納米醫學與納米外科學

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研究文章
膠質瘤術中光動力治療:靶向光活性納米粒子在腦瘤窗口模型中的應用

克裏斯汀一個燉1鋤頭金哈1Yong-Eun古永鏘李1奧倫Sagher2丹尼爾Orringer2馬丁Philbert3.拉烏爾Kopelman1, *

1密歇根大學化學係，安娜堡，美國
 2美國密歇根大學安娜堡分校神經外科
 3.毒理學項目，密歇根大學，安娜堡，密歇根州，美國

*通訊作者:Raoul Kopelman，密歇根大學化學係，安娜堡，美國，E-mail: kopelman@umich.edu


摘要

我們介紹了裝載亞甲基藍的納米顆粒(MB-NP)的發展和表征，以及它們在光治療中的應用在活的有機體內神經膠質瘤大鼠模型。光敏劑亞甲基藍被共價偶聯到納米顆粒基質上，以防止靶組織和輔助組織的浸出和非特異性染色。在體外實驗證明其具有較高的產生活性氧(ROS)的效率和伴隨的細胞毒性。在活的有機體內實驗首先優化了治療參數，如通過附著3-肽靶向基團修飾納米顆粒表麵、給藥劑量/濃度、培養時間、光照量和光照時間。通過視覺觀察對各種治療參數的致瘤反應，使用顱窗模型確定膠質瘤的定量生長模式在活的有機體內．顱窗允許對腫瘤進行無創的外部照射，並評估納米顆粒對腫瘤的負載、顆粒靶向對原位保留的影響和療效。與對照組相比，靶向MB-NP對腫瘤生長產生了顯著的延遲，證明了納米顆粒為基礎的PDT的一些潛在優勢，以及它在快速根除局部腫瘤方麵的前景。此外，這種方法有望作為任何剩餘腫瘤腫塊的潛在手術輔助緩解手段。

關鍵字

神經膠質瘤;光動力治療;Photo-active納米粒子;腦瘤

簡介

原發性惡性腦瘤，特別是多形性膠質母細胞瘤是當今腫瘤學家麵臨的最艱巨的挑戰之一。這些腫瘤傾向於浸潤正常的、功能正常的大腦，使得局部治療如手術和放射治療複雜化。此外，腫瘤細胞對細胞毒性藥物的相對耐藥性以及這些藥物難以通過血腦屏障傳遞阻礙了殺傷單個腫瘤細胞的努力[1-3]。這些腫瘤一旦被發現，就會不可阻擋地發展，最終導致死亡，通常在診斷為[1]後不到兩年。

在這種明顯無效的背景下，惡性膠質瘤的治療最近取得了有希望的進展。最近發現的某些惡性膠質瘤的基因組成缺陷已經確定了一個腫瘤的子集，對某些化療藥物[2]的治療反應良好。此外，越來越多的證據表明，最大限度的手術切除腫瘤具有生存優勢。樹突狀細胞疫苗等免疫療法也已出現，盡管這些方法仍處於早期研究階段。到目前為止，所有這些方法都是對尚未實現的美好未來的承諾。

外科手術作為一種可行的惡性膠質瘤治療方法的複興，使臨床醫生和科學家重新關注這種方法的潛在優點和缺點。細胞還原的優點已經被證明，但它們有明顯的局限性。在手術時直接接觸腫瘤還允許外科醫生在腫瘤床上進行“非手術”治療。格裏德爾作為手術輔助治療的發展是利用手術室進行非手術治療的早期嚐試;盡管格裏德爾的療效受限於相對有限的化療藥物Carmustine的療效，但在手術室直接治療腫瘤的概念仍然有希望[3]。我們所選擇的光動力治療(PDT)方法簡單，隻需在手術切除結束時將(激光)光照射在腫瘤床上，前提是已經實現了細胞特異性靶向，即光藥物已被腫瘤細胞選擇性地吸收[4-49]。我們在下麵報道一項使用大鼠大腦窗口模型模擬術中PDT的研究。

對於PDT，在設計PDT劑時，選擇合適的光敏劑是至關重要的。理想的製劑應具有化學純度、光敏劑及其代謝物的名義暗毒性、腫瘤選擇性效率高、光化學能力強、活化，即在治療窗口(600-900 nm)內的長波吸收，能夠充分穿透組織，以及快速清除係統以降低光敏性[4-8]。以上要求，尤其是皮膚光毒的後果，導致了第二代光敏劑的出現。第二代合成光敏劑被認為具有已知的化學成分，更大的腫瘤選擇性親和力，更短的光敏周期，更高的單線態氧產量，以及由於其更長的激活波長[9]而增加的穿透深度。關於我們選擇的亞甲基藍(MB)，它是一種光敏劑，具有良好的光化學性能，包括高單態態產氧量(Φ∆~0.5)，並已被確定為PDT[10]的高效光敏劑。亞甲基藍屬於吩噻嗪族，允許增加單線態產氧的效率和較高的摩爾吸收係數(ε馬克斯~ 82000－1厘米－1)．此外，這種染料在治療窗口(600-900 nm)內具有激發，允許更大的滲透深度[6,11- 16]。亞甲藍已被用於許多醫療應用和治療[17-23]。到2013年，生物醫學圖書館PubMed接收了超過1.3萬個關於“亞甲基藍”的條目。亞甲藍被用作組織化學染色劑、生化試劑和主要化合物，用於開發從微生物感染到氰化物中毒、從瘧疾到阿爾茨海默病等疾病的治療藥物[18-23]。亞甲基藍在光動力治療中的應用已有大量的實驗研究在體外(6、24),在活的有機體內[25]和臨床研究[7,26-29]中，它被認為具有治療癌症的良好潛力。使用亞甲藍的臨床PDT治療和試驗包括基底細胞癌、黑色素瘤、卡波濟氏肉瘤[30]和慢性牙周炎[31]。然而，亞甲藍作為臨床PDT光敏劑的廣泛使用受到限製，因為它在靜脈注射時易被酶降解。值得注意的是，亞甲藍可以很容易地穿過細胞膜並固定在線粒體[32,33]、溶酶體[34]和雙鏈DNA[35]上。研究發現，當亞甲藍與線粒體結合時，它可以通過線粒體基質質子勢[32]穿過基質。此外，亞甲基藍局部濃度的增加會誘導亞甲基藍二聚體的形成，此前研究表明，亞甲基藍二聚體在產生活性氧方麵的效果較差[11,12]。亞甲基藍在細胞器和血清中的這種積累，通過氧化生成無色的白細胞-亞甲基藍(LMB)來減少化合物，LMB是一種沒有光動力能力的分子[15,25,26]。亞甲基藍的攝取和還原的例子被歸因於內皮細胞表麵的噻嗪染料還原酶和細胞內的NADH/ NADPH[36-38]。

