Heike衛矛1ǂ梅勒妮·馮·Brandenstein1ǂVolker破裂2克勞迪婭·裏希特1萊因哈德人1克裏斯汀Kurschat2貝恩德•霍普3.Jochen W U Fries1 *
1 德國科隆大學醫院病理學研究所*通訊作者:Jochen W U Fries，醫學博士，病理研究所病理學副教授，德國科隆大學醫院，Kerpenerstrasse 62,50931，電話:0049 - 2214786061;傳真:0049 - 2214786360;電子郵件:jochen.fries@uni-koeln.de
在蛋白尿疾病中，蛋白和內皮素-1 (ET-1)在近端小管細胞中激活炎症NF-ĸB信號通路，而沒有相關的治療標誌物存在。我們描述了在體外靜息的近端小管細胞中含有NF-ĸB p65/MAPK p38/PKCα的轉錄複合體(TC)，在內皮素刺激後分解。這導致了p65的核進入和PKCα的抑製。由於核PKCα控製primiRNA15a的釋放，ET-1的刺激導致成熟的miRNA15a，與TC的解體相關。我們描述了miRNA15a在膜性或微小變化腎病(qRT-PCR)的成人和兒童患者的尿液中被檢測到。起源於腎小球上皮和近端小管(激光顯微解剖)。在細胞培養中，高水平的miRNA15a在內皮素-1(人RPTECs)和白蛋白(足細胞)的刺激下產生。miRNA15a含量最高見於近端管狀部分(分級篩分，qRT-PCR)。與神經細胞一樣，司萊吉蘭治療可上調RPTECs和阿黴素小鼠模型中的PKCα，導致miRNA15a水平降低。由於尿miRNA5水平與激活的NF-ĸB係統相關，尿中的miRNA i)將表明炎症信號通路的上調在活的有機體內proteinuric條件下;ii)可作為保護近端小管免受蛋白尿介導的ET-1損傷的治療的有效對照的生物標誌物。
miRNA15a;Endothelin-1;NF - Bĸ;PKCα
在人腎小球疾病中，慢性蛋白尿可通過幾種不同的介質導致近端小管損傷。其中，內皮素-1 (ET-1)的尿排泄最初被描述為強效血管收縮肽[1]，被發現與人類腎髒疾病的嚴重程度相關[2-5]。因此，一些(但不是所有)內皮素抑製劑的研究能夠證明通過減緩腎髒疾病進展具有有益的抑製作用[6-10]。
ET-1介導的信號轉導發生了通過這是一種炎症信號轉導級聯，涉及多效核因子κB (NF-κB)家族的二聚體轉錄因子[11]。最近，我們發現絲裂原激活蛋白激酶p38α (MAPK p38α)[12]和蛋白激酶Cα (PKCα)[13]在ET-1刺激後與NF-κB p65結合，形成功能轉錄複合體(TC)。PKCα作為TC的一部分，在靜止細胞中通過直接分子相互作用[13]抑製pri-miRNA15a的釋放。
MicroRNAs (miRNAs)是一種短的非編碼rna，通過靶向蛋白質編碼轉錄物的mRNA序列，在細胞功能和發育中發揮重要作用，導致mRNA裂解或抑製細胞質中的生產性翻譯。在細胞核中，存在兩種不同形式的未成熟miRNA (pre- miRNA和pre- miRNA)，最終的、成熟的和功能的miRNA形式由它們衍生出來[14]。在miRNA15a的情況下，ET-1的刺激導致核PKCα水平的降低。這導致成熟miRNA15a產量增加，在上清液[13]中釋放。到目前為止，這種信號通路已被描述為Caki-1細胞，近端小管細胞[13]的惡性變異。自從在腎癌患者的尿液中檢測到miRNA15a水平上調以來，該miRNA被認為是透明細胞腎細胞癌的新標誌物，代表了大多數惡性腎腫瘤[15]。
