摘要

含有光治療染料的納米粒子氯e6(Ce6)已經在光動力療法(PDT)的多項研究中得到了探索。然而，相對於其他含有NPs的染料，關於其PDT功效的研究很少。本文製備了含有Ce6的聚丙烯酰胺納米粒子(PAAm NPs)，並將其PDT效能與之前報道的含PAAmNPs的亞甲基藍(MB)進行了比較。研究發現，對於相同的NP劑量和光子劑量，Ce6 NPs在殺死癌細胞方麵的能力要強一個數量級。

關鍵字

Photo-dynamic療法;納米顆粒;氯e6；癌症

簡介

在美國，癌症是導致死亡的主要原因，治療大多局限於非選擇性方法，如化療、放射治療和手術。這引起了人們對研究選擇性治療方法以提高生存率和總體生活質量的廣泛興趣。靶向納米顆粒的使用是一種長期存在的方法[1-3]。

水凝膠NPs已被證明在癌症治療中完成多種任務，如成像[4]、可見組織圈定[5]、化療藥物的選擇性積累[6,7]、光動力治療(PDT)[8-10]、光熱治療(PTT)[11]和傳感[12]。np介導的PDT由於其雙重選擇性(細胞靶向NPs和激光聚焦照射)和低腫瘤耐藥性而備受關注。

PDT是基於細胞毒性活性氧(ROS)，由染料(光敏劑)在有氧存在的光照明下激發產生。因此，PDT需要光、染料和氧氣才能產生細胞毒性作用。當含有表麵修飾(肽、抗體、小分子等)的NPs在攝取時具有癌細胞特異性時，可通過選擇性積累獲得治療癌細胞的良好選擇性[1,13]。

一些能夠有效的PDT光敏劑已經被使用，如Photofrin，亞甲基藍和氯e6。氯化e6 (Ce6)已被用於癌症和心髒病的光動力治療[14-18]。在此，我們研究了Ce6和亞甲基藍(MB)在體外嵌入水凝膠(即聚丙烯酰胺NPs)時的相對功效。先前報道的MB NPs用於比較[19]。各種細胞係可以用於這些實驗。我們選擇海拉細胞是因為它們代表了最強健的細胞係;殺死它們需要相當大的傷害/壓力。這有助於說明良好的PDT功效，顯示即使是這些非常健壯的細胞也會被殺死。

方法

材料

Ce6來自前沿科學。其他所有的化學物質都來自於西格瑪·奧爾德裏奇。丙烯酰胺(AAm)、氨基丙基甲基丙烯酰胺(APMA)、3-(丙烯氧基)-2-羥丙基甲基丙烯酸酯(AHM)、二辛磺基琥珀酸鈉鹽(AOT)、Brij 30、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、n -羥基琥珀酰酰胺(NHS)、二甲基亞碸(DMSO)、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS, 0.01 M)、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。

氯化Ce6水凝膠NPs的製備

1.07 g AOT, 2.2 mL Brij 30和30 mL己烷組合在100 mL圓底燒瓶中。製備28 mg APMA, 368 mg AAm, 52.6µL AHM, 40 mg EDC, 60 mg NHS, 15mg Ce6 100µL DMSO, 930µL PBS的水相並加入圓底瓶中。燒瓶內的東西以500轉/分鍾的轉速攪拌2小時。然後用長頸針與混合物接觸，用氬氣衝洗內容物15分鍾。然後繼續氬氣流動，但將其從與混合物的接觸中移除。在100µL的水中滴入15 mg APS以啟動聚合。滴加100 μ L的TEMED，在氬氣下反應2小時。然後除去氬氣，將燒瓶中的內容物暴露於氧氣中以淬火聚合。己烷旋轉蒸發，剩餘的內容在amicon電池(300 kDa膜)中用10×150 mL乙醇和5×150 mL Millipore水清洗。最終產品分散在Millipore水中，使用0.45 μ m聚醚磺酸鹽過濾器過濾，並凍幹得到固體產品。 Samples are stored in a freezer until needed.

單線態氧測試

用單態氧感綠(SOSG)檢測活性氧的產生。取1 mg/mL樣品(2 mL, PBS)，在甲醇中加入10µL的0.5 mM SOSG，在662 nm處照射5 min。照射前後在504/525 nm Ex/Em處測定SOSG的熒光。

規模分析

透射電子顯微鏡(tem)是在密歇根大學顯微鏡和圖像分析實驗室拍攝的。樣品通過溶劑真空蒸發沉積在網格上，隨後用醋酸鈾酰染色。

合成了NPs(無染料)的坯料，並用動態光散射(DLS, Delsa Nano C顆粒分析儀)對其進行了表征。由於頻譜幹擾，對有源NPs不使用DLS。

UV / VIS

吸收光譜采集使用島津UV-1601 UVVisible分光光度計。

細胞培養

96孔板每孔(n = 16) 2000個HeLa細胞，包含200µL的細胞培養基。分別給予0、200 μ g/mL的NP劑量;0µg/mL為對照組，100%活力。在平板閱讀器中，通過MTT法[13]比色法測定細胞活力。簡單地，將細胞培養基替換為無色培養基，不含血清(100µL)， 20µL為5 mg/mL MTT試劑，孵育4小時。然後小心地除去培養基，用100µL的DMSO使福爾馬甲晶體溶解。