能否在生物環境中保持亞甲藍的光敏性是其應用於癌症PDT的關鍵。將其並入由聚丙烯酰胺(PAA)、二氧化矽或聚(乳酸-乙醇酸)等聚合物組成的納米顆粒基質中，可以嵌入亞甲基藍光敏劑的活性形式，保護其不受酶降解[39]的影響。此外，納米顆粒表麵修飾可以通過附著腫瘤特異性歸家部分(如t3肽)，以及用聚乙二醇(PEG)塗層以延長血漿循環時間[40]，增強和選擇性靶向。

亞甲基藍光敏劑的負載可以通過以下方式實現:(1)合成過程中的物理封裝，或(2)合成後的加載，或(3)通過將染料與PAA納米粒子基體共價連接。更高要求的共價連接染料的過程，通過防止浸出相關的問題在活的有機體內研究。這種加載方法已經設計和測試，在血清溶液，細胞，和在活的有機體內[39]在未來的臨床應用中表現出良好的潛力。

我們在這裏注意到使用聚乙二醇化NPs用於PDT的許多優點，因為它能夠(1)減少藥物的全身毒性，由於腫瘤靶向性，(2)改善局部給藥和藥物特異性，以及(3)提高其血漿循環時間[41-49]。將納米顆粒設計在所需的直徑(10-100納米)內，可以避免腎髒被吞噬細胞清除和識別[41-43]。納米顆粒在腦腫瘤組織和脈管係統中的積聚是通過“增強滲透性和滯留效應”(enhanced permeability and retention effect, EPR)實現的，通過微血管滲漏和淋巴引流不良，允許大分子和NP滯留在組織內[44-49]。納米粒子基質表麵工程可以通過附著腫瘤特異性歸巢部分，如f4 -肽，進一步提高腫瘤組織內的滯留時間;用聚乙二醇(PEG)[43]包覆基體，可延長血漿循環時間(~24小時)。這些新穎的NP給藥方法最小化了副作用，從而提高了治療效率。為了避免處理後納米顆粒積累可能造成的副作用，生物可降解交聯劑被納入納米顆粒基質中，允許緩慢的生物降解和生物消除在活的有機體內[48]。

含有PDT劑Photofrin的聚丙烯酰胺納米顆粒，表麵經p3肽修飾，已被用於膠質肉瘤細胞的特異性靶向;靶向的納米顆粒顯示出很高的腫瘤內NP攝取，從而增加了光毒性，導致使用F3靶向Photofrin納米顆粒治療的40%的動物腫瘤完全緩解，而另一方麵，所有對照組大鼠，包括使用非靶向NPs或遊離Photofrin治療的大鼠，在2周內死亡[48,49]。

在目前的工作中，光敏劑亞甲基藍被共價偶聯到納米顆粒基質上，並用於兩者在體外而且在活的有機體內實驗測試其產生活性氧的能力和細胞殺傷能力。的在活的有機體內實驗使用帶有腦窗的膠質瘤大鼠，允許直接連續檢查各種治療參數，如納米顆粒劑量，通過附著的3肽靶向部分表麵修飾的效果，培養時間和光照。這些窗口允許通過外部放置的激光進行PDT傳導和腫瘤生長和壞死的評估，作為NP設計的功能，如聚乙二醇化和靶向，以及PDT參數，如藥物劑量，NP劑量，光劑量和照明時間。

實驗
納米顆粒的合成

材料:亞甲基藍琥珀酰亞胺基esther (MB-SE)購自Emp. Biotech。丙烯酰胺(AA)， 3-(丙烯氧基)- 2-羥丙基甲基丙烯酸酯(AHM)，過硫酸銨(APS)， N,N,N '，N ' -四甲基乙烯二胺(TEMED)，二辛基磺基琥珀酸鈉(AOT)， Brij 30，均來自Sigma-Aldrich(聖路易斯，密蘇裏州)。3-(氨基丙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽鹽(APMA)購自polyciences Inc. (Warrington, PA)。乙醇(95%)和己烷從費雪科學公司購買。磷酸緩衝溶液(PBS)使用來自Sigma-Aldrich的磷酸緩衝鹽水片製成。F3-Cys肽(KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKKC)購自SynBioSci。異雙功能聚乙二醇(MAL-PEG-NHS, 2k)購自Creative PEG Works。所有化學品均按購買時使用，未進一步淨化。

