殼聚糖的n -脫乙酰化和表征:對優化的納米給藥係統的影響

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研究文章

喬杜裏年代V Kusum Devi^＊Raichur V

Al Ameen藥學院藥劑學係，Hosur大道，近Lalbagh大門，印度班加羅爾- 56027

*通訊作者:V Kusum Devi, Al Ameen藥學院藥劑學係，Hosur大道，Lalbagh大門附近，班加羅爾- 560 027，印度，電話:+91 93428 59850;電子郵件:drvkusumdevi4@gmail.com

摘要

背景:已嚐試將天然聚合物(殼聚糖)改性為其去乙酰化形式，以增強其物理化學性質，並改進納米顆粒遞送係統的穩定性和可重複性。

摘要目的:殼聚糖的脫乙酰化是通過去除分支乙酰基來進行的，目的是提高聚合物顆粒給藥係統的穩定性，增強物理和工藝依賴性能。同時，製備了脫乙酰殼聚糖載藥納米顆粒，以確定其對配方工藝和穩定性的影響。

材料和方法:殼聚糖是聚[(1,4)-2-氨基-2-脫氧-d -吡喃葡萄糖]，是n -乙酰-d -葡萄糖胺和d -葡萄糖胺(主鏈)的共聚物。采用改良堿還原法進行n -脫乙酰，脫乙酰率≥99%。隨後對納米顆粒進行了製備和表征。

結果與討論:實現聚合物表征:物理參數、溶解度、脫乙酰度、粘度和結晶度顯示所需性能。此外，基於應用的評估，即篩選和優化具有表征和體外釋放行為的納米顆粒的製備。

結論:殼聚糖性質的理想變化以及隨後製備的納米顆粒的再現性，為廣泛研究改性現有天然聚合物以降低成本和提高商業化概率的再現性鋪平了道路。

關鍵字

脫乙酰度;聚合物納米粒子;離子凝膠化;響應麵圖;探測聲波降解法

簡介

聚合物納米顆粒是最有前途的新型藥物遞送係統，具有更強的藥物攜帶能力。它甚至可以將最複雜的活性部分合並到其核心中，或者均勻分布在整個矩陣[1]中。

目前用於該體係的主要聚合物作為主要載體的範圍從天然到半合成，並進一步向先進的化學合成類型發展[2,3]。但天然獲得的聚合物(如殼聚糖、海藻酸鈉等)的最大優勢是它們容易獲得、成本效益高，最重要的是它們無毒。盡管如此，這些聚合物缺乏純度(由於天然來源)，不利的物理化學性質(如溶解度差，粘度高，流動性差。等)，在這樣的層麵上，這些問題最終導致難以獲得可重複性(在製備新型給藥形式時)[4-6]。

在此背景下，本研究選擇了殼聚糖，通過在分子水平上進行改變來增強其理化性質。殼聚糖是一種(1-4)鏈的2-氨基-2-脫氧-d -葡聚糖，是n -脫乙酰甲殼素衍生物。它是一種功能性線性聚合物，在多種形式的藥物輸送中引起了越來越多的興趣，通常無毒無刺激性，具有明確的生物相容性[7,8]。殼聚糖分子鏈的修飾，即去除支鏈乙酰基導致氨基的暴露，氨基的暴露直接增加了溶解度，降低了理想粘度[9]。因此，商業殼聚糖的去乙酰化延緩了聚合物的穩定性問題，這是在進一步增強物理化學性質的顆粒給藥係統的配方過程中出現的問題。商業殼聚糖大約是70-75%脫乙酰。一般來說，脫乙酰的程度主要取決於堿的濃度、反應的溫度和時間、顆粒的大小和密度。采用改進的脫乙酰工藝，脫乙酰率≥99%，主鏈降解量最小。因此，人們開始嚐試製備具有優異理化性能的完全脫乙酰殼聚糖[10,11]。

結核病和新出現的耐藥結核病現在發現廣泛的納米顆粒藥物輸送係統被強調研究。因此，其唯一的一線藥物之一，即異煙肼(INH)被選為模型藥物，負載在表征脫乙酰殼聚糖納米顆粒中，以證明所實現的應用導向效益。

所需的材料

殼聚糖，65-75%脫乙酰，C1 (Himedia Pvt. Ltd.，印度);冰醋酸(S D Finechem Pvt. Ltd.，班加羅爾，印度);氫氧化鈉顆粒，NaOH (Finar India Pvt. Ltd.)班加羅爾);亞硝酸鈉，納米₂(Finar印度私人有限公司班加羅爾);鹽酸，HCl (S D Finechem Pvt. Ltd.，班加羅爾，印度);三聚磷酸鈉，STPP (isco Research Laboratories Pvt. Ltd.， India);透析管，12-14 kDa分子量截止(Himedia Pvt. Ltd.，印度)。