了解到尿ET-1水平在蛋白尿病中上調，並了解ET-1誘導miRNA15a釋放的調控途徑，我們假設本研究可以在三個病理生理相關的重要問題上得出結果，並用於診斷:i)尿液中miRNA15a排泄作為蛋白尿的一般標記，與蛋白質或ET-1或兩者水平相關;ii) miRNA15a作為腎小球疾病的指標，有助於區分腎小球基底膜的長期、免疫複合物介導的損傷(如膜性腎病)與複發、短暫和“自愈”疾病(如微小變化腎病)的區別。iii)作為特定途徑(在本例中為炎症性NF-κB)的尿路生物標誌物，可作為治療靶向，而不考慮導致蛋白尿的持續介質刺激。最後一個問題與家族性腎病綜合征(如先天性芬蘭腎病、彌漫性係膜硬化、Alport綜合征)特別相關，其中潛在的基因改變導致慢性蛋白尿和最終的腎功能衰竭，這是相當難治療的。在這些情況下，檢測主要炎症通路的激活(通過miRNA15a)，通過靶向特定蛋白質(如PKCα)可能影響它，此外，能夠監測治療效果(通過減少尿液中的生物標誌物miRNA15a)可能是一個理想的臨床目標。
人腎活檢采用福爾馬林固定，石蠟化，取自德國科隆大學醫院病理科檔案。使用了5例微小變化、特發性膜性腎病和5例新移植腎髒(所謂的無活檢)(表1a-1e)。根據表1所示的診斷，從患者和健康對照組中選擇約50 - 100毫升的尿液樣本。收集24小時尿液，並將樣本冷凍在-20°C以待進一步使用。在選定的患者中，平行收集約1ml的血清樣本。由於對人體材料(血清、腎組織、尿液)進行了調查，因此按照分別在1975年《赫爾辛基宣言》(1983年修訂)和《伊斯坦布爾宣言》(關於移植活組織檢查)中製定的倫理標準所概述的程序進行了檢查，並事先得到了科隆大學醫院倫理委員會的批準(德國科隆;參考號:09 - 232)。獲得每位患者或患兒父母的知情同意。除非另有說明，所有試劑均購自西格瑪-奧爾德裏奇(德國慕尼黑)。
成年雄性BALB/c小鼠來自德國Charles River (Erkrath, Germany)。所有動物實驗均根據《實驗動物護理和使用指南》(美國貝塞斯達MD國家衛生研究所)進行，並已獲得衛生部批準(小鼠:84-02.04.2012.A118)。他們盡一切努力盡量減少使用的動物數量和它們的痛苦。
疾病動物模型:小鼠蛋白尿阿黴素模型，每隻雄性BALB/c小鼠(體重20 g;8周齡;查爾斯河)[16]。水和食物可以隨意取用。研究四組，每組10隻動物接受相同的尾靜脈注射量:注射鹽水或司來吉蘭的對照組小鼠，注射阿黴素的小鼠，注射阿黴素的小鼠在第3周內腹腔注射司來吉蘭，連續7天。Selegiline的劑量為10 mg/kg體重，溶於生理鹽水[17]中。第3周末處死動物頸椎脫位。腎髒用磷酸鹽緩衝鹽水和石蠟包埋固定處理。對H&E切片進行光鏡評價。采用心髒穿刺法采集24小時尿樣和血清。
細胞培養:原代人腎近端上皮小管細胞(RPTEC)從Pelobiotech (CC-2553) (Planegg，德國)購買，按照製造商說明使用REBM(腎上皮細胞基礎培養基，不含生長因子，CC-3191)和添加REGM SingleQuots (CC-4127)在37℃和5% CO下培養2．
MDCK細胞(Madin-Darby犬腎細胞)購自Sigma-Aldrich (84121903-1VL, Munich, Germany)，使用UltraMDCK無血清培養基(12-749Q, Lonza, Basel, Switzerland)按照製造商說明進行培養。傳代6 ~ 7細胞。在所有實驗中，細胞在無血清培養基中預孵育24小時。
通過轉染溫度敏感的SV40 t基因，如最近描述的[18]，有條件永生的人足細胞細胞係已被開發出來。細胞在33°C條件下增殖，轉移到37°C後轉化為靜止的分化表型。培養基含有標準RPMI，添加10%胎牛血清(Biochrom, Berlin, Germany)和胰島素-轉鐵蛋白鈉亞硒酸鹽補充劑(Gibco, Karlsruhe, Germany)。在37°C培養至少14天後，隻使用細胞進行實驗，直到其分化可見喬木形態。
將所有細胞係培養到80-90%的融合度，並使用不同的介質處理24小時:內皮素-1 (50 nM) [12,13];轉鐵蛋白(10 mg/ml) [19];人白蛋白(5 mg/ ml) [20];TNFα (10 ng/ml) [21];血管緊張素(107米)[22];患者尿液(1:10稀釋);或新鮮分離的補體(稀釋1:10;由JWUF捐贈)[23]。作為對照，RPTEC和MDCK細胞在沒有FCS的情況下生長24小時。1µmol濃度[24]時使用司來吉蘭。尿液樣本被過濾(0.2 μ m針尖過濾器)，代表性樣本常規細胞學分析使用帕氏染色和帕氏染色的細胞和感染跡象。
