帕金森病中的作用。免疫藥典67:458-464。［Ref。］
11. 董卓，潘坤，潘傑，彭強，王燕(2018)腦缺血後細胞焦亡的可能性及分子機製。神經科學公牛34:1131-1136。［Ref。］
12. 王曉燕，王曉燕，王曉燕(2018)心肌缺血-再灌注損傷中炎性小體、細胞因子的變化。Am J Physiol Heart Circ Physiol 315: H1553-H1568。［Ref。］
13. 郭豔，羅芳，張旭，陳娟，沈亮等(2018)TPPU提高運動誘導的環氧二碳三烯酸濃度對心肌梗死後小鼠的心髒保護作用。中華細胞醫學雜誌22:1489-1500。［Ref。］
14. Hye Khan MA, Fish B, WahI G, Sharma A, Falck JR，等(2016)環氧二碳三烯酸類似物減輕輻射腎病大鼠模型的腎損傷。臨床科學(國際)130:587-599。［Ref。］
15. Imig JD(2016)環氧二十碳四烯酸和20-羥基二十碳四烯酸對內皮和血管功能的影響。藥典77:105-141。［Ref。］
16. Hoff U, Bubalo G, Fechner M, Blum M, Zhu Y，等(2019)合成環氧二碳三烯酸類似物防止缺血性急性腎損傷的發生。物理學報(自然科學版)227:e13297。［Ref。］
17. Khan MA, Liu J, Kumar G, Skapek SX, Falck JR，等。(2013)新型口服活性環氧二碳三烯酸(EET)類似物減輕順鉑腎毒性。雜誌27:2946-2956。［Ref。］
18. roashko M, Schragenheim J, Abraham NG, McClung JA(2016)環氧二碳三烯酸治療糖尿病和缺血性心肌病。藥理進展37:945-962。［Ref。］

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條信息

文章類型:研究文章

引用:朱豔，丁安，楊紅，陳海波，郭建林(2019)EET通過NLRP3和焦亡對腎髒I/R的保護作用。腎衰竭5(4):dx.doi.org/10.16966/2380-5498.186

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出版的曆史:

收到日期:07年11月,2019年

接受日期:2019年11月26日,

發表日期:2019年11月30日