摘要

量子點的生物學特性和物理化學性質在理解、預測和管理其暴露後潛在的不良健康影響方麵提出了新的挑戰。量子點在生物醫學中的安全使用需要對其生物相容性和毒性有詳細的了解。本研究評價了麥芽糖糊精包被硫化鎘量子點在齧齒動物體內的生物相容性。的在活的有機體內在熒光顯微鏡下研究了麥芽糖糊精包被的硫化鎘量子點在組織中的定位，並通過組織病理學分析和生化分析評估了它們的生物相容性。每天用200 μ g/Kg的麥芽糖糊精包被硫化鎘量子點處理5天或15天，動物的器官中出現了不同的量子點。腎、肝組織檢測到強烈熒光;肌肉和大腦，在腸、肺和睾丸中檢測到中度熒光。組織病理學和生物化學分析表明，量子點對齧齒動物無毒。體內分析揭示了量子點的分布規律及其與各組織的生物相容性。麥芽糖糊精包裹的硫化鎘量子點發出明亮的綠色發光，表明它們可能被用作生物成像應用中的造影劑。

關鍵字

量子點;硫化鎘;細胞毒性;細胞凋亡;生物相容性

簡介

量子點納米顆粒(QDs)由於其在成像和治療方麵的潛在應用，正成為一種可用於生物係統的新型造影劑[1,2]。量子點的獨特光學性質在活的有機體內成像包括:高吸收係數，高熒光量子產率，高抗光漂白能力。更重要的是，量子點的廣譜吸收光譜和窄譜發射光譜使其適合於同時多重成像[3]。然而，將量子點合並到生物係統中通常需要對與量子點表麵結合的配體進行操作，以使其具有水溶性[4]。

量子點在生物醫學應用中的有用性要求它們進入人體並直接接觸組織和細胞。這必然需要了解它們的生物相容性。量子點被認為是生物相容性的，也就是說，當它們既沒有毒性，也沒有傷害性，也沒有生理活性時，它們與活組織或活係統是相容的。同理，當量子點顆粒對人體和動物的正常生理機能產生不利影響和/或直接改變人體和動物器官和組織的正常結構時，量子點被認為是有毒的[6,7]。

近年來，關於量子點的細胞相互作用機製的科學知識不斷增長。以往的研究結果有力地表明，表麵塗層可以改善細胞相容性，從而降低毒性。有研究表明，將表麵包裹的量子點長期暴露在其生物環境中，會使表麵分子的結合強度不穩定，進而導致細胞內外未受保護的量子點[8,9]。因此，量子點表麵分子的穩定性和結合強度決定了量子點的生物相容性，從而決定了它們的毒性。目前，具有良好生物相容性和低毒性的聚合物正被成功和廣泛地應用於修飾量子點表麵和工程生物相容性量子點複合材料，用於各種醫學和生物學應用[10,11]。

我們最近報道了3 nm大小的量子點的合成，提高了其綠色發光能力，並將其塗上糖聚合物，認為它們有可能應用於生物成像領域[12,13]。麥芽糊精包裹的硫化鎘(CdS-MDx)量子點產生明顯的劑量依賴性效應在體外而且體內;在活的有機體內然而，影響是未知的。在本研究中，對麥芽糖糊精包覆的硫化鎘(CdSMDx)量子點進行了生物相容性分析。為了確定CdS-MDx量子點的生物相容性，我們從組織病理學上檢查了在5天或15天內接受每日劑量納米顆粒的齧齒動物組織中的熒光發射。因此，本研究的目的是評價CdS-MDx量子點的生物相容性在活的有機體內．

材料和方法

分析在活的有機體內CdS-MDx量子點的生物分布和生物相容性

明亮的綠色發光CdS-MDx量子點的大小為3 nm，合成如前所述[13]。選擇Wistar大鼠作為CdS-MDx量子點生物相容性研究模型。所有動物被飼養在動物房裏，晝夜循環12小時，為期2個月。所有的動物都被飼養在衛生和動物友好的條件下，被安置在溫度和濕度控製的環境中，並允許自由的食物(墨西哥標準普裏納周氏飲食)和水。實驗按照《實驗動物護理和使用指南》[14]進行。