人類活組織檢查:使用了來自德國科隆大學醫院病理科檔案的福爾馬林固定和石蠟化的人類腎組織樣本。
組織學評估基於一名工作病理學家(JWUF)使用常規光鏡分析(hematoxilin - eoosin, Periodic acid Schiff, Elastic van Gieson)和免疫組織學染色(IgG, IgG4, IgA, IgM, C1q, C3，纖維蛋白原)石蠟切片分析。
小鼠腎小球和小管的分離:新鮮收獲的腎髒被切成冠狀動脈切片。皮層和髓質分離。兩種都被獨立切碎並通過分級篩分[25]。用PBS和收集的組織樣本衝洗幾次篩子。樣品在細胞培養顯微鏡下分析。純化的腎小球分數達到99%。樣品在-70°C冷凍，直到進一步使用。
激光顯微解剖人類腎髒活檢:2個7 μ m厚的切片，每個切片常規福爾馬林固定，石蠟化，存檔的人類活組織切片，每個病例被切割並放置在鍍膜玻片上;每個病例使用30個腎小球切片。脫蠟後，用氬激光顯微解剖腎小球，並用俘獲裝置[26]彈射。剩下的皮質組織被從載玻片上刮下來，全部使用。使用Qiagen公司FFPE樣品的miRNA分離試劑盒進行進一步的製備。作為對照，使用了腎移植時移植患者的活檢(“無效”活檢)。
從FFPE樣品中分離miRNA:對於FFPE樣品的miRNA分離，使用Qiagen公司的miRNeasy FFPE試劑盒，按照製造商的協議[15]進行。RNA定量使用NanoDrop技術[15]完成。
從尿液中分離miRNA:為了從患者尿液中分離miRNa，使用1ml尿液，並加入Qiazol試劑中，混合，並根據製造商的協議(miRNeasy Mini kit, Qiagen)[15]進一步使用。RNA定量使用NanoDrop技術[15]完成。
實時定量PCR (qRT-PCR):取上述cDNA的1µl進行實時PCR分析。實驗設置如前所述[12,13]。定量分析用β-肌動蛋白測定。所有樣本歸一化至β -actin作為內參基因。所有實驗均為3個重複。使用用戶公告2 (PE Applied Biosystems)[12,13]中概述的ΔΔCT方法計算相對熒光。不同時間點的qRTPCR值采用Student非配對t檢驗評估差異有統計學意義。
mirVana qRT-PCR引物集用於miRNA15a，按照製造商說明使用。引物設置為5s rRNA用於不同樣品[15]之間的歸一化結果。
rt - pcr:根據製造商的協議，使用隨機引物和NCode VILO miRNA cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)從250 ng RNA中獲得cDNA。RT-PCR方法如前所述[12,13]。
所有實驗均為3個重複。統計分析使用GraphPrism 5程序。采用方差分析(ANOVA)，用Newman-Keuls法計算差異顯著性，用星號表示(* p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001)。所有無指征的差異均無統計學意義。
我們分析了兩組注射阿黴素或假手術的動物的體重和尿蛋白排泄值，然後將它們隨機分為接受生理鹽水或selegeline作為治療，使用雙尾Student 's t檢驗。
否則，報告的值為整篇文章的組均值+/-標準差。所有涉及人類尿液或組織分析的結果(圖1-4)都進行了盒blot評價，以顯示其在數據中的分散(擴散)和偏度。
在所有24小時內，有微小變化或膜性腎病的成人尿液中，qRT-PCR檢測到高miRNA15a含量，相對熒光單位在200到600之間(圖1)。由心髒腎前功能不全引起的急性腎功能衰竭患者的尿液中miRNA水平低100至300倍(圖1)。在兒童患者中，在微小變化腎病中檢測到較高的miRNA15a值(圖1)。血清中miRNA15a水平至少比尿液水平低300倍(數據未顯示)。
