摘要

目的:本研究的目的是通過將磁性納米顆粒(MNPs)和鈣黃素或阿黴素(DOX)包封到熱敏脂質體(TSLs)中，開發磁性納米載體，並利用磁顆粒成像(MPI)研究其可視化的可行性，以及利用磁性熱療(MH)誘導DOX釋放的化療療效。

材料與方法:首先，使用由1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷膽堿(DPPC)和聚氧乙烯(20)硬脂醚(Brij78)組成的脂質混合物製備TSLs^®)的摩爾比為96:4。其次，我們將MNPs和鈣鈣素封裝到TSLs中，並使用MPI掃描儀對它們進行成像。用硫氰酸鉀法測定磁性TSLs中鐵的淨濃度。我們還用我們的係統對磁性TSLs進行MH加熱，最後，我們開發了包覆MNPs和DOX的TSLs (DOX-TSLs)，並進行了動物實驗。將DOX-TSLs直接注入荷瘤小鼠的腫瘤後，使用我們的MPI掃描儀掃描小鼠，然後進行MH。

結果:從TSLs中釋放的鈣黃素在38-40°C時急劇增加，隨後趨於穩定，而在27- 36°C時幾乎為零。使用我們的MPI掃描儀成功地可視化了磁性tsl。MPI平均像元值與磁性TSLs中的淨鐵濃度和MH誘導的溫升有顯著相關性，當DOX-TSLs注入腫瘤並施加MH時，腫瘤相對體積生長明顯低於未施加MH時，提示MH誘導DOX釋放化療的治療效果。

結論:我們的研究結果表明，我們的磁性TSLs在納米醫學中是很有用的藥物遞送納米載體。我們的結果還表明，MPI有助於增強基於藥物從TSLs釋放的化療效果，因為MPI可以在正對比中可視化磁性TSLs，使我們可以估計磁性TSLs中的鐵濃度，以預測MH誘導的藥物釋放。

關鍵字

熱敏的脂質體;磁粒子成像;磁熱治療;磁性納米粒子;阿黴素

簡介

納米顆粒在癌症診斷和治療中的應用正在逐步發展，這可能是藥物輸送係統中最重要的發展之一。脂質體是具有高度生物相容性和生物可降解性的納米顆粒，可以將親水性藥物包裹在水腔內[1,2]。以脂質體為基礎的抗癌化療因其通過包裹藥物降低健康組織細胞毒性的優勢而備受關注。因此，近年來人們對幾種多功能脂質體製劑進行了研究，以期臨床應用。例如，封裝阿黴素(DOX)的聚乙二醇(PEG)包被長循環脂質體已經被批準用於臨床[3,4]。Yatvin等人[5]在1978年首次開發了捕獲抗癌藥物的熱敏脂質體(TSLs)。當與局部熱療結合使用時，TSLs是最有前途的癌症治療工具之一。由1,2 -二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷膽堿(DPPC)製成的TSLs被設計成在脂質雙分子層[1]的熔融相變溫度下釋放被囊藥物。最近，人們在開發新的TSL配方方麵投入了大量的精力。2011年，Tagami等人[6,7]報道了一種由DPPC和聚氧乙烯(20)硬脂醚(Brij78)組成的新型TSL配方^®)的摩爾比為96:4(熱激活細胞毒(HaT)脂質體)，封裝釓-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)的HaT脂質體可以在磁共振成像(MRI)監測下用於熱療聯合給藥。

熱療是癌症治療的一種方法。然而，在不損傷周圍正常組織的情況下，局部加熱到高溫狀態存在技術難點[8,9]。磁性納米粒子熱療技術(磁性熱療:MH)解決了這一問題，近年來備受關注。MNPs以其高的通用性在納米醫學中得到了廣泛的應用。當暴露於交變磁場(AMF)時，由於磁滯和/或弛豫損失(布朗弛豫和Néel弛豫)[10,11]，MNPs產生熱量;這導致MNPs積累[12]的組織受熱。

此外，基於超順磁性氧化鐵(磁鐵礦或磁鐵礦)的MNPs已被用作MRI造影劑。由於T2*的縮短，使用這些藥物增強了橫向弛豫時間(T2*)加權圖像的負對比度。Béalle等人[13]製備了磁性脂質體，稱為超磁性脂質體，該脂質體適合全身給藥，其特點是通過在囊泡的水核中摻入大量的MNPs，具有出色的MNPs負載潛力。高封裝的MNPs脂質體允許有效的MRI檢測，磁靶向，並加熱感興趣的部位，同時最小化注射劑量[13]。

最近，一種新的成像方法被稱為磁粒子成像(MPI)被引入[14]。MPI可以成像MNPs的空間分布，具有高靈敏度、空間分辨率和成像速度[14]。MPI使用MNPs的非線性響應來檢測它們在AMF中的存在，這裏稱為驅動磁場。空間編碼是通過使用靜態磁場(選擇磁場)使大多數成像區域的MNPs飽和來完成的，稱為場無點[14]或場無線[15]的特殊位置附近除外。我們開發了一種具有場自由線編碼方案的MPI係統，其中場自由線由兩個相對的釹磁鐵產生，橫向圖像由梯度儀線圈接收的三次諧波信號通過最大似然期望最大化(ML-EM)算法重建[16,17]。