亞甲藍納米粒子的製備:采用反向微乳液聚合法[21]製備了亞甲基藍改性聚丙烯酰胺納米粒。將單體、丙烯酰胺和生物可降解交聯劑(AHM)溶解在PBS中製備單體溶液。製備由MB-SE和APMA組成的染料溶液，在室溫下輕輕攪拌2小時。將單體溶液和染料溶液進行超聲處理，並加入到含有兩種表麵活性劑AOT和Brij 30的脫氧己烷溶液中。兩種混合物通過攪拌20分鍾乳化，然後加入新製備的APS溶液(10% w/v)和TEMED引發聚合。然後將溶液在室溫惰性氣氛下攪拌2小時。聚合完成後，使用Rota蒸汽- p(布林克曼儀器)去除己烷，並將殘渣懸浮在乙醇中。殘餘混合物中多餘的表麵活性劑和染料通過Amicon超濾池(Millipore Corp.， Bedford, MA)用300kda濾膜在壓力(10-20 psi)下用乙醇和蒸餾水清洗顆粒。然後使用5 L Modulyo D冷凍幹燥機(Thermo Fisher Scientific)對合成的納米顆粒進行冷凍幹燥。

p3 -肽與聚丙烯酰胺納米粒的偶聯:將F3-多肽偶聯到納米顆粒表麵，靶向膠質瘤細胞上表達的核苷。將凍幹的PAA納米顆粒(50 mg)溶解在PBS (2.5 mL, pH 7.4)中，雙官能聚乙二醇(4 mg)通過胺-琥珀酰咪酯偶聯到納米顆粒表麵。該混合物在室溫攪拌條件下反應30分鍾，然後使用Amicon離心過濾器(Millipore, 100 kDa)進行徹底清洗，從而去除任何未反應的配體，最終溶液濃縮到~20 mg/mL。Cystein標記的3-肽，F3-Cys肽(0.06 mol)，添加到濃縮的納米傳感器溶液中，在室溫下輕輕攪拌一夜(>6小時)。在混合物中加入l -半胱氨酸水溶液，攪拌2小時，以使未反應的PEG末端位點失活。在Amicon超濾池(Millipore Corp.， Bedford, MA)中，用PBS和蒸餾水徹底清洗得到的f3靶向mb共軛PAA納米顆粒溶液，然後用5L ModulyoD冷凍幹燥機(Thermo Fisher Scientific)冷凍幹燥，直到再水化以供實驗使用(圖1)。

非靶向納米顆粒的表麵修飾:染料共軛PAA納米顆粒(50 mg)溶解在PBS (2.5 mL, pH 7.4)中。雙官能聚乙二醇(4mg)加入到納米顆粒溶液中，然後在室溫下攪拌30分鍾。使用Amicon離心過濾器(Millipore, 100 kDa)進行漂洗，去除任何未反應的配體，濃縮至約20 mg/ mL。加入PEG後，向混合物中加入l -半胱氨酸水溶液，攪拌2小時，以使PEG的末端位點失活。合成的非靶向mb共軛聚丙烯酰胺納米顆粒溶液在Amicon超濾池(Millipore公司，Bedford, MA)中用PBS和蒸餾水徹底清洗，然後用5 L ModulyoD冷凍幹燥機(Thermo Fisher Scientific)冷凍幹燥，直到再水化以供實驗使用。

納米表征

動態光散射測量:通過動態光散射(DLS, Delsa Nano, Beckman Coulter, Inc.， Brea, CA, USA)測量了mb共軛PAA納米顆粒在水溶液中的尺寸分布。用上述儀器測量了mb -共軛PAA納米顆粒在水中的表麵電荷。

亞甲基藍裝載量的定量:通過吸收測量，使用UV-Vis光譜儀(UV-1601, Shimadzu，科學儀器公司，哥倫比亞，MD，美國)評估納米顆粒中共軛亞甲基藍的含量。裝載的光敏劑的量是用由一係列已知的亞甲基藍濃度和比爾-蘭伯特定律構建的校準曲線來計算的。

活性氧種類檢測:用蒽-9,10-二丙酸二鈉鹽(ADPA)作為ROS(活性氧種類)測定MB-PAA NPs產生的活性氧種類(ROS)1O2)檢測探針[50,51]。將mb共軛納米粒子懸浮在PBS中，並與ADPA混合在比色皿中，在不斷攪拌的情況下，在激發波長下照射溶液進行測定1O2使用熒光光譜法(fluormax -3, Jobin Yvon/SPEX部門，儀器公司，愛迪生，新澤西州，美國)。

毒性分析

MTT測定:為了進行細胞毒性研究，9L膠質瘤細胞被鍍在96孔板上，每孔密度為5000細胞，在37°C下培養過夜。作為對比，細胞與空白PAA、聚乙二醇化PAA和f3靶向PAA納米顆粒在不同濃度(0.1、0.2、0.5和1.0 mg/mL)下孵育，在37°C下緩慢間歇搖動2小時。孵育後，為了去除任何未結合的納米顆粒，用新鮮的細胞培養基仔細清洗處理過的細胞3次。用MTT檢測試劑盒進一步製備細胞;在PBS中加入25 μl (5.0 mg/mL)的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)- 2,5-二苯基溴化四唑(MTT)，靜置孵育4小時，同時緩慢搖動。4 h後，在每孔中加入200 μL DMSO，使活細胞中MTT細胞脫氫酶活性產生的水不溶性福馬甲聚糖晶體溶解。在96口井的板上覆蓋箔，並將其放置在55S單平台振動篩(Reliable Scientific, Inc)上穩定搖動一夜。為了量化處理細胞的細胞活力，使用微板讀取器(spectra MAXPlus 384, Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA)在550 nm下分析吸收光譜，並與未處理細胞進行比較。為了確保可靠的結果，每個條件下都使用了12口井。

內毒素檢測:使用Endosafe-PTS (Charles River)和LAL試驗[52]測定腸毒素水平。一種便攜式內毒素計具有無菌筒，用於檢測水中樣品中的內毒素。在該裝置中，馬蹄蟹血提取物、鱟試劑溶出物(LAL)和細菌內毒素或與革蘭氏陰性菌的膜成分之間的反應可以定量細菌內毒素。在PDT治療過程中，所有的納米顆粒批次和樣品在將納米顆粒溶液注入動物模型前1小時進行測試。

根據我們測試納米顆粒樣品內毒素水平的經驗，細菌的生長速度對時間和溫度都非常敏感;在水合作用後，長時間接觸溶液和溫暖的溫度會加劇細菌的生長。為了避免生長和汙染，納米顆粒樣品在水化和注射之間的時間間隔最短;此外，除注射前將樣品加熱到生理溫度外，複水後的所有時間都將樣品冷藏。