圖1:成人微小變化(MCN)、特發性膜性腎病(MN)和心髒功能不全導致的急性腎功能衰竭(ARF)患者尿液中miRNA的定量分析
A)在A中，MN和MCD患者尿miRNA15a高度表達的平均+/- STD。MCN的相對熒光水平在200 - 400之間，MN的相對熒光水平在500 - 700之間。ARF的水平沒有達到1的相對熒光值。使用健康對照者的尿液計算相對熒光(表1d);* * * p < 0.001。
B)在B框圖中，A的數據評估顯示MN的原尿病最低值為400 RFUs, MCD為200 RFUs。
| 患者ID | 診斷 | 年齡(年) | 性 | 肌酐(mg / dl) | 普羅特。/克雷亞(mg / dl) |
| 1.GTU 1 | 錳 | 75 | 米 | 2, 07年 | 1063 |
| 2.GTU 18 | 錳 | 72 | 米 | 94 | 563 |
| 3.GTU 26 | 錳 | 52 | 米 | 1, 02年 | 15614 |
| 4.GTU 32 | 錳 | 50 | 米 | 1、12 | 489 |
| 5.GTU 45 | 錳 | 65 | 米 | 2, 36 | 2337 |
| 6.GTU 9 | m cn | 34 | 米 | 2, 08年 | 2566 |
| 7.GTU 5 | m cn | 35 | F | 0, 89 | 28 |
| 8.GTU 27 | m cn | 40 | F | 0, 69 | 1350 |
| 9.GTU 17 | m cn | 62 | 米 | 1, 60 | 12065 |
表1:成人腎小球疾病患者的數據——來自同時、常規進行的人類腎髒活檢的組織切片，用於激光顯微解剖分析。
答:人類的足細胞
在細胞培養中，用不同的介質刺激永生化人足細胞的上清液和細胞提取物，分析miRNA15a(圖2A)。然而，一名膜性腎病患者的10倍稀釋尿液，即使將結果乘以稀釋因子10，也隻顯示出相對較小的miRNA釋放。ET-1刺激也導致miRNA15a釋放相對較小;所有其他介質均顯示miRNA15a在上清液和細胞提取物中的表達水平可忽略不計。miRNA15a在細胞提取物和上清液中的含量無統計學差異，除處理後白蛋白刺激:足細胞在上清液中釋放大量miRNA15a，通過qRT-PCR檢測到，僅少量殘留在完整培養的細胞中。
圖2:MiRNA15a在體外培養的腎細胞株上清與細胞提取物不同介質刺激24小時後的表達——所有的細胞株都被刺激24小時，試劑顯示;根據文獻中建立的濃度進行選擇(見方法部分)。收集上清液(黑色柱)和細胞提取物(白色柱)，用qRT-PCR分析miRNA15a。* p < 0.001。
A)人足細胞:白蛋白刺激後上清中miRNA15a釋放量最大。
B)人RPTECs: ET-1導致miRNA5a在上清液中最大程度釋放。
C) MDCK細胞:miRNA15a僅少量可檢測到，細胞提取物中的miRNA15a值略高於上清液(轉鐵蛋白除外)。
b .人類RPTECs
在細胞培養中，用不同的介質刺激RPTECs的上清液和細胞提取物，分析miRNA15a(圖2B)。ET-1受刺激最有效，90%以上的miRNA15a被釋放。在上清液和細胞提取物中，其他介質的作用都不到ET-1的10%，特別是包括白蛋白。與人類足細胞相反，在膜性腎病患者中，尿液在刺激miRNA15a釋放方麵起著更重要的作用。考慮到稀釋因子，最終結果將比單獨使用ET-1的刺激高大約66%，因此似乎除了白蛋白之外，幾種不同的介質共同作用導致了這個結果。
c . MDCK細胞
在細胞培養中，用不同的介質刺激MDCKs的上清液和細胞提取物，分析miRNA15a(圖2C)。除ET-1刺激後外，所有介質的總體水平在細胞係和上清中均為1.5 RFUs或更低。與RPTECs相比，miRNA15a的含量明顯較低，細胞與上清呈相反的關係，上清的含量較低(除轉鐵蛋白外)。
A. MiRNA15a在培養的人RPTECs上清液中的表達