封裝MNPs和抗癌藥物的TSLs不僅有潛力應用於MPI作為造影劑的診斷，也有潛力應用於MH誘導的藥物釋放的化療。本研究的目的是開發封裝MNPs和鈣黃素或DOX的TSLs，並研究使用MPI在體外和體外可視化它們的可行性在活的有機體內以及MH誘導DOX釋放化療的療效在活的有機體內．

材料與方法

材料

DPPC和Brij78^®購自Wako純化學工業有限公司(日本大阪)。雙[N,N-雙(羧甲基)氨基甲基]熒光素(鈣黃素)由Dojindo株式會社(日本熊本)製造，並從Wako純化學工業株式會社(日本大阪)購買。硫氰酸鉀和硫酸銨購自Wako純化學工業有限公司(日本大阪)。磁流體M-300(磁鐵礦，鐵_3.O₄)購自Sigma Hi-Chemical Inc.(日本神奈川)。磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na₂HPO₄10mm和KH₂阿寶₄2 mM, pH值7.4)購自Wako純化學工業有限公司(日本大阪)。鹽酸DOX購自Kyowa Hakko麒麟株式會社(日本東京)。

封裝鈣黃素的TSLs的製備:采用薄膜法和水合法製備了包埋鈣黃素的TSLs。首先，20mg /mL由DPPC和Brij78組成的脂質混合物^®以96:4的摩爾比在圓底燒瓶中溶於乙醇。用旋轉蒸發器除去溶劑並幹燥24 h。脂質混合物在65°C下水化，加入鈣黃素(63 mM)的PBS溶液，pH調整為7.4。超聲處理5分鍾，超聲處理間隔1分鍾，重複4次。在CL-2B柱(直徑2厘米，長50厘米)(GE Healthcare Japan Co.， Tokyo, Japan)中使用Sepharose凝膠層析去除未包裹的鈣黃素，流速為1 mL/ min, PBS作為洗脫溶液。

鈣黃素釋放量的測定:利用鈣黃素熒光[18]的自猝滅現象，測量鈣黃素從加載鈣黃素的TSLs中釋放的鈣黃素。簡單地說，將含有鈣黃素的脂質體溶液60µL的懸液添加到600 μL的PBS微管中。從懸浮液中獲得的樣品在每個溫度下孵育20分鍾，從27℃開始，使用塊培養箱(BI-516S, ASTEC Co.， Ltd, Fukuoka, Japan)增加到34、36、38、40、42、44℃。每個樣品20µL加入2ml PBS稀釋，樣品置於96孔板中測量熒光強度。熒光強度測量使用平板閱讀器(F-7000，日立公司，東京，日本)，激發波長為485 nm，發射波長為520 nm。為了測定鈣黃素的最大釋放量，將60 μL懸液按重量比(6 μL)加入含1% Triton X-100(日本大阪Wako純化學工業有限公司)的600 μL PBS中，在50℃下孵育20 min，以破壞脂質體膜。鈣黃素負載的TSLs釋放鈣黃素的百分比計算如式1所示:

$ $發布\左(右\ % \)\ = {{{F_a} \, {F_b}} \ / {{F_t} \, {F_b}}} \ \乘以100 \,............\左(1 \右)$$

F_b和F_一個分別為脂質體懸液在孵育前和在給定溫度孵育20分鍾後的熒光強度，F_t為Triton X-100處理後樣品的熒光強度。用非線性最小二乘法[19]擬合溫度與鈣黃素釋放量之間的關係為方程2所示的s型函數。

$ $ f左(x \) \ \ = {\ / {1 \ + \ {e ^ {- b \離開({x - c} \右)}}}}\ \乘以100 \,............\左(2 \右)$$

其中a b c是常數。

負載DOX的TSLs製備:根據上述程序製備裝載DOX的TSLs，並進行了一些小的修改[6,7]。首先，加入20 mg/mL由DPPC和Brij78組成的脂質混合物^®以96:4的摩爾比在圓底燒瓶中溶於乙醇。用旋轉蒸發器除去溶劑並幹燥24 h。脂質混合物在65°C下水化，加入280 mM硫酸銨(pH值4-4.5)。將得到的懸浮液超聲5 min，超聲重複4次，每間隔1 min。TSL溶液冷卻至室溫後，用pH梯度法將DOX封裝到TSL中[6,7];將脂質體懸浮液的外部溶液通過透析3 h替換為PBS，交換3次500 ×體積PBS。脂質體懸液和DOX在DOX與脂質比為0.05 (w/w)的條件下混合，混合物在37℃下孵育90分鍾。如上述鈣黃素，用凝膠色譜法去除未被包裹的DOX。

DOX釋放量的測定:還利用DOX熒光[18]的自猝滅現象測定了DOX的釋放。簡而言之，將含有DOX的脂質體溶液200µL懸浮液加入微管200µL PBS中。從懸浮液中獲得的樣品在每個溫度下孵育20分鍾，從27°C開始，使用塊培養箱(BI-516S, ASTEC Co.， Ltd, Fukuoka, Japan)，逐漸增加到34、36、38、40、42、44°C，然後將樣品放置在96孔板中測量熒光強度。熒光強度測量使用平板閱讀器(F-7000，日立公司，東京，日本)，激發波長為485 nm，發射波長為590 nm。從TSLs中釋放DOX的百分比由公式1計算。溫度和DOX釋放之間的關係也使用如上所述的sigmoid函數進行擬合。