方法

脫乙酰殼聚糖的製備

按照Moghaddamet et al.[13]所解釋的方法，經優化修飾後對中分子量殼聚糖(C1)進行解聚，得到脫乙酰殼聚糖。首先將殼聚糖溶解在6% v/v的冰醋酸中，得到2% v/v的冰醋酸溶液。加入10 mL納米後得到改性脫乙酰殼聚糖₂(7.0 mg/mL蒸餾水)加入到溶解的殼聚糖溶液中，在室溫下磁攪拌。近1小時後，通過加入NaOH (4 N)將pH值提高到9.0，將解聚的殼聚糖析出。將白色淡黃色固體塊過濾，用丙酮洗滌幾乎三次，然後用最小體積的冰醋酸(0.1 N)溶解，隨後用純化水透析進行純化。透析後的產品最終使用冷凍幹燥機(operfbd -5503;Operon公司，韓國)。得到的淡黃色凍幹產品保存在4°C，直到進一步需要(圖1)[14]。

脫乙酰殼聚糖和商業殼聚糖的評價

感官的特性:對製備的脫乙酰殼聚糖與市售殼聚糖在顏色、氣味、外觀等物理性能上的變化進行了直觀比較。

流動特性(%壓縮性，休止角和流速):采用攻絲法測定鬆密度(g/cc)和鬆體積(cc/g)。將精確稱量的樣品通過漏鬥小心地倒入刻度圓筒中，用或不用敲擊[15]記錄體積。進一步，用堆積密度的值來確定

可壓縮性百分比(或卡爾指數)，使用公式:

$ $ \θ \, = \,{\ 譚^{- 1}}\,{{的高\ \ \,堆\ (h)} \ /{的radious \ \ \,堆\ \,(p)}} $ $

用休止角(θ)來確定改性殼聚糖的流動時間和堆高，並與工業殼聚糖進行比較。然後，用公式(θ)測量角度值:

$$\% \， copresbility \， = \，{{點擊\，密度- \，未打開\，密度}\超過{點擊\，密度}}\乘以\，100$$

粘度(殼聚糖溶液流動阻力的變化)

粘度被定義為液體提供流動阻力的能力。製備了1%、2%、3%殼聚糖w/v強度的殼聚糖溶液。采用21號主軸測量(布魯克菲爾德型號DV-III+，布魯克菲爾德，美國)在250轉/分(25°C)的基礎上穩定的扭矩值。

紅外光譜研究，以確定脫乙酰程度

采用日本島津FTIR-ATR presti14000，采用溴化鉀(KBr)球團法對改性殼聚糖進行了FITR研究。在形成KBr顆粒之前，將樣品在100°C下完全幹燥1小時，然後用KBr:樣品混合物(99:1)壓製圓盤，並據此分析[15,17]。

P-XRD測定結晶性能的研究

利用DSC Q5000儀器對改性殼聚糖和商業殼聚糖進行了x射線衍射模式測定，衍射儀配有旋轉靶x射線管和廣角測角儀。x射線管的操作電位為50千伏，電流為150毫安。掃描的範圍(2θ)為0 ~ 70°C，掃描速度為每分鍾2°C，增量為0.02°C。對所得結果進行了解釋[15,16]。

用於製備載藥納米顆粒的商業和脫乙酰殼聚糖的篩選

篩選了幾種製備載藥殼聚糖納米顆粒的方法，以確定具有理想粒徑和多分散性指數(PDI)的配方參數。在此基礎上，通過將模型藥物異煙肼加入離子凝膠法製備了納米顆粒，並進行了關鍵的標準化修飾。

圖1:脫乙酰殼聚糖的製備原理圖。

殼聚糖是一種帶電荷的陽離子天然聚合物，可與各種交聯劑相互作用形成納米顆粒，如:戊二醛(但由於其對生物係統的毒性，特別是如果未反應的交聯劑仍然存在)，三聚磷酸鈉等。為了解決使用化學交聯劑的毒性作用，殼聚糖與多價陰離子即三聚磷酸鈉離子交聯。這種方法有幾個優點，因為它是一個溫和的過程，導致納米顆粒大小約200-400納米，並已被證明可以封裝不同的生物和活性化合物[14]。