由於司來吉蘭誘導PKCα，在ET-1刺激後，RPTECs被司來吉蘭預處理。與et -1刺激的細胞相比，MiRNA15水平在上清液中大幅降低，降低了約350倍(圖3A)。用白蛋白作為刺激劑，selegiline處理可使miRNA15a在上清中的表達誘導降低約50%。
圖3:selegeline的實驗治療幹預
A)培養的人rptecs上清液中MiRNA15a的表達。ET-1處理24小時後，人近端小管細胞上清液中MiRNA15a的數量比未處理的對照組增加。這種miRNA誘導可以通過與司列吉蘭同時治療完全逆轉;* * * p < 0.001。人白蛋白處理24小時後，上清中檢出少量miRNA5a，經司吉蘭處理後miRNA5a含量降低至50%;* p < 0.5。
B)阿黴素引起的蛋白尿中尿miRNA 15a表達的結果-單尾靜脈注射阿黴素可引起文獻報道的經典腎病[16]，腎小球損傷導致第3周時平均180 mg/d的蛋白尿。尿液qRT-PCR分析顯示miRNA15a水平明顯高於生理鹽水注射對照組動物(通過rel.熒光計算)。阿黴素注射後第三周，司來吉蘭(10 mg/kg體重，連續7天)治療的動物相對熒光值平均僅為1.8，而阿黴素未治療的動物相對熒光值平均為3.8;與阿黴素單獨治療相比，p<0.05。
B.阿黴素誘導的蛋白尿中miRNA15a的表達結果
阿黴素治療的小鼠在第3周結束時出現蛋白尿(180+23 mg)，與治療無關。對照組(生理鹽水)沒有檢測到蛋白尿。在阿黴素處理的動物中，尿中的miRNA15a水平達到4個相對熒光單位(圖3B，左欄)。阿黴素小鼠血清中未檢測到miRNA15a的增加(數據未顯示)。
形態學上，阿黴素處理的動物顯示單獨的擴張小管和蛋白鑄型。蛋白質重吸收增加(數據未顯示)。
隨機選擇阿黴素治療組的小鼠進行司萊吉蘭治療，司萊吉蘭/阿黴素治療組和阿黴素單獨治療組的蛋白尿水平相匹配。單純司來吉林治療的對照動物沒有蛋白尿，也沒有顯示任何組織學損傷(數據未顯示)。與單純阿黴素治療的動物相比，司萊吉蘭治療後miRNA15a水平降低了60%(圖3B，右欄)(圖3B，左欄)。然而，蛋白尿的水平不受司來吉林治療的影響(數據未顯示)。使用尿液中的miRNA15a水平作為近端小管/足細胞中炎症NF-κB通路活性的指標，selegiline降低其水平表明，該通路可在這些細胞中被下調，而典型的介質如蛋白尿和ET-1仍然存在。因此，如果蛋白尿不能完全預防，其通過NF-κB對近端小管/足細胞作為促炎介質的作用仍可能被阻斷，這表明miRNA15a水平下調。
A.特發性MN的成年患者與常規移植活檢的對照病例
激光顯微解剖采用膜性腎病、微小變化疾病(表1a和1b)或對照(“無效”活檢，表1e)的人腎活檢。10片腎小球切片進行顯微解剖。從獲得的皮質組織中分別提取miRNA，用qRT-PCR分析。管狀部分顯示的miRNA值明顯高於腎小球部分(圖4A)。
圖4:使用福爾馬林固定、石蠟化的腎小球和皮質管狀部分對miRNA進行激光顯微解剖定量分析
A)特發性MN的成年患者與常規移植活檢的對照病例——對於膜性腎病和微小變化疾病的激光顯微解剖人腎活檢(表1a和1b)或對照組(“無效”活檢，表1e)。10片腎小球切片進行顯微解剖。從獲得的皮質組織中分別提取miRNA，用qRT-PCT進行分析。管狀部分顯示的miRNA值明顯高於腎小球部分(圖4A)。表1e列出了所使用的控製用例。MN膜性腎病;MCH微小變化病;* p < 0.05。
B)單劑量阿黴素後3周和12周分級篩選後，分析阿黴素腎病小鼠腎小球和小管中mirna15a的表達。在這兩個時間點，近端小管的miRNA15a含量明顯高於激光顯微解剖的腎小球;* p˂0.05。
| 病人# | 診斷 | 年齡(年) | 性 | 蛋白尿(g / 24小時) |
| 1. | m cn | 6 | 米 | 5 |
| 2. | m cn | 4 | 米 | 3, 64 |
| 3. | m cn | 14 | F | 4 |
| 4. | m cn | 3. | 米 | 11日16 |
| 5. | m cn | 9 | 米 | 8、5 |