選取健康Wistar大鼠24隻(8 ~ 10周齡)，隨機分為三組:一組8隻動物以300 μ L PBS、200 μ g/ Kg體重、每日i.p.劑量給予CdS-MDx量子點治療5天;第二組8隻動物每天以200 μ g/Kg體重i.p的劑量以300 μ L PBS給藥，持續15天。對照組(8隻)注射300 μ L PBS。觀察動物的毒性跡象。急性毒性期間記錄的體征包括:運動活動、麻醉、震顫、弓起和翻滾、陣攣性驚厥、上瞼下垂、強直性伸展、流淚、眼球突出、鼻梁勃起、流涎、抑鬱、失調、鎮靜、催眠、發紺和鎮痛。對其行為參數、死亡、體重、水量和飼料量進行了分析。毒性指標包括每日臨床觀察、體重、食物消耗量、臨床病理、器官重量和組織病理學。

治療後，動物被禁食一夜，並在乙醚麻醉後從心髒提取血液樣本。在屍檢中收集的組織保存在10%的中性緩衝福爾馬林固定液中，並進行常規組織學檢查。熒光分析用H&E染色。在3000轉/分離心15分鍾分離血清。從接受多劑量CdS-MDx QDs的動物中測定血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、葡萄糖、膽固醇、甘油三酯(TG)、尿素、肌酐和尿酸的酶活性生化參數，使用商用試劑試劑盒(ELITech, Mexico)。

統計分析

數據用3次獨立實驗的平均值±SD表示。使用SPSS 10.0軟件(SPSS Inc.， Chicago, Ill)對數據進行統計分析。，美國)，t檢驗和方差分析。如果P值小於0.05，則認為差異顯著。

結果

在活的有機體內CdS-Dx量子點熒光顯微鏡的生物相容性

為了獲得有關CdS-MDx量子點在齧齒動物組織中的生物相容性的精確數據，我們將CdS-MDx量子點以200 μ g/Kg的濃度處理大鼠5天或15天。未染色的組織樣品在熒光顯微鏡下觀察，由於其明亮的綠光，CdS-MDx量子點被識別。對未染色的組織樣本進行分析，以檢測組織的分布和積累。染色組織進行組織病理學分析，以監測其毒性，並觀察CdS-MDx量子點是否具有生物相容性或是否誘導結構變化。圖1和圖2顯示了CdS-MDx量子點在雌性大鼠腸、肺、脾、心、腎、肝、腦和骨骼肌中的生物分布的代表性熒光圖像。圖3和圖4顯示了CdS-MDx量子點在雄性大鼠腸道、肺、脾、心、腎、肝、腦和睾丸中的生物分布的代表性熒光圖像。由於CdS-MDx量子點在每個組織中的存在，可見不同的熒光強度在兩性中都很明顯。在腸道內，CdS-MDx量子點較多分布在外膜、固有層和上皮層。在女性中，這些組織中的熒光在第5天更加明顯。然而，在雄性的情況下，熒光強度在15天更高。 In the lung, evident fluorescence surrounded the blood vessels, bronchioles (smooth muscle, submucose and cartilage) and alveolar sacs (luminal alveolar epithelium, smooth muscle and basement membrane); no significant changes in the intensity of fluorescence were observed in either sex. In the spleen, fluorescence intensity was high when rats were treated with CdS-MDx QDs for 5 days. The QDs were observed mainly in red pulp and, to a lesser extent, in white pulp. After 15 days of exposure, the CdS-MDx QDs were observed in the manti zone of the follicle and in the marginal zone of the follicle in female rats, whereas in males the CdS-MDx QDs were mainly found in red pulp; no significant changes in the intensity of fluorescence were observed in either sex. In the heart, CdS-MDx QDs were found in the myocardium (muscle fibers) and were less evident at 5 days of treatment in female rats.

腎髒的熒光強度高於其他器官。這主要在近曲小管和遠曲小管中檢測到，在腎小球中檢測到的程度較小;明亮的綠色輻射在雌性大鼠中更為強烈。肝髒也表現出較高的熒光強度，主要圍繞肝門靜脈、肝動脈的分支、膽管和少量的肝實質。明亮的綠色輻射在雄性大鼠中更為強烈。

CdS-MDx量子點明顯越過血腦屏障和血睾丸屏障，因為我們檢測到腦和睾丸的熒光。大腦皮層各層均有熒光，但女性的分子層熒光含量較高，男性的外顆粒層和神經節層熒光含量較高。睾丸間質細胞熒光強烈，精管和精母細胞帶熒光減弱。在骨骼肌中觀察到cd - MDx量子點的高攝取，在胸腺中檢測到最低程度的熒光(數據未顯示)。有趣的是，在大多數組織中，亮綠色的釋放在治療15天後更高。在雌雄大鼠中均未觀察到明顯變化。