改性(1)-離子凝膠化:首先，在20 mL 1% v/v的蒸餾水乙酸溶液中加入60 mg改性脫乙酰殼聚糖。加入異煙肼(INH)(殼聚糖添加量為90% w/w)攪拌至清澈溶液。將製備好的三聚磷酸鈉(STPP)溶液(w/w為殼聚糖的0.25%)以1200rpm的攪拌速度滴入10ml蒸餾水中。在STPP完全加入後，以2000 rpm的轉速進一步攪拌近1小時，以限製製備的納米顆粒的聚集。隨後，將製備好的納米顆粒進行10分鍾的探針超聲處理，最後對配方進行表征，以確定所需的性能[18,19,20]。

修飾(2)-調整pH值的離子凝膠:為了進一步提高期望的性能，對上述改性進行了進一步的修改。在該方法中，每一步都按照上次的修改進行，但這裏將製備的STPP的pH從11.0改為3-4，以增強製備過程中聚合物與STPP之間的離子相互作用。

改性(3)-表麵活性劑離子凝膠化:在修改-(2)中選擇的配方參數是令人滿意的;然而，為了滿足長期的穩定性，它被進一步發展。表麵活性劑在新型藥物傳遞平台中的應用已經得到了很好的應用。因此，選擇Tween 80作為典型的表麵活性劑來研究其在納米顆粒地層中的作用。在這種改性中，除了在離子相互作用發生之前在聚合物溶液中加入表麵活性劑(0.1%)外，每一步都保持不變。

改性離子凝膠法製備載異煙肼脫乙酰殼聚糖納米顆粒

經過上述改性的篩選，選擇改性(3)型製備載藥脫乙酰殼聚糖納米顆粒(見補充本附頁附圖10)。

出幾個工藝參數標準化;以下是確定參數的關鍵步驟:交聯時的攪拌速度(1200轉/分)，交聯後的攪拌速度(2000轉/分)，探頭超聲時間(10 + 10分鍾，間隔時間1分鍾)。在標準化的情況下，配方參數包括:醋酸濃度(1% v/v)和藥物濃度(與殼聚糖相比90% w/w)。

實驗設計

根據中心複合設計- CCD(限定型)的響應麵圖(RSD)，采用3²因子設計，允許同時評估兩個配方變量(A;殼聚糖和B的濃度;三聚磷酸鈉的濃度)在三個水平及其相互作用。采用相應配方的實驗設計(見表4)。選擇的因變量為粒徑(Y₁)和多分散指數(PDI) (Y₂)．篩選出的優化配方為9(9)個，對照4(4)個。

特性的研究

藥物包埋率、載藥量百分比、產率百分比、粒徑、PDI:取含10mg藥物的凍幹製劑，用乙醇溶液(水:乙醇=7:3)消化。將勻漿消化，15000rpm離心30 min。分離上清液，在263 nm處用UVVisible分光光度計分析，測定藥物含量。包封效率(%EE)和載藥量(%LC)由[19]給出。

$ $ \ % EE \ = {{{rm \{總}}\,{\ rm{量}}\,rm的{}}{\ \,{\ rm{藥物 }}\, - {\ rm總}{}\,{\ rm{量}}\,rm的{}}{\ \,rm{釋放}}{\ \,{\ rm{藥物}}}\ / {{\ rm總}{}\,{\ rm{量}}\,rm的{}}{\ \,{\ rm{藥物}}}}$ $

$ $ \ % LC \, = \,{{{\ rm總}{}\,{\ rm{量}}\,rm的{}}{\ \,{\ rm{藥物 }} - \,{\ rm總}{}\,{\ rm{量}}\,rm的{}}{\ \,rm{釋放}}{\ \,{\ rm{藥物}}}\ / {{\ rm總}{}\,rm{重量}}{\ \,rm的{}}{\ \,rm{納米粒子}}{\ \,{\ rm{采取}}}}$ $

對幹燥後的NPs進行精確稱量，並考慮飼料溶液製備中藥物和輔料的總用量，采用公式[19]計算產量(%YP)。

$ $ \ % YP \, = \,{{{\ rm{納米}}\,rm{獲得}}{\ \,{\ rm {(NPs)}}} \ / {{\ rm總}{}\,{\ rm{量}}\,rm的{}}{\ \,rm{藥物}}{\ \,{\ rm{輔料}}}}\ \倍,100 $ $