表1 b:來自微小變化腎病(MCN)兒童患者的數據顯示，每個患者的肌酐(低於0.9 mg/dl)和尿素(低於45 mg/dl)水平均在正常範圍內。
| 病人ID | 診斷 | 年齡(年) | 性 | 肌酸酐(mg / dl) | 少尿(毫升/小時) | 類似 階段 |
| 1 | 繞過Op,高清 | 78 | F | -- | 20. | 1 |
| 2 | 心insuff。,高清 | 55 | 米 | 1, 0 | -- | 3. |
| 3. | NSTEMI, 敗血症 |
78 | 米 | 0,8 | ? | 2 |
| 4 | ARF,腎前的 | 74 | 米 | 0、7 | 20. | 1 |
| 5 | ARF,腎前的 | 57 | 米 | 0、9 | 20. | 1 |
| 6 | 高清 | 89 | 米 | 1, 0 | 20. | 3. |
| 7 | 冠心病,ACVB | 73 | 米 | 0、9 | 20. | 2 |
| 8 | CI,腦死亡 | 42 | 米 | 1，1 | 30. | 3. |
表1 c:成人急性腎衰竭患者按急性腎損傷(AKIN)體育場[27]分型;高清:血液透析;ARF:急性腎功能衰竭;冠心病:慢性心髒病;ACVB:急性冠狀靜脈搭橋;置信區間:心功能不全。
| 控製ID | 年齡(年) | 性 |
| 錳 | 24 | F |
| 不 | 28 | F |
| 可 | 30. | 米 |
| SK | 29 | 米 |
| 勒 | 64 | 米 |
| VD | 66 | 米 |
表1 d:成年人作為健康對照組。
| 病人# | 診斷 | 年齡(年) | 性 |
| 1 | NTX | 44 | 米 |
| 2 | NTX | 68 | 米 |
| 3. | NTX | 36 | 米 |
| 4 | NTX | 39 | 米 |
| 5 | NTX | 60 | 米 |
表1 e:數據來自“無效”活檢的患者，作為激光顯微解剖的對照腎組織。
B.阿黴素腎病小鼠
使用腎皮質切片分級篩選，腎小球從小管中分離出來。通過qRT-PCR，阿黴素注射後3周，近端小管中miRNA15a的水平比腎小球高約4倍，12周時升高約3倍(圖4B)。用未處理對照凋落物的腎小球和小管部分計算相對熒光。
我們開始這項研究，以miRNA15a作為蛋白尿病機製特異性標誌物，分析炎症NF-κB通路的診斷作用。從發現的結果來看，我們假設miRNA15a主要在蛋白尿中上調，這對監測靶向治療後miRNA15a的降低很重要;ii)它也被ET-1作為蛋白尿病的主要介質之一激活。然而，在蛋白尿患者的尿液中檢測到它不能區分與蛋白尿相關的眾所周知的腎小球疾病(即MN vs. MCN)。此外，由於炎症途徑的激活發生在足細胞和近端小管中，分析尿液miRNa15a水平不能確定不同細胞類型的個體貢獻。
相比之下，miRNA15a可以作為炎症NF-κB通路的特異性泌尿生物標誌物，以監測靶向PKCα的效果，而不考慮導致蛋白尿的持續介質刺激。因此，在慢性蛋白尿疾病中，如家族性腎病綜合征(如先天性芬蘭腎病，彌漫性係膜硬化，Alport綜合征)，它可能是一種新的診斷工具，用於檢測和治療NF-κB炎症信號活性的監測，這些疾病的潛在遺傳改變導致了有效治療的問題。為此，預先表征潛在的信號級聯是至關重要的[12,13]。
我們提出了一種新的策略，使用miRNAs作為由蛋白尿和尿內皮素-1水平升高的腎小球疾病引起的近端小管損傷的生物標誌物。之前，我們已經證明了這一概念在近端小管細胞毒性[27]的機製中是成功的。我們發現ET-可通過內皮素- b受體上調近端小管的miRNA133a。miRNA133a通過與多藥物相關蛋白2 (mrp2)的3'UTR結構域相互作用，導致該轉運複合物下調。這種機製在人類疾病如MN和MCN以及阿黴素小鼠模型中均可檢測到，其中尿miRNA133a的高水平與mrp-2蛋白的低水平相關。
為了假設miRNA15a作為一種疾病機製的泌尿生物標誌物，我們測試了這一概念是否(i)在近端管上皮中是正確的;(ii) ET-1作為蛋白尿介質的治療保護原理的有用證明。