幻影實驗

MPI係統:我們的MPI係統的細節在我們之前的論文中有描述[16,17,20-23]。簡而言之，無電場線是由兩個相對的釹磁鐵產生的。驅動磁場是通過激勵線圈(電磁線圈長100mm，內徑80mm，外徑110mm)產生的。交流電源由可編程電源(EC1000S, NF Co.，神奈川，日本)提供給勵磁線圈，並使用數字函數發生器(DF1906, NF Co.，神奈川，日本)產生的正弦波進行控製。驅動磁場的頻率為400 Hz，驅動磁場的峰對峰強度為20 mT。通過梯度儀線圈(50 mm長，35 mm內徑，40 mm外徑)檢測mnp產生的信號，並使用前置放大器(T-AMP03HC, Turtle Industry Co.， Ibaragi, Japan)和鎖相放大器(LI5640, NF Co.， Kanagawa, Japan)提取三次諧波信號。鎖定放大器的輸出通過連接到具有通用串行總線端口的多功能數據采集設備(USB-6212, National Instruments Co.， TX, USA)的個人計算機轉換為數字數據。采樣時間為10 ms。當使用梯度儀線圈測量信號時，樣品被放置在距離梯度儀線圈中心12.5毫米(即線圈長度的四分之一)的地方，線圈(包括樣品)被移動，使樣品的中心與無電場線的位置一致。選擇磁場是由兩個相對的釹磁鐵(Neomax Engineering Co.，群馬市，日本)產生的。在兩塊釹磁體的中心可產生無場線。 To acquire projection data for image reconstruction, both the sample and the receiving coil were automatically rotated around the z-axis over 180° in steps of 5° and translated in the x-direction from −16 mm to 16 mm in steps of 1 mm, using an XYZ-axes rotary stage (HPS80-50X-M5, Sigma Koki Co., Tokyo, Japan), which was controlled using Lab VIEW (National Instruments Co., TX, USA). Data acquisition took about 12 min. Each projection data set was then transformed into 64 bins by linear interpolation. Both the inhomogeneous sensitivity of the receiving coil and feed through interference were corrected using the method described in [23]. Transverse images were reconstructed from the projection data using the ML-EM algorithm over 15 iterations, in which the initial concentration of MNPs was assumed to be uniform [16,17].

MH係統:我們的MH裝置的細節在我們之前的論文中有描述[21,24]。簡而言之，AMF是使用一個由19個轉環(直徑6.5厘米，長10厘米)銅管(直徑5毫米)組成的外部線圈產生的。這是由水冷卻，以確保恒定的溫度和阻抗。線圈通過阻抗調諧器(T020-5723AHE, Thamway Co.，靜岡縣，日本)連接到電源(T162-5723BHE, Thamway Co.，靜岡縣，日本)。該係統在輸出功率為500 W時，產生了峰值振幅為3.7 kA/m的AMF。AMF的振幅可以通過改變電源的輸出來控製。在本研究中，AMF的頻率和峰值振幅分別為600 kHz和3.5 kA/m。

封裝MNPs和鈣黃素的TSLs的製備:首先，20 mg由DPPC和Brij78組成的脂質混合物^®摩爾比為96:4時在室溫下溶於乙醇中。用旋轉蒸發器除去溶劑，直到在圓底燒瓶中形成薄膜，然後幹燥24小時。薄膜在65℃下與鐵濃度為43.8 mg/mL至70.2 mg/mL的M-300 PBS溶液和鈣黃素溶液(10 mM)水化。超聲處理5 min，超聲處理間隔1 min重複4次。為了去除未被包裹的鈣黃蛋白，在等滲NaCl溶液中透析7次，透析2 h。未被包裹的MNPs通過PBS洗滌和0.1 μm Amicon低結合Durapore過濾去除^®PVDF膜(Ultrafree, Millipore Co.， MA, USA)使用2000 rpm離心15分鍾。這些過程重複三次。最後，收集濾器上下的水溶液。我們將封裝MNPs的TSLs稱為“磁性TSLs”。我們也將過濾器上方和下方的水溶液分別稱為“負載鈣黃素的磁性TSL溶液”和“TSLs外的水溶液”。

封裝MNPs和鈣鈣素的TSLs的MPI:將負載鈣黃素的磁性TSL溶液和上述TSLs外的水溶液分別放入圓柱形聚乙烯管(直徑6mm，長5mm，體積100 μL)中，並使用我們的MPI掃描儀進行如上描述的成像。MPI研究結束後，我們在MPI圖像上畫出與聚乙烯管截麵積(115像素)相同麵積的圓形感興趣區域(ROI)，並計算該ROI內的平均MPI值。本研究將MPI值定義為三次諧波信號重建的橫像像素值[16,17]。