在CdS-MDx量子點暴露5和15天後，組織病理學分析未顯示所有研究組織發生任何變化(圖5和圖6)。與對照組雄性大鼠相比，分析的生化參數未顯示變化(表1);然而，雌性大鼠血清甘油三酯水平顯著升高(100%)(p<0.05)(表2)。

討論

由於量子點在生物成像方麵具有廣闊的應用前景，近年來受到了廣泛關注[15,16]。然而，量子點在生物和臨床方麵的應用仍然存在嚴重的局限性，因為沒有足夠的關於其體內生物相容性的數據，這導致了對其安全性的擔憂[17,18]。目前的研究顯示了CdS-MDx量子點在齧齒動物中的生物相容性，以及使用CdSMDx量子點可以獲得高質量的圖像。

量子點的生物相容性是其在生物成像領域應用的重要要求之一。為了使量子點與它們的生物環境更相容，這些量子點必須是親水的。因此，通過修飾它們的表麵使它們具有水溶性是至關重要的。量子點在水中的穩定性可以通過完全的配體交換過程來獲得，也可以通過空間穩定來獲得，即原生疏水表麵被兩親分子包裹，如聚合物[20,21]。本研究使用麥芽糖糊精包覆的硫化鎘量子點，如前所述，其尺寸為3 nm[13]。由於發現麥芽糊精是安全無毒的，我們將其作為封蓋劑用於CdS量子點的合成。麥芽糊精被認為是一種很好的塗層材料，因為它具有低粘度和良好的水溶性。在藥學上，它被用作片劑的稀釋劑和微膠囊[22]的包衣材料。一種新型的包被糖分子的量子點的發展可能促進對特定組織和器官受體的吸引[23]。

圖1:熒光顯微鏡圖像顯示cd - mdx量子點在大鼠組織中的分布和定位。雌性大鼠以200 μ g/Kg / d的每日i.p處理5天和15天，其小腸、肺、脾和心髒均有圖像。左列為熒光顯微鏡下觀察到的對照組組織。CdS-MDx量子點在被分析組織中的分布和定位通過明亮的綠色成像進行識別。第15天，腸道和心髒的熒光明顯增加。

圖2:熒光顯微鏡圖像顯示cd - mdx量子點在大鼠組織中的分布和定位。每日注射200 μ g/Kg劑量的雌性大鼠腎髒、肝髒、大腦和肌肉的圖像，持續5天和15天。左列為熒光顯微鏡下觀察到的對照組組織。CdS-MDx量子點在分析組織中的分布和定位由明亮的綠色成像識別。治療15天後，各器官熒光明顯增加。

圖3:熒光顯微鏡圖像顯示cd - mdx量子點在大鼠組織中的分布和定位。雄性大鼠以200 μ g/Kg / d的每日i.p處理5天和15天，分別為腸、肺、脾和心髒的圖像。左列為熒光顯微鏡下觀察到的對照組組織。CdS-MDx量子點在被分析組織中的分布和定位通過明亮的綠色成像進行識別。

圖4:熒光顯微鏡圖像顯示cd - mdx量子點在大鼠組織中的分布和定位。每日注射200 μ g/Kg劑量的雄性大鼠腎髒、肝髒、大腦和睾丸的圖像分別為5天和15天。左列為熒光顯微鏡下觀察到的對照組組織。CdS-MDx量子點在被分析組織中的分布和定位通過明亮的綠色成像進行識別。治療15天後，腎髒、肝髒和大腦的熒光明顯增加。

圖5:用CdS-MDx量子點處理的大鼠組織的代表性光鏡圖像。雄性大鼠和雌性大鼠每日注射200 μ g/Kg, i.p，持續15天，得到的圖像為腸、肺、脾和心髒。我們的分析顯示，器官沒有表現出毒性的跡象。用蘇木氧林和伊紅染色(放大10倍)後分析組織的完整性。

圖6:用CdS-MDx量子點處理的大鼠組織的代表性光鏡圖像。以200 μ g/Kg, i.p，每日處理15天，為大鼠腎、肝、腦、肌肉和睾丸的圖像。我們的分析顯示，器官沒有表現出毒性的跡象。用蘇木氧林和伊紅染色(放大10倍)後分析組織的完整性。