首先，需要一種可靠的泌尿係生物標誌物，這種標誌物隻在慢性蛋白尿病患者中檢測到，而在其他腎髒疾病中檢測不到。在蛋白尿膜性或微小變化腎病中，miRNA15a可以通過qRTPCR在高相對熒光單元中很容易被檢測到(圖1)。相反，急性腎功能衰竭等疾病會導致上皮完整性破壞並預期釋放其mirna，但尿miRNA15a水平不顯著。這應該使miRNA15a成為常規臨床實踐中理想的標記物。
MiRNA15a同樣適用於成人和兒童，因為它可以在相同的疾病中檢測到(圖1)。即使經過幾個凍融循環，在患者的尿液中也可可靠檢測到MiRNA15a，這使其非常有用(數據未顯示)。阿黴素毒性導致蛋白尿的模型是一個合適的研究模型，因為miRNA15a在蛋白尿小鼠的尿液中高度表達(圖3B)。
其次，對於細胞靶點的損傷，標記應盡可能具有特異性。激光顯微解剖人類腎MN或MCD活檢與對照新鮮移植腎活檢(所謂的空活檢)顯示miRNA15a在近端小管中最常見，在腎小球中更小(圖4A)。這一結果在小鼠模型中得到了分級篩分的支持。管狀部分在3周時含有大部分miRNA15a(圖4B)。然而，由於目前在NF-κB信號通路中沒有已知的導致miRNA15a上調的單獨蛋白，這隻針對於足細胞或近端小管中的這一通路，尿中測定的miRNA15a水平可以從腎單位的不同細胞來源獲得，如足細胞和近端小管細胞。
這種miRNA在整個疾病過程中的可檢測性是很重要的，因為在人類疾病中，疾病的確切起點通常是未知的。在阿黴素腎病中，miRNA15a水平主要在近端小管中升高，持續12周(圖4B)。相比之下，在非蛋白尿的人MCD中，miRNA15a不再檢測到(未發表數據)。
第三，由於在蛋白尿病的尿液中可以發現不同的介質[5-7,20-23]，我們使用永生化人足細胞、人RPTECs和MDCK細胞進行了細胞培養實驗(圖2)。MiRNA15a主要被足細胞中的白蛋白上調(圖2A)，被近端小管中的ET-1上調(圖2B)，相比而言，其他介質不顯著上調。這表明至少在這個在體外與ET-1相比，miRNA15a激活係統、補體、轉鐵蛋白或血管緊張素沒有任何顯著作用。ET-1刺激培養的近端小管後MiRNA15a水平隻能與患者尿液結果相匹配(MN;10g蛋白尿/d)乘以10倍稀釋因子(圖2b)。人血清白蛋白刺激沒有達到與近端小管ET-1水平相當的水平，而白蛋白是永生足細胞的主要介質。
miRNA15a水平的差異在體外與在活的有機體內可能有不同的原因:病理生理機製(免疫vs.非免疫);其他介質;患者體內參與miRNA釋放的細胞數量高於對照組在體外條件。即使其他介質對miRNA水平的絕對貢獻遠小於ET-1對近端小管細胞的貢獻，尿中測定的量也是整個miRNA的收集量從所有可能的來源．因此，我們不應該期望細胞培養物和患者之間的水平相似。在人類中，近端小管似乎釋放了尿液中產生的大部分miRNA，導致激光顯微解剖後檢測到少量miRNA。最後，可能懷疑其他細胞對尿miRNA水平有貢獻，如集管細胞。然而，雖然這些細胞在體外可能主要受到所使用的介質的刺激(圖2C)，其臨床重要性尚不確定，因為這是一個跨物種的比較(人類RPTECs與狗MDCK細胞)。
為了確認miRNA的腎髒來源，我們比較了來自同一蛋白尿患者的尿液和血清的miRNA結果。我們隻能在尿液中檢測到高水平的miRNA;血液水平至少低了300倍。這一結果與來自近端小管的透明細胞癌患者尿液中miRNA15a水平明顯高於相同患者[15]的血清水平一致。所有這些研究表明，近端小管(和較小程度的腎小球)是蛋白尿病尿液中miRNA15a的主要貢獻者。