磁性TSLs中淨鐵濃度的測定:根據Frascione等人[25]發表的程序，使用硫氰酸鉀法測定磁性TSLs中的淨鐵濃度。首先，將脂質體溶液的20µL與1% Triton X-100的5 μL混合，打破脂質體膜，釋放MNPs;然後在樣品中加入體積為0.225 mL的濃縮鹽酸(37%)，使氧化鐵晶芯電離，使處於鐵態的鐵釋放出來。樣品在0.250 mL 40 mM硫氰酸鉀溶液中孵育幾分鍾。用microplate absorbance分光光度計(xMark)讀取480 nm波長處的吸光度^TMBio-Rad Laboratories Inc.， CA, USA)。鐵的水溶液_3.O₄用於記錄校準曲線。

測量MH引起的溫升和鈣黃素釋放:我們還calcein-loaded磁TSL加熱解決方案在總量(1毫升)30分鍾MH(21日24)使用我們的係統在一個AMF 600 kHz的頻率和振幅峰值3.5 kA / m,並測量溫度上升的時間進程(ΔT (T))使用fluorescence-type光纖溫度計(fl - 2000,本公司有限公司,東京,日本)每1分鍾30分鍾後MH的開始。然後,ΔT (T)被安裝到現象學Box-Lucas方程給出的方程3 [26],

$ $ \δT \ \左(T \) \ = \ T \ \左(T \) \ \, T左(0 \)\ \ = \ \ * \離開({1 \ - e {\, ^ {- Bt}}} \ )\,\,............\左(3 \右)$$

其中T(T)和T(0)分別是T和0時刻的溫度，A和B是常數。該方程常用於描述AMF[16]對MNPs的加熱。擬合參數的乘積A × B相當於時變溫升的初始斜率(ΔT/Δt)。₀，即式4

$ ${\離開({\δT \ / \ \δT} \右)_0}\,= \ \ * \ B \,\,............\左(4 \右)$$

我們調查了平均MPI值、溫升和(ΔT/Δt)之間的相關性。₀與鈣黃素磁性TSLs的淨鐵濃度有關。

將負載鈣黃素的磁性TSL溶液加熱後，我們用透析法代替自猝滅現象和凝膠色譜法測定鈣黃素的釋放。在測量過程中，溶液與等滲NaCl溶液透析2 h。透析外部溶液的樣品放置在96孔板中，使用平板閱讀器在激發波長485 nm和發射波長520 nm下測量熒光強度。為了測量鈣黃素的最大釋放量，樣品在50°C下使用塊狀培養箱(BI-516S, ASTEC Co.， Fukuoka, Japan)培養20分鍾。請注意，50°C的孵育溫度是由鈣黃素釋放量測定結果確定的。由式5計算加載鈣黃素的磁性TSLs釋放鈣黃素的百分比

$ $發布\左(\ % \右 )\, = \,{{{ f {AMF}} \, - f {{F_b}}在{{\ 50 }}\, - \,{ F_b}}} \ \ * \, 100 \,............\左(5 \右)$$

F_b和F_AMF分別為未暴露於AMF和暴露於AMF時TSL溶液的熒光強度₅₀為在50℃下培養20分鍾的樣品的熒光強度。如前所述，使用sigmoid函數擬合了溫升與鈣黃素釋放之間的關係以及MPI平均值與鈣黃素釋放之間的關係。

動物實驗

負載MNPs和DOX的TSLs的製備:裝載dox的磁性TSLs是根據前麵描述的程序製備的，並進行了一些小的修改[6,7]。將DPPC和Brij78組成的脂質混合物製成薄膜^®添加280 mM硫酸銨(pH 4-4.5)和鐵濃度為70.2 mg/mL的M-300，在65°C下水化。將懸浮液超聲並冷卻至室溫後，如前麵所述，通過pH梯度法[6,7]將DOX封裝到懸浮液中。在這種情況下，懸浮液和DOX在DOX /脂質比為0.2 (w/w)的情況下混合。為了去除未被包裹的DOX，將溶液與等滲NaCl溶液透析2 h。未被包裹的MNPs用PBS洗滌，並用0.1 μ m Amicon低結合Durapore過濾^®PVDF膜(Ultrafree, Millipore Co.， MA, USA)使用2000 rpm離心15分鍾。這些過程重複三次。

動物:所有的動物實驗都得到了大阪大學醫學院動物倫理委員會的批準。7周齡雄性BALB/c小鼠購自日本Charles River Laboratories, Inc.(神奈川，日本)，實驗前一周適應飼養環境。這些動物可以免費獲得食物和水，並被保存在標準的實驗室條件下，室溫22- 23°C，濕度約50%，明暗周期為12:12小時。結腸-26細胞(1 × 10⁶細胞)在麻醉下，用戊巴比妥鈉(Somnopentyl, kyyoritsu Seiyaku Co.， Tokyo, Japan) (0.012 mL/g體重)皮下植入每隻小鼠背部。

每天用卡尺測量所有小鼠的腫瘤體積。腫瘤體積(V in mm^3.)計算為式6。

$ $ V \ = \ \離開({\π\ / 6}\)\ \,{L_x} \ * {L_y} \ * {L_z }\,............\左(6 \右)$$