細胞培養

大鼠9L膠質肉瘤細胞(加州大學舊金山分校腦腫瘤研究中心)常規維持在羅斯威爾公園紀念研究所培養基(RPMI)中，其中含有400 mg/L d -葡萄糖和292 mg/mL L-穀氨酰胺，添加10%胎牛血清，100 U/mL(3%)青黴素，1mM丙酮酸鈉和100 μg/mL硫酸鏈黴素。細胞生長在37°C, 5% CO295%空氣，100%濕度環境。細胞被放置在96孔板上進行MTT試驗，並放置在35mm帶蓋滑底培養皿上在體外PDT。

在體外研究

影響依賴PDT:為了研究PDT的光毒性效應，進行了一係列的研究在體外對大鼠9L膠質瘤細胞進行了實驗。玻璃蓋卡片與1 mg/mL MBloaded聚丙烯酰胺納米顆粒(含f3 -肽)孵育1小時，用適當的細胞培養基衝洗，放置在37℃的溫控樣品室中，然後用5 μL鈣鈣素- am和10 μL碘化丙啶(PI)熒光染色劑標記細胞，監測亞甲基藍介導的細胞毒性。使用配備氬氪激光器的Perkin Elmer超視共聚焦顯微鏡係統對鈣鈣蛋白am(激發490 nm，發射515 nm)和PI(激發536 nm，發射617 nm)的熒光觀察進行了30分鍾的監測。用顯微鏡激光照射671 nm，間隔1分鍾後停止。活/死測定法可以明顯區分活細胞和細胞毒細胞。在活細胞中，細胞內酯酶將非熒光鈣黃蛋白am轉化為綠色熒光鈣黃蛋白，表明細胞存活。PI被活細胞阻斷，但可以侵入細胞膜受損的細胞。在照射下，以一種時間依賴性的方式，受損細胞通過受損的膜釋放鈣鈣素am的綠色熒光，並允許PI與它們的核酸結合——發射紅色熒光。使用奧林巴斯IX-70共聚焦顯微鏡，以分鍾為間隔，連續拍攝細胞的一係列圖像30分鍾。在曝光完成後，物鏡被調到較低的放大倍率，以顯示治療僅限於光照區域——顯示染紅的死亡細胞，被活的綠色細胞包圍，就在光照區域外。 At each time interval, the survival rate was presented as a percentage of the number of viable cells divided by the total number of cells (viable and non-viable).

此外，在光照功率密度為100 mW/cm的條件下進行了單獨的流暢度相關PDT研究2和222 mW /厘米2．曝光前圖像使用60X物鏡拍攝。細胞暴露在671 nm紅色二極管激光器(671RLMH1W型，長春龍激光有限公司)，光強為100 mW/cm，共30分鍾2和222 mW /厘米2．使用20X物鏡拍攝曝光後圖像，觀察局部細胞損傷。

在活的有機體內研究
顱窗模型

動物研究方案由密歇根大學安阿伯分校的動物使用和護理大學委員會(UCUCA)審查和批準。對8周大的Sprague-Dawley雄性大鼠進行雙頂骨顱骨切除術(查爾斯河實驗室，威爾明頓，麻州)。體重在250到350克之間的大鼠被麻醉並置於立體定向架中。大鼠9L膠質瘤肉瘤細胞被單層收集，並在培養基和細胞(105)使用注射器微注射器(Med fusion 3500注射泵)進行注射。9 L細胞通過注射位置下方延伸1 mm的毛刺孔在1.5 mm深度植入前腦，以創造一個生長袋。為了便於連續檢查，用氰基丙烯酸酯膠水將一個薄的圓形顯微鏡蓋片粘在顱骨開口上，形成腦瘤窗口(BTW)模型[53]。

亞甲基藍納米粒給藥:亞甲基藍共軛納米顆粒的載染效率為0.27% wt/(NP wt)，給藥劑量相當於0.86 mg MB/(kg大鼠)。原液經LAL法測定具有名義內毒素水平。當腫瘤半徑達到直徑2-3 mm時，使用可編程微注射器(Med fusion 3500注射泵)通過右股靜脈靜脈注射遊離染料形式的光敏劑或嵌入聚丙烯酰胺納米顆粒中的光敏劑。注射後，大鼠置於黑暗中，直到接受照射治療。

照明參數:BTW模型中的腫瘤通過窗下暴露的腫瘤表麵以橫斷麵方式照射。活體光照明使用671 nm紅色二極管激光器(型號671RLMH 1w，長春龍激光有限公司)，輸出功率可調(0- 1w)，以不同的流暢率進行精確曝光。

使用CSMA-8-B準直儀(紐波特公司)控製激光束的半徑(因此影響率)。在所有的實驗中，保持恒定的光束直徑為4毫米，在顱窗和準直儀之間保持恒定的距離為1英寸(公製轉換為毫米)。在X焦耳/功率設定下加熱30分鍾校準激光，並在不少於1小時的時間內用XX功率計測量光束以評估光束穩定性。

腫瘤表麵積測量:用索尼數碼相機觀察光照射致敏性腫瘤及腦實質的損傷情況。通過BTW對皮層表麵的每日照片提供了PDT治療前後腫瘤生長模式的明顯描述。然後，根據像素化顏色的變化和測量腫瘤的總像素化表麵積，通過勾畫腫瘤邊界來評估腫瘤生長模式。的在活的有機體內PDT效率是通過測量腫瘤表麵積(通過BTW觀察)和比較個體動物和動物組的腫瘤生長模式來確定的。通過量化照射後殘留的腫瘤組織，並歸一化至pdt治療日(第0天)測量的腫瘤麵積，獲得表麵積尺寸。記錄治療後壞死組織的麵積。我們強調，腫瘤生長模式是通過測量腫瘤組織的表麵積來計算的，正如通過BTW所看到的