表1:分析雄性大鼠的生物化學參數
數據為平均值±標準差
*p<0.05與對照組比較

表2:分析雌性大鼠的生化參數
數據為平均值±標準差
*p<0.05與對照組比較

然而，每一種單獨類型的QD的合成決定了其自身獨特的理化性質，這反過來又決定了其潛在的毒性或缺乏毒性[23,24]。此外，在一個完整的有機體中生物環境的複雜性意味著納米顆粒的觀察在體外不同的條件可能產生完全不同的效果在活的有機體內．本研究評價了CdS-MDx量子點在雄性和雌性齧齒動物中的生物相容性。該小組以前的報告表明CdSMDx量子點能夠通過凋亡和壞死誘導細胞死亡，其胚胎毒性，以劑量依賴的方式，也觀察到在體外而且在活的有機體內條件[13]。我們目前的結果表明，200 μ g/Kg CdS-MDx量子點給鼠5或15天是生物相容性和無毒的。

盡管研究有限，但量子點在組織/器官中的分布似乎是多因素的，這取決於量子點的大小、量子點的核殼成分以及共軛或其他附加官能團[25]的生物活性。尺寸本身可顯著影響分布動力學[26]。目前的結果表明，腹腔注射後，CdS-MDx量子點分布在所有研究組織中。這表明cd - mdx量子點的大小允許它們進入組織，就像在在體外在所有組織中均有細胞吸收QDs。缺乏特殊官能團或特異性的量子點已被證明可以通過內吞機製合並到各種類型的細胞中在活的有機體內而且在體外條件[27]。一個有趣的發現是在大腦和睾丸中檢測到亮綠色的發射，這意味著CdS-MDx量子點能夠穿過血腦屏障(BBB)和血睾丸屏障。盡管先前關於NPs生物分布的研究證實了它們在大腦中的存在[28,29]，但尚未對量子點進入該器官的頻率進行詳細分析。然而，目前的初步結果為開發靶向分子和藥物的新型CdS-MDx量子點提供了基礎，它可以提高藥物在血腦屏障的傳遞效果，並促進量子點藥物進入大腦。

雖然很少在活的有機體內已有研究表明量子點可能在各種器官和組織中積累[30,31]。納米顆粒通常被脾髒和肝髒[32]的吞噬單核細胞和巨噬細胞隔離在活的有機體內納米粒子的生物分布研究表明，量子點在肝髒、脾髒和腎髒[33]中積累。目前的結果證明CdS-MDx量子點確實存在於這些器官中。但是，即使考慮到暴露時間，CdS-MDx量子點在其他器官中的生物分布和積累模式也不同。據報道，QD表麵塗層可以控製血清的壽命和沉積模式在活的有機體內(34、35)。現在很清楚，QD ADME的性質和毒性取決於內在的物理化學性質和環境條件的多重因素。目前，還沒有研究比較量子點在兩性中的作用。我們的研究結果沒有顯示出CdS-MDx量子點在雌性和雄性大鼠中的分布模式有任何差異。

對無機納米顆粒的安全性擔憂是其臨床應用的一個關鍵因素。事實上,大量的在活的有機體內有研究表明，量子點可引起多種形式的毒性，包括腎毒性、肝損傷、生殖毒性和血液學異常[36,37]。我們對染色組織的組織病理學分析顯示，CdS-MDx量子點在被分析組織的結構中不產生形態學變化，也不與生化分析中的任何異常相關。雌性大鼠血清甘油三酯水平升高可能是由於脂質和糖代謝[38]的性別差異所致。有報道稱，雌激素具有較高的遊離脂肪酸吸收，誘導皮下脂肪組織中甘油三酯的高合成率，並增加血清中甘油三酯的水平[39,40]。然而，還需要更多的研究來闡明CdS-MDx量子點對女性脂質代謝的影響。

結論

目前的結果表明，當給藥給齧齒動物時，CdS-MDx量子點是生物相容性和無毒的。CdS-MDx量子點的生物分布和積累模式在各器官和暴露時間上存在差異，但在性別間無差異。CdS-MDx量子點可能需要進一步的評價，因為它們似乎是有前途的納米材料，可用於生物醫學的生物成像。

確認

作者要感謝聯阿大學先進顯微鏡國家實驗室的Q.F.B. Xochitl Alvarado affananger的技術援助。

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引用:Gutiérrez-Sancha I, reys - esparza J, Rodríguez-Fragoso P, García-Vázquez F, RodríguezFragoso L(2015)亮綠色麥芽糖糊精包被硫化鎘量子點作為生物成像造影劑:生物相容性研究。納米外科1 (2):doi http://dx.doi。org/10.16966/2470 - 3206.107

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出版的曆史:

收到日期:2015年11月4

接受日期:2015年11月12日

發表日期:2015年11月17日