L在哪裏_x,我_y，和L_z分別用毫米表示垂直直徑、水平直徑和高度。相對腫瘤體積生長(RTVG)由式7計算。

$ $ RTVG \ = \ {{V - {V_0}}在{{V_0 \ }}}\,............\左(7 \右)$$

在V₀為MH前腫瘤體積，本研究以MH後RTVG值作為MH治療效果的指標。

實驗的程序

當腫瘤體積達到約100mm時^3.將小鼠分為4組(A、B、C、D)，其中A組小鼠在腫瘤中直接注射生理鹽水作為對照組(n=10);B組小鼠直接向腫瘤內注射dox負載的磁性TSLs，未發生MH (n=7);C組小鼠直接在腫瘤內注射磁性TSLs後進行MH (n=7);D組小鼠直接在腫瘤內注射dox負載的磁性TSLs，然後進行MH (n=7)。B組和D組在麻醉下以5 mg DOX/kg的劑量直接向腫瘤內注射DOX負載磁性TSLs。在注入dox加載的磁性TSLs 10分鍾後，MPI圖像以與幻影實驗相同的方式獲得。在本研究中，每隻小鼠獲得了最大信號強度的MPI圖像切片。MPI研究結束後，使用4排多層CT掃描儀(Asteion, Toshiba醫療係統公司，Tochigi, Japan)獲得x射線CT圖像，管電壓為120 kV，管電流為210 mA。MPI圖像與x射線CT圖像使用放大和旋轉參數進行共配準，這些參數之前是使用一個有3個直徑為0.5 mm的點源並填充100 mm Fe MNPs的幻影獲得的。在C組和D組，在注射磁性TSLs或dox加載磁性TSLs 30分鍾後，使用600khz和3.5 kA/m的AMF持續20分鍾進行MH。在MH前後立即使用紅外體溫計(FLIR E4, FLIR Systems Inc.， or, USA)測量腫瘤表麵的溫度。

統計分析

在幻影實驗中，我們計算了在MPI圖像上繪製的直徑為6 mm的感興趣區域(ROI)內的平均MPI值。磁性TSLs中淨鐵濃度與平均MPI值、溫升和(ΔT/Δt)的相關性₀采用線性回歸分析，計算相關係數和回歸方程。平均MPI值與(ΔT/Δt)的相關性₀采用線性回歸分析，而MPI平均值與溫升之間的相關性則采用前文所述的唯象Box-Lucas方程[26]。

在動物實驗中，我們取提取腫瘤輪廓的閾值為ROI內MPI最大值的40%，計算出腫瘤繪製的ROI內的平均MPI值。用唯象學Box-Lucas方程[26]分析了平均MPI值與溫升之間的關係。

除特別說明外，平均MPI值、溫升、腫瘤體積、RTVG值均用平均值±標準誤差(SE)表示。組間RTVG值比較采用單因素方差分析(ANOVA)。采用Tukey-Kramer多重比較檢驗確定差異有統計學意義。P值小於0.05被認為有統計學意義。所有分析均使用Excel 2010 (Microsoft Co.， WA, USA)進行。

結果

溫度依賴性鈣黃素和DOX的釋放

為了研究TSLs的熱敏性，在孵卵20分鍾後測量TSLs中溫度依賴性鈣黃素和DOX釋放量。圖1a是由式(1)計算出的TSLs釋放鈣黃素百分比與溫度的關係，圖1b是DOX的情況。從TSLs中釋放的鈣黃素在38-40°C時急劇增加，隨後趨於穩定，而在27-36°C時幾乎為零(圖1a)。DOX釋放的溫度依賴性與鈣黃素釋放的溫度依賴性相似(圖1b)。

幻影實驗

圖2a顯示了一個模型，它有兩個圓柱形聚乙烯管(直徑6mm，長5mm，體積100 μL)，填充TSLs外的水溶液(左)和包括MNPs和鈣黃素的TSL溶液(右)。圖2b-2f顯示了在負載鈣黃素的磁性TSLs中，硫氰酸鉀法測定的淨鐵濃度分別為3.9 mg/mL (b)、5.8 mg/mL (c)、6.8 mg/mL (d)、9.5 mg/mL (e)和12.0 mg/mL (f)時的幻影MPI圖像示例。如圖2所示，在所有情況下，左管的MPI像素值幾乎為零，而右管的MPI像素值隨著鐵濃度的增加而增加。

圖1:(一)溫度與熱敏脂質體(TSLs)釋放鈣黃素百分比的關係由式1計算。(b)溫度與TSLs釋放阿黴素(DOX)百分比之間的關係由公式1計算。當n=3時，數據用平均值±標準誤差(SE)表示。

圖2:有兩個圓柱形聚乙烯管(直徑6毫米，長度5毫米，容量100 μ L)的模型示意圖，填充下麵的水溶液(TSLs外的水溶液)(左)和上麵的過濾器，用於去除未封裝的MNPs(鈣鈣磁性TSL溶液)(右)(一)當磁TSLs中硫氰酸鉀法測定的淨鐵濃度為3.9 mg/mL時，幻影的MPI圖像示例(b)， 5.8 mg/mL(c)， 6.8 mg/mL(d)， 9.5 mg/mL (e)， 12.0 mg/mL (f)。注意:裏麵的虛線圈(b) - (f)舉例說明聚乙烯管。比例尺=10毫米。