結果與討論

使用DLS數據測量表麵修飾的亞甲基藍共軛聚丙烯酰胺納米顆粒的尺寸，表明修飾的納米顆粒在溶液中的平均直徑為55.0(±5.0)nm(圖2)，與未修飾的納米顆粒相似。因此，通過PEG的附著和/或通過靶向配體對表麵的修飾對溶液中顆粒的大小沒有顯著影響。這些納米顆粒落在10-100納米的最佳範圍內，已證明非常有效在活的有機體內應用程序;這是因為大於10納米的納米顆粒有能力避免被腎髒清除，使循環水平延長和升高，而小於100納米的納米顆粒則避免被吞噬細胞捕獲[54-55]。此外，滲漏的血管生成血管具有開窗，這改善了增強滲透和保留(EPR)效應的滲透現象，允許納米顆粒被輸送並在腫瘤組織中積累，比在周圍健康組織中更容易[44-47,56]。

f3修飾的納米顆粒表麵電荷為+12(±1)mV，而非靶向(表麵聚乙二醇化)的納米顆粒表麵電荷為+ 2(±1)mV，相比之下，未修飾的納米顆粒表麵有遊離胺基團，表麵電荷為+14(±3)mV。由於顆粒表麵存在中性聚乙二醇分子，非靶向納米顆粒具有接近中性的表麵電荷。然而，f3靶向亞甲基藍共軛聚丙烯酰胺納米顆粒表現為表麵正電荷，這是因為納米顆粒PEG表麵層表麵的陽離子f4 -肽具有較高的正電荷。

該納米粒子中共價連接的亞甲基藍含量為0.27%(質量比[57])。

光動力療法的效率直接取決於光敏劑產生活性氧(ROS)的能力、分子氧的可用性、光的流暢性(強度和持續時間)以及光敏劑在治療區域的濃度。圖2B和2C顯示了使用ADPA方法製備亞甲基藍染料和亞甲基藍共軛納米顆粒的ROS[39,50]。用ADPA(蒽- 9,10 -二丙酸)的熒光衰減法測定了活性氧產生速率常數，結果表明活性氧產生速率常數為5.5 × 1041.0 μ M遊離亞甲基藍在PBS中染色。對於亞甲基藍0.37% wt/(NP wt)共軛納米粒子，速率常數為4.35 × 104/ s。通過優化靶向納米顆粒產生活性氧和殺傷細胞的能力在體外實驗[39]。後者可以為該問題的初步研究提供基礎在活的有機體內PDT方案:納米粒子遞送條件、劑量和最佳光通量與初期膠質瘤生長速率的關係[39,53]。

圖1:負載mb的PAA納米顆粒的表麵修飾和偶聯

圖2:(A)利用動態光散射測量聚丙烯酰胺納米顆粒在溶液中的尺寸分布。(B)無亞甲藍染料在DI水中和(C)亞甲藍聚丙烯酰胺納米顆粒的ROS產生測定。在678 nm處發現了亞甲基藍的峰值激發:ADPA的熒光變化隨輻照時間的函數線性擬合圖。

研究亞甲基藍共軛聚丙烯酰胺納米顆粒的暗毒性和PDT功效在體外實驗中，對不同劑量的納米顆粒進行了MTT測定。通過MTT試驗，增加F3靶向和非靶向納米顆粒的濃度，進行存活評估。納米顆粒的細胞毒性是通過線粒體氧化將MTT轉化為福馬讚來確定的。亞甲基藍聚丙烯酰胺納米顆粒處理的細胞(在黑暗中)與對照組(僅細胞)的細胞存活率無顯著差異。平均細胞存活率高於97%，達到1mg/ml納米顆粒濃度(圖3)。總的來說，用亞甲基藍聚丙烯酰胺納米顆粒溶液處理的細胞沒有檢測到細胞毒性(在黑暗中)，確保PDT實驗中的活力差異不會受到納米顆粒產生的暗毒性的影響。

由於納米顆粒外的光敏劑可與細胞表麵蛋白和細胞器相互作用，因此測試染料浸出是必要的在體外；此外，酶降解濾出的亞甲基藍染料可能改變染料的光學性質和光活性在術中在活的有機體內應用程序。為了考察染料的浸出，利用紫外可見吸收光譜[39]測定了離心過濾分離的濾液中亞甲基藍的含量。在668 nm處沒有檢測到吸光度，證明亞甲基藍可以忽略染料從亞甲基藍聚丙烯酰胺納米顆粒中浸出。這證實了檢測到的亞甲基藍染料和ROS之間的反應一定發生在納米粒子內部。它還驗證了將亞甲基藍染料與納米顆粒基質共價連接完全消除了染料浸出[39]，從而確保了光敏劑的全部負載輸送到細胞在體外或者到腫瘤部位在活的有機體內．

研究了PDT光毒性的通量速率依賴性在體外對大鼠9L膠質瘤細胞進行了實驗。使用活/死測定法，9L細胞以兩種不同的光強度，100 mW/cm照射2和222 mW /厘米2，激發波長為671 nm。使用Ultra-View共聚焦顯微鏡，以1分鍾為間隔，在30分鍾內連續拍攝一係列細胞圖像(圖4)。

圖3:用MTT法檢測細胞毒性。用不同濃度的f3靶向和非靶向亞甲基藍納米顆粒孵育24小時後，評估9 L膠質瘤肉瘤的細胞活力。細胞存活率在納米顆粒濃度(0.1,0.2,0.5，和1.0 mg/mL)之間沒有可測量的差異，包括隻有細胞的對照組(無NPs)。