最後，我們測試了該miRNA是否是信號通路(PKCα)下調的潛在生物標誌物，也可能是成功治療的一個指標。在體外應用selegiline(神經細胞[28]中PKCα水平的上調劑)，也大幅降低ET-1刺激的RPTECs中的miRNA15a水平至非刺激的背景值(圖3A)。在阿黴素模型中，在3周實驗期的最後一周用司萊吉林治療後，尿miRNA15a的高水平可降低50%(圖3B)。因此，即使在疾病過程開始後，這種療法也具有良好的耐受性和有效性，其效果可通過測量尿miRNA檢測到。由於這種藥物已經用於人類治療[29]，單胺氧化酶抑製劑可能提供一種新的治療方法，在人蛋白尿病中上調PKC水平，以防止ET-1介導的炎症信號級聯的激活。然而，正如miRNA15a並不完全隻針對腎元的某一種細胞類型，而是來源於足細胞和近端小管細胞，如細胞培養實驗所示(圖2)，selegeline所觀察到的效應是這一通路對miRNA15a在兩種細胞類型中的整體淨結果。
慢性蛋白尿的問題是在蛋白尿動物模型中，通過NF-κB含量的增加，形成近端小管上皮-間質轉變(EMT)和間質纖維化[30,31]。為了防止這一有害的過程，需要使用有效的藥物來控製NF-κB的增加，從而減少EMT和間質纖維化。對於第一個要求，我們證明了司來吉蘭就是這樣一種藥物，因為在阿黴素蛋白尿小鼠模型中，司來吉蘭阻止miRNA15a的成熟，miRNA15a負責細胞質轉錄複合體的降解，允許NF-κ b的核遷移增加。因此，尿miRNA15a水平是阻斷炎症NF-κB通路成功治療的一個有效指標。
對於第二個要求，我們必須證明單獨或聯合阻斷NF-κB通路是否足以預防EMT和慢性腎衰竭。這需要未來對不同疾病模型的研究，需要較長的治療時間，在治療和未治療的動物之間的差異可能會變得明顯，如蛋白尿大鼠模型[32]。這種治療理念與腫瘤學類似，例如，EGFR等受體突變導致通路的構成激活，而下遊靶點(如酪氨酸激酶抑製)會阻斷該通路。在我們的病例中，炎症途徑的“構成激活”是由慢性蛋白尿提供的，這不能充分預防或阻斷。選擇一個“下遊靶點”，這裏是NF-κB，用selegiline進行抑製治療，可能會防止某種陰性結果(即EMT和間質纖維化:待示)，盡管機製本身(即蛋白尿)仍在進行中。
缺乏明顯有效的藥物來保護近端小管細胞免受ET-1等蛋白尿條件下釋放的介質的有害影響，部分原因是無法控製所應用的藥物是否真正以足夠的濃度到達近端小管細胞。這可以通過miRNA15a等生物標誌物來實現，miRNA15a可以監測這些藥物的效果;也就是說，如果信號環路的激活被停止，miRNA15a的水平就會下降，或者在尿液中再也檢測不到miRNA15a。
總之，雖然這些實驗還有待進一步證實，但我們可以發現miRNA15a等miRNAs確實可以作為診斷的生物標誌物，並可用於監測蛋白尿條件下近端小管細胞特異性通路的治療效果，特別是由ET-1介導時。此外，我們的研究也可能是對這一概念的研究的鼓勵，特別是當基於遺傳的疾病，如先天性腎病綜合征、原發性FSGS或腫瘤誘導的MN，不允許克服慢性蛋白尿的基本病理機製。
Heike Loeser是由科隆大學醫學院的Koeln財富項目支持的。Melanie von Brandenstein是科隆大學科隆財富項目的博士後研究員。這項工作得到了瑪爾加和沃爾特·波爾基金會(給J.W.U.F)的一筆贈款的支持。
一個也沒有。
通訊作者(J.W.U.F)是這項工作的擔保人，因此，可以充分訪問研究中的所有數據，並對數據的完整性和數據分析的準確性負責。我們感謝安妮·斯科菲爾德·弗萊斯夫人在醫學英語方麵的幫助。
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文章類型:研究文章
引用:Loeser H, von Brandenstein M, Burst V, Richter C, Buettner R，等(2018)在腎小球疾病中，尿microRNA15a是由蛋白質和內皮素-1介導的炎症信號傳遞的生物標誌物。J Mol Med Clin app 2(1): dx.doi。org/10.16966/2575 - 0305.110
版權:©2018 Loeser H，等人。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。
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