圖3顯示了用熒光型光纖溫度計測量的含鈣磁性TSL溶液中溫升的時間過程。這些符號〇，●，Δ，▲，□顯示磁性TSLs中鐵的淨濃度分別為3.4±1.0 mg/mL (n=4時的平均±標準差(SD))、4.8±2.8 mg/mL、7.5±3.1 mg/mL、8.9±1.8 mg/mL和11.5±1.6 mg/mL。如圖3所示，溫度上升隨鐵濃度的增加而增加。

圖4a-4c顯示了加載鈣黃素的磁性TSLs中淨鐵濃度與平均MPI值、淨鐵濃度與溫升、淨鐵濃度與(ΔT/Δt)的關係。₀,分別。如圖4所示，在所有情況下均存在顯著相關性，淨鐵濃度與(ΔT/Δt)之間的相關係數為₀最高(r=0.944)。

圖5a顯示了平均MPI值與溫升的關係，圖5b顯示了平均MPI值與(ΔT/Δt)的關係₀．需要注意的是，在分析平均MPI值與溫升之間的相關性時，使用了前麵描述的現象學Box-Lucas方程[26]，而平均MPI值與(ΔT/Δt)之間的相關性₀采用線性回歸方程進行分析。如圖5所示，平均MPI值與溫升顯著相關(r=0.915)和(ΔT/Δt)₀(r = 0.923)。

圖6a是由公式5計算的加載鈣黃素磁性TSLs的溫升與鈣黃素釋放百分比的關係，圖6b是平均MPI值與鈣黃素釋放百分比的關係。鈣黃素負載磁片的鈣黃素釋放量符合s型函數，隨溫度升高和平均MPI值的增加而急劇變化。

圖3:用熒光型光纖溫度計測量磁性TSLs溶液中溫升的時間過程。〇、●、Δ、▲、□分別表示磁性TSLs中鐵的淨濃度為3.4±1.0 mg/mL (n=4時的平均值±標準差)、4.8±2.8 mg/mL、7.5±3.1 mg/mL、8.9±1.8 mg/mL、11.5±1.6 mg/mL時的情況。當n=4時，數據用平均值±標準差表示。

圖4:(一)磁性TSLs中淨鐵濃度與平均MPI值的關係。(b)磁性TSLs中淨鐵濃度與溫升的關係。(c)磁性TSLs中鐵的淨濃度與溫度上升的初始斜率之間的關係(ΔT / TΔ)₀．

圖5:(一)平均MPI值與溫升的關係。(b)平均MPI值與(ΔT/Δt)的關係₀．

圖6:(一)溫度升高與磁性TSLs鈣黃素釋放率的關係。(b)平均MPI值與鈣黃素釋放的關係。
注意實線表示使用sigmoid函數的擬合曲線。

動物實驗

圖7顯示了典型的MPI圖像:荷瘤小鼠注射了鐵濃度為12.0 mg/mL，體積為500 μL的dox磁性TSLs，疊加在x射線CT圖像上。如圖7所示，在兩例病例中，MPI得到的MNPs分布與x線CT圖像中腫瘤的分布具有良好的相關性。

圖8a和圖8b顯示了分別在MH開始前和20分鍾後用紅外測溫儀獲得的注射了dox磁性TSLs的荷瘤小鼠的熱圖像。MH開始20分鍾後，腫瘤表麵溫度從30.9±2.8°C上升到41.6±3.4°C(平均±SD)，而其他區域的溫度沒有明顯上升。最高溫度在38到47°C之間，持續了至少10分鍾。

圖7:典型的MPI圖像:荷瘤小鼠注射了鐵濃度為12.0 mg/ mL、體積為500 L的dox磁性TSLs，並將其疊加在x射線CT圖像上。比例尺=10毫米。

圖8:荷瘤小鼠注射dox磁性TSLs的熱圖像，在此之前通過紅外測溫儀獲得(一)MH開始後20分鍾(b)．注意，顯示的最低和最高水平分別設置為20°C和40°C。

圖9顯示了MH開始20分鍾後，注入DOX磁性TSLs(●)和紅外體溫計測量的無DOX磁性TSLs(〇)的腫瘤表麵溫升的平均MPI值與腫瘤表麵溫升的關係，使用現象Box-Lucas方程[26](r=0.690)進行回歸分析，兩者之間存在顯著相關性。

圖10顯示了A組(□)、B組(〇)、C組(■)、D組(●)中RTVG值的時間曆程。A組與B組在給藥後2 ~ 5 d有顯著性差異。A組與C組在給藥後3天、5 ~ 7天也有顯著性差異。A組與D組、C組與D組在給藥後1天及以上有顯著性差異。在整個研究期間，B組和C組之間無顯著差異。B組與D組在給藥後2 ~ 9天、11天及以上有顯著性差異。