進行了兩個實驗，目的是檢測不同激光流利度下的細胞毒性率;他們的圖像在側邊(100 mW/cm)顯示2:圖4 a-4e;222 mW /厘米2:圖4 f-4j)。在光照射前，所有細胞用鈣鈣素- am染色，顯示綠色熒光，驗證了兩個實驗的細胞活力(圖4a和4f)。在5分鍾的照射後，暴露在大通量率下的細胞顯示出細胞死亡的最早跡象，出現pi染色的紅色細胞核(圖4g)，而暴露在小通量率下的細胞沒有顯示出細胞死亡的跡象(圖4b)。在完成10分鍾的光照後，暴露在較高光照通量下的細胞顯示出令人信服的細胞死亡(圖4h)，並在30分鍾的實驗中持續顯示出不斷增加的細胞毒性效應(圖4j)。同樣，暴露在較低輻照率下的小鼠在10分鍾時出現細胞死亡的初步跡象，而在20至30分鍾的光照下，細胞毒性增強(圖4d和4e)。

盡管這兩個實驗的複合共聚焦圖像在定性上似乎顯示了相似的細胞毒性能力，但定量分析顯示了處理細胞上更精細的細胞毒性圖像(圖5)。這個細胞活力實驗表明，更高的激光通量率能夠實現更快的細胞毒性速率，然而，在上述給定劑量的照射15分鍾後，幾乎所有的細胞都被殺死了。

從上麵可以觀察到，暴露在較高通量率下的細胞，其細胞損傷率顯著增加，並在較短的時間內誘導發生;鈣鈣素am(綠色)通過受損的細胞膜快速釋放，使PI(紅色)進入細胞核。這些結果表明，PDT的細胞毒性具有光劑量依賴性，說明進一步優化暴露時間和注射率可以提高PDT的療效。

在氧氣存在的情況下，光敏劑的激活具有高度的細胞毒性，然而ROS的短壽命(<0.04 s)和短擴散距離(<0.02 m)允許治療僅限於存在光敏劑的附近細胞、組織和血管。為了進一步證明這種局部PDT治療所達到的定位和特異性，使用60X物鏡照射一小部分細胞，然後使用低倍率物鏡在輻射後捕獲圖像，輻射區域在圖像的右側(圖6c和6f)。聚焦光照隻對靠近激光束的細胞造成死亡;而相鄰的細胞，含有亞甲基藍納米粒子但未被照射，顯示不出可檢測到的膜完整性損失，如其綠色熒光所示。除了這些定位測試外，未被亞甲基藍連接聚丙烯酰胺納米顆粒處理的細胞在不同的濃度下暴露於激光照射30分鍾時沒有顯示出可檢測到的細胞毒性，這表明單獨照射細胞對這些癌細胞沒有細胞毒性。

執行局部PDT時在活的有機體內，單線態產氧和清除腫瘤的效果與含有光敏劑的納米顆粒的瘤內濃度成正比。為了提高這種治療的療效，有必要了解靶向納米顆粒的動力學，更具體地說，需要培養時間，以允許最高濃度的NP在特定的位置。可以證實納米顆粒在膠質瘤區域內的跨血管運輸和積累在活的有機體內通過描述實驗。通過活體染色實驗，使用含有納米顆粒的造影劑來勾畫植入腫瘤，通過大鼠顱窗模型可以直觀觀察靜脈注射染料增強聚丙烯酰胺納米顆粒後的顏色變化。隨後，該可視化將量化納米顆粒積累最多的培養時間的最佳輻照時間。

圖4:用亞甲藍偶聯PAA納米顆粒處理的9L細胞係的共聚焦圖像:強度依賴的細胞毒性，由f3靶向的亞甲藍PAA納米顆粒和激光照射誘導。9L膠質瘤肉瘤細胞與亞甲基藍納米顆粒孵育，並以100 mW/cm的流暢度輻照2和222 mW /厘米2．(a)光照前拍照;(b-e)在100兆瓦/厘米劑量的光照射下超過30分鍾2．(f)光照前拍照;(g-j)以222 mW/cm的劑量照射30分鍾以上2．細胞毒性監測通過鈣鈣素- am(綠色，為存活細胞)和碘化丙啶(紅色，為死亡細胞)標記細胞。測量是在共聚焦顯微鏡上進行的。

圖5:F3靶向亞甲基藍聚丙烯酰胺納米顆粒對9L細胞係的光毒作用的細胞活力評估。光劑量為100 mW/cm時，流暢性依賴的PDT效率2和222 mW /厘米2在30分鍾的照明過程中。與較低流利度相比，暴露於較高流利度的細胞反應出更快的細胞死亡。

當通過BTW模型觀察時，腦瘤邊緣是不明確的。在之前的研究中，我們小組使用靶向考馬斯亮藍(CB)負載的聚丙烯酰胺納米顆粒[59]進行了腫瘤圈定研究。考馬斯藍是一種強烈的藍色染料，當與聚丙烯酰胺納米顆粒共價連接時，它可以用作彩色造影劑，以幫助術中腫瘤邊緣的圈定。將考馬斯藍聚丙烯酰胺納米顆粒靜脈注射到每隻大鼠的股靜脈後，可以監測到膠質瘤組織結合的納米顆粒的數量在活的有機體內，在微觀層麵上，通過大鼠顱窗模型。使用考馬斯藍劑量為35 mg/kg (NP劑量為500 mg/kg)，對遊離考馬斯藍染料、非靶向的cb -聯納米顆粒和f3靶向的cb -聯納米顆粒所形成的腫瘤勾畫進行了定量評估。每一種治療都能快速勾畫出腦腫瘤，而且由於使用了靶向納米顆粒，顏色對比度更明顯——在長時間內，腫瘤區域清晰，視覺對比度強烈。