光毒性

用LED陣列(625 nm±20 nm, 35.2mW)照射96孔板6分鍾。

結果

結果見表1和圖(1-7)。

討論

Ce6具有中度疏水性，因此容易在鹽水溶液中聚集。紫外/可見吸收光譜顯示在~662 nm處有一個優勢峰，特征為單體形式的Ce6(圖1)[15]。在668 nm處也檢測到較強的熒光，這是單體Ce6(圖2)[15]的典型位置。這說明NP適當地保護了Ce6不被聚合。在消光係數為61000和峰值為662 nm的情況下，每mg NP的負載估計為~23-24 nmol Ce6。

圖1:製備的Ce6 NPs的吸收光譜。濃度= 1毫克/毫升PBS。

圖2:Ce6水凝膠NP在PBS中0.1 mg/mL濃度激發(藍色)/發射(紅色)。激發光譜使用668 nm熒光。

采用SOSG作為布爾檢驗，以確定Ce6在偶聯和封裝後是否保持了產生ROS的能力。SOSG對單線態氧的檢測具有高選擇性，表現為熒光信號的增強。(圖3)顯示了Ce6 NPs照射後強烈而明確的熒光增強，證實了Ce6產生ROS的能力得到了保存。

圖3:SOSG熒光增強試驗。在~668 nm處的峰值是由Ce6熒光引起的。

含Ce6 NPs的黑毒性96孔板細胞具有良好的生物相容性;在黑暗中孵育24小時後，大約89%的細胞是存活的(圖4)。tem顯示脫水的NPs約為17納米(圖6)，與[19]研究的約14納米MB NPs大小相似。合成了NPs(無染料)坯料作為二次尺寸表征方法。這些空白NPs的直徑約為68 nm，是生物相容性納米顆粒的典型尺寸(圖6)[19]。

圖4:ce6np暗毒板MTT檢測結果。當劑量為200 ug/mL時，細胞存活率為89%。

圖5:含HeLa細胞的Ce6 NP輕毒板MTT檢測結果。在劑量為200 ug/mL的Ce6 NPs光照6 min後，細胞存活率為58%。照明時間=6分鍾，35.2 mW LED陣列(625 nm±20 nm)。

圖6:脫水Ce6水凝膠NPs的TEM圖像。

圖7:水合Ce6 NP坯的DLS分析。平均直徑=68 nm, PDI=0.204。

在LED光源照射6分鍾後，光毒性板僅顯示58%的活性(圖5)。我們指出，已知的是，對於所使用的NPs，它們將通過內吞作用進入細胞，並在24小時內發生飽和[20]。結合SOSG測試(圖2)，這種光板和暗板之間的巨大活力差異歸因於PDT對細胞的殺傷。

在之前的研究中，使用相同的光源和劑量，MB NPs的存活率達到70%(表1)[19]。然而，MB NPs在照明光譜範圍內，在大約625 nm(峰值照明波長)具有更強的光學吸收能力。具體來說，這些MB NPs的OD值為0.5，而Ce6的OD值為0.2。因此，Ce6 NPs顯示出比MB NPs更高的細胞殺傷率，而吸收能力明顯較低(表1)。這表明，對於這個特定的係統，如果使用Ce6 NPs的峰值吸收波長(662 nm)，它們將比報告的MB NPs強一個數量級。

NPs	Wt %染料 加載	nmol染料/毫克 NP加載	TEM (nm)	NP OD @ ~ 625納米	6分鍾PDT 生存能力
Ce6	1.40	23.4	17	0.2	58%
MB	0.63	13.1	14	0．5	70％

表1:Ce6和MB NPs[19]的比較數據。OD =光源峰值波長光密度，NP濃度= 1 mg/mL。
注意:兩種光敏劑使用相同的光源和配置。

與MB水凝膠NPs相比，Ce6水凝膠NPs唯一觀察到的缺點是隨著Ce6負載的增加，NP親水性總體下降。未來與Ce6的合作應該集中在提高其納米平台的親水性上，這樣NPs的適當濃度就可以應用於動物模型，最終應用於人體模型。

結論

本研究結果表明，與之前使用的MB NPs相比，所製備的Ce6水凝膠NPs具有良好的生物相容性和更強的殺傷癌細胞效果。這些信息應該有助於選擇含有納米顆粒的最有效的PDT光敏劑，這將在即將進行的動物模型研究中得到證明。

確認

我們感謝美國國家衛生研究院(NIH)對R01CA186769 (RK)項目的支持。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Hopkins T, Ukani R, Kopelman R(2016)含氯e6納米顆粒的細胞內光動力活性。納米外科2(4):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-3206.119

版權:©2016 Hopkins T，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2016年11月03

接受日期:2016年11月14日

發表日期:2016年11月17日