討論

在目前的研究中，我們開發了鈣黃素和dox負載的磁性TSLs，並研究了使用MPI可視化它們的可行性在體外而且在活的有機體內以及MH誘導DOX釋放化療的療效在活的有機體內．我們的結果(圖1-10)表明我們的磁性TSLs可以應用於MPI和MH作為納米載體。脂質體具有顯著的能力，將藥物運送到所需的靶點，並通過包裹藥物降低藥物毒性。TSLs是與局部熱療結合時最具吸引力的癌症治療納米載體之一，因為它們可以在高溫條件下(40-42℃)通過適度升高溫度破壞脂質體膜釋放被包裹的藥物[1,6]。因此，許多人嚐試將TSLs與局部熱療結合，並在荷瘤小鼠上研究其有效性[27,28]。一些臨床試驗也使用由DPPC和DOX (ThermoDox)組成的TSLs^®， Celsion Co.， NJ, USA)[29,30]。

在AMF的刺激下，MNPs可以用作熱源。Tai等人[31]開發了包覆右旋糖酐氧化鐵納米顆粒的磁性TSLs (Resovist^®)和羧基熒光素，並證實了MH[31]誘導的藥物釋放。雖然他們用的是Resovist^®由於磁流體(M-300)的可用性，我們在本研究中使用了磁流體(M-300)作為MNPs的來源。MNPs可以用作MRI造影劑，因此可以用MRI[13]可視化包裹MNPs的脂質體。然而，當使用傳統的T2*加權成像序列時，由於敏感性引起的MR信號丟失，圖像對比度降低(負對比度)。目前，MPI作為一種MNPs成像方法受到廣泛關注。MPI可以在正對比中成像MNPs的空間分布[20-22]。如果我們能夠開發出包封MNPs和抗癌藥物的TSLs，我們可能會期望MPI的診斷和MH誘導的藥物釋放的治療可以結合起來。

如圖1a所示，在大約38-40°C孵育20分鍾後，裝載鈣黃素的TSLs的鈣黃素釋放急劇增加，隨後趨於穩定，而在體溫附近(36°C)沒有顯著釋放。我們的鈣黃素負載的TSLs最終在42°C釋放大約100%的鈣黃素。Tagami等[6,7]開發了由DPPC和Brij78組成的hat脂質體^®摩爾比是96:4。hat脂質體具有Gd-DTPA對比增強MRI和伴隨熱療的藥物釋放的最佳配方。Tagami等[6,7]報道了hat -脂質體在40-42°C下比低溫敏感脂質體(LTSL)配方具有更多的藥物釋放，並表現出與LTSL配方相似的血液藥代動力學。如圖1b所示，我們的DOX負載TSLs在42℃孵育20分鍾後，約100%的DOX釋放，而在較低溫度(27-36℃)下沒有顯著的DOX釋放。這種溫度依賴性的DOX從我們的DOX負載的TSLs釋放與鈣黃素從我們的鈣黃素負載的TSLs釋放相似(圖1a)。如前所述，本研究使用pH梯度法將DOX封裝到TSLs中[6,7]。以上結果表明，pH梯度法可以有效地將DOX封裝到TSLs中。

本研究中開發的磁性TSLs可以通過我們的MPI掃描儀在正對比中成功可視化(圖2)。據我們所知，這是第一份顯示磁性TSLs可以使用MPI可視化的報告。我們之前報道過MPI平均值與MNPs[20]的鐵濃度有很好的線性相關性。因此，圖2所示的幻影中左側管的MPI值遠低於右側管，這一事實似乎表明，幾乎所有未包覆的MNPs都是通過PBS反複洗滌和離心過濾去除的。

我們可以觀察到在體外(圖3)和磁性TSLs中MH誘導的溫升在活的有機體內(圖8)。此外，溫度上升隨著鐵濃度的增加而升高(圖4)，表明MNPs成功地以濃度依賴的方式封裝到TSLs中。如前所述，我們使用硫氰酸鉀法定量了磁性TSLs中的淨鐵濃度，由此得到的淨鐵濃度與平均MPI值(r=0.912)、溫升(r=0.937)和(ΔT/Δt)具有顯著相關性。₀(r=0.944)(圖4)。注意(ΔT/Δt)₀通過擬合溫升的時間過程(圖3)與現象學Box-Lucas方程[26]得到。如圖5所示，平均MPI值與溫升也有顯著的相關性(r=0.915)和(ΔT/Δt)₀(r = 0.923)。這些結果表明，可以通過改變磁性TSLs中包覆的MNPs的鐵濃度來控製MH誘導的溫升，這將有助於減少MH的副作用和對周圍健康組織的傷害。這些結果也表明，我們的MPI掃描儀可以利用平均MPI值來估計磁性TSLs中的鐵濃度，並預測MH誘導的溫升。

如前所述，當我們在幻像實驗中測量磁性TSLs的鈣黃素釋放時，未被包裹的鈣黃素和未被包裹的MNPs分別通過重複透析和PBS重複洗滌和離心過濾去除，而不是使用凝膠色譜。這主要是因為如果我們使用凝膠色譜法去除未被包裹的鈣黃素和MNPs，磁性TSLs的濃度被大大稀釋，因此我們的MPI掃描儀無法檢測到磁性TSLs。如圖6a所示，MH誘導的鈣黃素釋放與溫升之間的關係很好地符合s型函數關係，如圖1a所示。盡管鈣黃素釋放量與平均MPI值之間的關係也符合sigmoid函數，但數據的散點很大(圖6b)。數據的大量分散可能是由於上述重複透析和/或洗滌和過濾的可重複性較低。如圖6b所示，MH誘導的鈣黃素釋放量隨MPI平均值的增加呈階梯函數式急劇增加，說明MPI平均值可以用來預測MH誘導的磁性TSLs藥物釋放的閾值。