Kopelman和Sagher實驗室[53,59]進行的這項描述研究適用於確定藥物(以遊離染料形式並封裝在納米顆粒中的亞甲藍)給藥與照明時間之間的最佳時間。測定考馬斯藍(CB)納米顆粒在腦腫瘤組織中的峰值積累，將有助於了解亞甲藍納米顆粒在用於PDT治療時在腫瘤組織中的可能生物分布。考馬斯藍的描述研究顯示，考馬斯藍遊離染料在30分鍾時達到峰值，而非靶向CB-linked np處理的動物在120分鍾時達到峰值，而f3靶向考馬斯藍納米顆粒的顏色對比在整個6小時實驗結束時持續增強。與非靶向NPs相比，靶向f3的納米顆粒誘導的造影劑隨時間的推移而增強，可能是由於f3肽的主動靶向作用，即它們與核仁受體的相互作用，核仁受體在9l膠質瘤細胞和血管生成係統上高度表達[53-54]。

當腦瘤半徑達到直徑3mm時，光敏劑以遊離染料的形式和包埋在聚丙烯酰胺納米顆粒中的染料通過股靜脈靜脈注射。亞甲基藍共軛納米顆粒的劑量為300 mg/kg，相當於0.86 mg MB/kg。根據之前的納米粒子優化和毒理學研究，該劑量已被證明是安全的[53,59]。根據Sagher和Kopelman實驗室進行的考馬斯藍圈定研究[53,59]，納米顆粒給藥和光照之間的時間間隔被設置為105分鍾，結論是靶向和非靶向納米顆粒的最大積累發生在注射後120分鍾[53]。為了保證在納米粒子在腦腫瘤內最大程度積累期間的光照，激光照明在納米粒子注射後105分鍾開始，並在此之前30分鍾，確保照射發生在最佳照射窗口前後15分鍾。光劑量固定在180 J/cm2[53]。為了監測腫瘤生長模式，在PDT治療前和治療後，通過BTW對大鼠模型的皮層表麵進行每日拍照(圖7)。

我們還選擇了24小時的係統培養時間，以進一步探討培養時間對PDT對腫瘤生長模式影響的影響。這項工作的目的是為未來的PDT實驗建立明確的培養條件，並優化暴露的預測函數。納米顆粒給藥與光照之間24小時的時間間隔是基於先前使用HPPH後負載聚丙烯酰胺納米顆粒對結腸26腫瘤小鼠[60]的研究。

圖6:用亞甲基藍共軛PAA納米粒子處理的9L細胞係激光照射前後的共聚焦圖像。用鈣鈣素- am(綠色，活細胞)和碘化丙啶(紅色，死細胞)標記細胞，監測細胞活力。光照前60倍放大圖像(a,d)，顯示無細胞死亡。光照後的圖像在60倍(b,e)下拍攝，說明細胞死亡，也在較低的放大倍率(c,f)下拍攝，說明細胞死亡僅發生在暴露於激光照射的區域。

圖7:PDT前後植入9L膠質瘤的大鼠的一係列顱窗照片，使用f3 -亞甲基藍聚丙烯酰胺納米顆粒，納米顆粒注射與光照之間的時間間隔為105min。虛線圈表示每張圖片的腫瘤區域。

腫瘤生長曲線(圖9和圖10)表明，對於不同孵育時間的等效方案，孵育105分鍾的PDT方案比孵育24小時的PDT方案更有效地誘導光毒性。在治療後6天，腫瘤生長明顯遲緩，並在第10天觀察到明顯的腫瘤大小差異。因此，與24小時的孵育相比，在藥物注射後105分鍾進行的照射產生了更有利的治療結果。

評估了不同治療方法對腫瘤生長模式的影響，如圖10所示。對照組動物不注射光敏劑，也不暴露在激光下;該組僅作為腫瘤植入手術後腫瘤生長模式的對照組。用激光照明和自由光敏劑處理過的動物，給予0.86 mg/kg的亞甲基藍遊離染料，在納米粒子係統孵卵105分鍾後，用激光(180 J/cm)照射動物，評估其對腫瘤組織的影響2)．

與對照組相比，無亞甲藍染料PDT治療對腫瘤生長沒有影響。這是由於眾所周知的血液酶的能力，將遊離的亞甲基藍還原為光化學鈍化形式的白甲基藍，導致光動力活性[39]的喪失。

圖8:(A)展示治療裝置的照片。顱腦損傷大鼠置於立體定向框架中，顱腦窗與激光準直器之間的距離固定在1英寸。通過BTW看到的腫瘤照片(B)曝光前和(C)用671 nm激光照射時的照片。

圖9:光動力療法的培養時間依賴性效應。靜脈注射f3靶向亞甲基藍聚丙烯酰胺納米顆粒，一旦完成105分鍾或24小時的全身培養，腫瘤以180 J/cm的輻射2每日觀察。

總體而言，與亞甲藍聚丙烯酰胺納米顆粒(無論F3靶向還是非靶向)相比，對照組和無亞甲藍染料處理的腫瘤中位數大小有顯著的統計學差異(圖11)。當用亞甲基藍聚丙烯酰胺納米顆粒治療腫瘤時，腫瘤生長有明顯的抑製作用。然而，f3靶向和PEGylated兩種給藥方法差異不顯著與peg修飾的NPs表明，使用t3肽並沒有顯著改善PDT結果。靶向和非靶向聚乙二醇聚丙烯酰胺納米顆粒的相似生長趨勢表明，納米顆粒通過被動靶向作用在腫瘤部位有效積累，包括EPR;這與我們之前基於MRI的發現一致，即主動靶向治療僅在循環時間超過2小時[40]的情況下，可改善9 L膠質瘤大鼠模型中此類納米顆粒的吸收。另一方麵，這些結果清楚地證明了基於np的PDT製劑的優勢，由於靶向性(被動或主動)，以及由於保護光藥物不被血液酶降解。在即將出版的一篇論文中，我們研究了一個類似的係統，其中酶降解的影響可以忽略不計，以便將這種影響與NP靶向優勢分離開來。我們還注意到，腫瘤生長在一段時間內受到阻礙，但所有組的腫瘤生長都在繼續，包括使用聚乙二醇化亞甲基藍聚丙烯酰胺納米顆粒治療的動物。這可能是因為由於BTW的限製，腫瘤隻能從一個方向照射，即通過顱窗。然而，在臨床環境中，術中PDT的光線可以從各個角度定向，我們相信這個照明問題可以克服，從而獲得顯著的更高的療效。