為了得到粒徑和PDI，將配方裝入比色皿中，並保存在樣品夾中。儀器首先在25°C溫度下穩定樣品20秒，然後開始連續掃描20次。給出了用該圖得到的結果。

多項式方程的發展

對公式進行優化，得到多項式方程。該方程導出了對所選響應(或依賴變量)的影響，即顆粒大小(Y₁)和PDI (Y₂)，當自變量殼聚糖濃度(A)和STPP濃度(B)的值按給定的速率依次改變時。方程以自變量正效應或負效應的形式給出數值。對結果進行分析後，可以直接用這個方程求任意自變量值的響應。一般為:

$ $ {Y_1} = \下午+ Z \ {Z_1} {Z_2}下午\ B \點 ......... 所以\ $ $

$ $ {Y_2 }\, = \, + 下午Z \ {Z_1} {Z_2}下午\ B \點 ......... 所以\ $ $

哪裏，Z, Z₁，和Z₂數值均為常數，經過優化得到實驗結果[21]。

表麵電荷(Zeta電位)的測定

電泳光散射法使用遷移率範圍±1的儀器(Zetasizer 300 HAS- Malvern Instruments, Malvern, UK)測定zeta電位。2 E-3厘米²/ V。電導率範圍可達200 mS/cm, zeta電位±150 mV，使用光學2激光(He-Ne)二極管，658 nm, 30 mW。溫度控製采用Peltier控製器。樣品分析采用Zeta細胞。將製劑(0.5-0.7 mL)裝入細胞中進行分析。

傅裏葉變換紅外光譜(FTIR)研究

利用FTIR光譜對所製備的純藥物和所選配方進行了藥物配伍性研究。島津FTIR-ATR Prestige采用KBr色散法記錄了異煙肼、物理混合物和選定配方的紅外光譜。使用幹KBr進行基線校正，並對結果進行解釋。樣品製備的方法與ii)-d節中提到的方法相同。

粉末x射線衍射研究

將純藥物的結晶度與所選配方的結晶度進行比較，以確定藥物和聚合物摻入形成NPs前後晶體行為的變化。樣品的分析方法與第ii)-e節中給出的相同。

差示掃描量熱法研究

類似於早期純藥物和物理混合物相容性測試，對純藥物和所選配方進行了測量。記錄藥物和含輔料的物理混合物的DSC熱圖(在40°C、75% RH保存2個月)。將所有樣品放入密封的鋁鍋中，以10o C min的加熱速率掃描^－1超過50-250°C的溫度範圍。得到的熱圖被解釋為[22]。

體外釋藥研究

在透析袋(玻璃紙膜，M.W. cut-off 10-12 kDa, Hi-Media，印度)中加入一定量的精選配方，即相當於10 mg的載異煙肼殼聚糖納米顆粒，並加入2 mL pH 7.4的磷酸鹽緩衝液。然後將透析袋懸浮在含有100 mL磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)的燒瓶中，在磁攪拌器上，37±0.5°C, 50 rpm。在特定的時間段(0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、30、36小時)提取所需數量(2 mL)的培養基，並在燒瓶中更換相同體積的新鮮緩衝培養基以保持恒定體積。使用磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)將容量瓶中提取的樣品配製至25 mL，並進行過濾。用紫外可見分光光度計(Shimadzu UV-Vis 1700)測定263 nm處的吸光度，分析濾液的釋藥情況。得到的結果以圖[19]的形式進行解釋和繪製。

為了研究藥物釋放的潛在機理，采用零級動力學、一級動力學和Higuchi動力學數學模型計算藥物釋放數據。為了定義一個更適合配方的模型，我們利用Korsenmeyer-Peppar方程對藥物釋放數據進行了進一步分析，並對所得結果進行了進一步解釋。

結果

i)脫乙酰殼聚糖和商業殼聚糖的評價

a)流動特性(壓縮百分比、休止角、流速)及粘度測量:(表1)

b) FTIR研究確定脫乙酰程度(圖2，表2)

c)通過P-XRD研究確定晶體性質(圖3)

ii)商業殼聚糖和脫乙酰殼聚糖製備載藥納米顆粒的篩選

對載藥脫乙酰殼聚糖納米顆粒進行修飾篩選，得到所需的粒徑和PDI範圍(表3)。

iii)改性離子凝膠法製備載異煙肼脫乙酰殼聚糖納米顆粒

a)粒徑與PDI的實驗設計(表4、圖4、5)

b)參數的實驗意義-方差分析結果(圖6)

iv)特性研究

a)藥物包埋率、產率、載藥量、粒徑、PDI、zeta電位(表5)

b)多項式方程的發展

優化設計的結果，即實際因素的最終方程:

對於顆粒大小(Y₁
)粒徑= +214.028 + 4.98737(殼聚糖)-9.8914 (STPP)
對於PDI (Y₂
PDI = + 0.1374 + 8.0050(殼聚糖)- 7.15909 (STPP)

c)傅裏葉變換紅外光譜(FTIR)研究(圖7)
d)粉末x射線衍射研究(圖8)
e)差示掃描量熱法(DSC)研究(圖9)
f)體外釋藥研究(補充圖11)

討論

商業殼聚糖的脫乙酰

a)感官特性

商品化殼聚糖(C1)呈淺棕色無定形片狀結構，而改性殼聚糖(C2)呈黃白色結晶粒狀粉末，呈近球形。

b)流動特性(壓縮率%、休止角、流速)

如表1所示，與商業殼聚糖相比，改性殼聚糖的流動性能在%壓縮率下有所改善，C2為8.86±2.58%(流動良好)，C1為20.19±2.09%(流動不良)

同樣，改性殼聚糖(即1.98±0.04 g/秒)的流速也比其商業對口物(0.92±0.02 g/秒)豐富。改性後的殼聚糖與底液形成的溫度為θ=29.41±1.38°C(在25 ~ 30°C範圍內流動良好)，而商業殼聚糖的溫度在θ=31.99±1.02°C範圍外。這些數據進一步表明改性殼聚糖的休止角值的增值增強(見表1)。

c)粘度測量

在製備納米配方時，高粘度是殼聚糖的主要缺點。殼聚糖由於其天然來源，在溶液中總是含有一些不溶解的物質。由於這種強度的粘度，即使通過真空過濾，不溶物質也不能充分根除。在1% w/v溶液的情況下，商業殼聚糖的粘度為44±2.0 mPas，而改性殼聚糖的粘度則低得多，即11.2±1.8 mPas。同樣，在2% w/v和3% w/v溶液中進一步觀察，改性殼聚糖的粘度(20.6±1.4 mPas和26.9±1.5mPas)遠低於商業殼聚糖(71±2.2 mPas和93±2.6 mPas)。隨著粘度的增加，殼聚糖的增溶時間也從幾小時減少到幾分鍾，如表1所示。

d) FTIR研究以確定脫乙酰程度

一般考慮三個主要的峰，即-CONH(用於確定完整和暴露的胺基)，-OH(用於定義no。乙酰基減少)和-CH(作為公式的標準)如圖2所示。結果發現，商業殼聚糖脫乙酰率為64.63%(即乙酰基接近35.37%)，而高度脫乙酰率為98.02%(乙酰基減少到1.97%)，如表2所示。

e) P-XRD研究，測定晶體性質

商業殼聚糖的P-XRD衍射峰為合並峰，但也有較寬的峰，說明其結晶度較低，峰數較少，分別為8.84(273次)、20.02(293次)和42.58(115次)。對於改性殼聚糖，其強度分別為11.48(209次)、19.20(226次)、22.64(273次)、25.34(278次)、29.78(395次)(如圖3所示);表明脫乙酰過程提高了殼聚糖的結晶度，從而證實了改性殼聚糖與商業殼聚糖改善流動性能的結果的可行性。

商業殼聚糖和脫乙酰殼聚糖製備載藥納米顆粒的篩選

篩選這種方法修改的原因是為了確定製備方法中篩選的幾個參數對商業殼聚糖和改性殼聚糖的顆粒和尺寸的影響。修改-1使用了成熟的技術，但由於無法獲得接近或低於200 nm的粒徑，因此不可行的。隨後，我們反複接種modify -2，以檢查pH (STPP溶液)對配方過程中相互作用水平的影響，發現其粒徑和PDI要高得多。最後采用改性-3，改性-1與改性-1近似，但加入了表麵活性劑。在這最後的修改開始時，發現粒徑接近200 nm，可接受的PDI低於0.30。

表1:基於流動性質的C1和C2比較。

表2:根據所選波數的FTIR數據計算出的去乙酰化程度。

圖2:商用殼聚糖(C1)和脫乙酰殼聚糖(C2)的紅外光譜。

圖3:商業級殼聚糖(C1)和脫乙酰殼聚糖(C2)的P-XRD圖。

表3:使用幾種篩選的離子凝膠修飾製備納米顆粒。

觀察到的另一個方麵是，在所有上述修改中使用探頭聲波器，依次降低了粒徑和PDI，因此被認為是一個不可分割的部分。最後，篩選這些參數的主要目的是為了確定改性殼聚糖的效果，成功地接種了更快速的配方加工，結合相對更小的粒徑和更好的PDI。