最後，我們進行了動物實驗，以探討我們的磁性TSLs實際應用的可行性。我們通過將小鼠結腸-26細胞皮下接種到小鼠背部製備了荷瘤小鼠。如圖7所示，我們的MPI掃描儀可以在正對比中可視化腫瘤中dox負載磁性TSLs的空間分布。MPI的這種出色的可視性將有助於癌症的診斷。當與MPI結合時，我們裝載dox的磁性TSLs也將提供關於腫瘤位置的有用信息。如圖9所示，使用現象學Box-Lucas方程[26]分析，MPI平均值與溫升顯著相關(r=0.690)，說明我們的MPI掃描儀可以預測MH誘導的腫瘤溫升，這將有助於監測和預測MH誘導的藥物釋放對化療的治療反應。

當負載dox的磁性TSLs注射到腫瘤中並應用MH (D組)時，RTVG值明顯低於注射生理鹽水而不應用MH (A組)(圖10)，說明我們的負載dox的磁性TSLs與MH的結合在癌症治療中是有用的。D組的RTVG值也顯著低於注射dox磁性TSLs而未注射MH (B組)後2 ~ 9天和11天以上(含11天)。這一結果似乎說明了MH誘導的含DOX磁性TSLs釋放的DOX具有治療作用，但B組的RTVG值有低於a組的趨勢(兩者在注射含DOX磁性TSLs或生理鹽水後2 ~ 5天有顯著差異)。這可能是由於在體溫下，DOX負載的TSLs中有一些DOX的泄漏。如前所述，DPPC與Brij78的摩爾比^®本研究中TSLs的製備比例為96:4。通過改變DPPC與Brij78的摩爾比可以減少上述泄漏^®．這些研究目前仍在進行中。

本研究的一個局限性是，為了在腫瘤中積累盡可能多的MNPs和DOX，將負載DOX的磁性TSLs直接注射到腫瘤中。如果負載dox的磁性TSLs隻吸附在腫瘤上，它們就可以通過靜脈注射給藥。在考慮實際應用時，這個特性非常重要。然而，由於給予的磁性TSLs被動遷移到單個核吞噬細胞係統，如肝髒和脾髒的Kupffer細胞，被動靶向是建立癌症治療的一個非常重要的問題。Shido等人[32]和Motoyama等人[33]開發了磁鐵礦陽離子脂質體(MCLs)，用於改善腫瘤內的吸收和積累特性，因為MCLs在脂質體表麵具有正電荷。然而，目前MCLs的應用僅限於直接注射入腫瘤。脂質體膜偶聯抗體可能是磁性TSLs主動靶向腫瘤的一種可能方法。因此，我們將在未來開發具有腫瘤特異性靶向能力的抗體共軛磁性TSLs。

圖9:MH開始20分鍾後，注射dox磁性TSLs(●)和紅外體溫計測得的磁性TSLs(〇)的腫瘤表麵溫升與平均MPI值的關係。

圖10:A、B、C、d組腫瘤相對體積生長(RTVG)的時間曆程定義為(V-V₀) / V₀與V₀V分別為注射藥物前後的腫瘤體積。A組(□)小鼠腫瘤內直接注射生理鹽水作為對照組(n=10);B組(〇)小鼠直接向腫瘤內注射含有dox的磁性TSLs，未發生MH (n=7);C組(■)小鼠直接在腫瘤內注射磁性TSLs後進行MH (n=7);D組(●)小鼠直接在腫瘤內注射dox負載的磁性TSLs，然後進行MH (n=7)。數據用平均值±標準差表示。$: A組和B組之間p<0.05， #: A組和C組之間p<0.05， *: A組和D組之間p<0.05，§:B組和D組之間p<0.05，¶:C組和D組之間p<0.05。

結論

我們開發了鈣黃素和dox負載的磁性TSLs，並可以使用MPI在體外和體外可視化它們在活的有機體內．我們的研究結果表明，它們是納米醫學中有用的藥物遞送納米載體。我們的研究結果還表明，MPI有助於增強封裝抗癌藥物的磁性TSLs釋放藥物的化療療效，因為MPI可以在正對比中可視化磁性TSLs，並允許我們量化磁性TSLs中的鐵濃度，以預測MH誘導的藥物釋放。

確認

本研究得到了日本科學促進會(JSPS)科學研究資助基金(資助號:25282131)的支持。

權益聲明書

作者沒有報告任何利益衝突。

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文章類型:研究文章

引用:Maruyama S, Shimada K, Enmeiji K, Murase K(2016)基於熱敏脂質體的磁性納米載體的開發及其磁粒子成像可視化。納米外科2(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-3206.111

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出版的曆史:

收到日期:2016年2月23日

接受日期:2016年3月31日

發表日期:2016年4月04日