我們還注意到，在注射和PDT治療之間選擇105分鍾的時間段是基於我們的知識，當時有等量的靶向和非靶向NPs[53]。在此時間後，前者的腫瘤組織濃度升高，後者的腫瘤組織濃度降低。因此，我們認為選擇較晚或較長的光照時間可能顯著提高了對靶向NPs的相對療效。

為了處理我們關於腫瘤壞死的結果，我們強調腫瘤生長模式是通過測量通過BTW看到的腫瘤組織的表麵積來計算的。值得注意的是，治療的後續結果在治療成功的評價中被證明是重要的。

圖12和圖13比較了f3靶向和非靶向亞甲基藍聚丙烯酰胺納米顆粒對壞死組織的表麵積測量。治療當天和治療後1天沒有發現壞死痕跡，但治療後2天出現大量壞死組織，並在第6天消散，因為壞死組織不再可見，因為小膠質細胞和星形膠質細胞(膠質細胞)去除受損組織，以及腫瘤組織的再生。

組織中的光學穿透深度是指輻射功率降低到1/e或其初始值的37%的距離[61]。超過這個深度，組織暴露在較低強度的激光下，這可能仍然足夠用於PDT。亞甲基藍染料具有較長的吸收波長(λ馬克斯= 670納米)允許激光在活組織中有良好的穿透深度，但是光穿透腫瘤取決於治療組織的特性。631 nm激光對腦組織的穿透深度為1.5±0.43 mm，對腦腫瘤組織的穿透深度為2.9±1.5 mm[62]。在這些實驗中使用的大鼠模型包含了延伸到皮質的腫瘤植入物，其深度可能超過我們的671 nm激光所能達到的穿透深度。這一局限性導致腫瘤基底的不完全清除，導致治療後數天仍可檢測到生長模式。但PDT仍有望作為一種有效的術後輔助治療手段，因為PDT顯微鏡下殘留的腫瘤組織都在有效範圍內。

結論

這項工作證明了使用光活性納米顆粒(NPs)可以有效根除9L膠質瘤細胞。這些納米顆粒將亞甲基藍(MB)光敏劑封裝在平均直徑為55納米的球形水凝膠基質中，其中染料重量約為0.27%。這種光敏納米顆粒被證明適用於9L膠質瘤的根除在體外而且在活的有機體內．在活的有機體內通過BTW(腦瘤寡婦)進行視覺觀察，可以對各種治療方案的療效進行一係列檢查，調查光敏劑的遞送和培養時間(納米粒子給藥和激光治療之間的時間)。定量致瘤反應和生長模式顯示，與孵育時間為24小時的動物相比，在納米顆粒給藥105分鍾後接受治療的動物具有更良好的治療結果。在研究光敏劑的給藥方法時，注射未被包裹的亞甲藍對腫瘤腫塊的減少/壞死沒有效果;相比之下，靶向和非靶向亞甲藍納米顆粒均導致腫瘤壞死發展和治療後腫瘤進展的顯著延遲。在NP腫瘤含量和MB負載相等的條件下，靶向和非靶向NPs表現出相當的療效。然而，我們注意到，在這種相同的劑量和給藥條件下，我們預計靶向NPs具有更好的治療指標，但這一指標並未得到測試。隨著腫瘤對治療反應的顯著改善，與對照組相比，如裸MB染料，納米顆粒為基礎的PDT製劑被證明有利於局部腫瘤的根除。

圖10:皮質表麵的日常照片描述腫瘤生長，通過大鼠腦瘤窗口拍攝的圖像。接受輻照的動物組的輻照劑量為180 J/cm2使用671納米激光。注意，使用遊離MB染料(無NP)時，激光照射沒有影響(因為MB染料是由機體的酶轉化為白細胞MB的)

圖11:在注射亞甲藍f3靶向納米顆粒、亞甲藍聚乙二醇化納米顆粒和亞甲藍遊離染料105分鍾後，PDT處理產生效果。對照組動物不使用光敏劑或暴露在激光照射下。另一光照對照組腫瘤生長趨勢與未處理對照組相同

圖12:f3靶向亞甲藍聚丙烯酰胺納米顆粒與非靶向(聚乙二醇化)亞甲藍納米顆粒治療腫瘤的pdt治療後壞死組織測量。兩個治療組表現出相似的壞死形成和消退模式，非靶向亞甲基藍納米顆粒壞死組織形成更多

圖13:大體標本取自動物模型，在dt治療後10天切除。無光敏劑或激光照射的動物組(A,B)和接受非靶向亞甲基藍納米顆粒(105分鍾孵育時間)、輻照劑量為180 J/cm的動物組(C,D)的腦瘤表現2使用671納米激光

最後值得注意的是，這種光反應納米顆粒有潛力用於光動力療法以及神經外科的描述。這種靶向的，負載藍色染料的納米顆粒，在術前使用，將有助於首先劃定腫瘤邊界，然後，在最大程度切除後，根除殘留的腫瘤組織，從而最大限度地減少術後輔助治療的需要。這種結合手術和術中光動力治療的新方法是膠質瘤治療的潛在突破。

確認

我們感謝來自密歇根大學拉克姆研究生院優秀獎學金(KAL)和NIH/NIBIB“量子”撥款R01EB007977 (RK,OS,MP)的資助。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Simmer KA, Hah HJ, Lee Y-E K, Sagher O, Orringer D，等(2015)膠質瘤術中光動力治療:靶向光活性納米顆粒在腦瘤窗口模型中的應用。納米外科1(2):http://dx.doi。org/10.16966/2470 - 3206.106

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出版的曆史:

  • 收到日期:2015年10月29日

  • 接受日期:2015年11月6日

  • 發表日期:2015年11月10