摘要

該納米孔轉導檢測器(NTD)平台包括一個單一的納米尺度通道和一個工程或選擇的通道封鎖分子。通道電流阻滯劑分子被設計成提供獨特的平穩通道阻滯劑統計量，隨著傳感器與相互作用目標的結合，通道阻滯劑平穩統計量發生變化。在單分子表征中，NTD的功能類似於“納米鏡”，例如，一種可以觀察單個分子或分子複合物狀態的設備。用NTD儀器進行的觀察不像用顯微鏡那樣是在光學領域，而是在分子狀態分類領域。因此，在各種生物傳感、分析和單分子構象/結合研究中，NTD為單分子和瞬態絡合物的表征提供了一種新技術。納米孔檢測方法使用了隨機載波信號處理方法，該方法在之前的工作中開發和描述，包括模式識別的機器學習方法，可在分布式計算機網絡上實現實時實驗反饋和采樣控製。描述了基於核酸的換能器，它們是通道調製器，無論是綁定的還是未綁定的。發現核酸傳感器的封鎖模式主要由核酸的物理剛體(切換)模式和內部扭轉模式所主導。即使在通道捕獲換能器的各種高應變條件下，也看不到切換和扭轉以外的模式擴散。基於核酸和抗體的換能器可用於生物傳感、分析和治療應用。 The therapeutic transducers can offer targeted delivery to particular tissue type, or provide more complex targeted binding via chelation.

關鍵字

納米孔探測器;納米孔檢測轉導

縮寫

納米孔轉導檢測

簡介

納米孔轉導檢測器(NTD)平台[1,2]包括一個單一納米尺度的通道和一個工程或選擇的通道封鎖分子。通道封鎖分子被設計成當被拉入通道並通過電泳手段保持時，在探測器通道中提供電流調製封鎖。通道在分子的尺度上有內徑。對於大多數生物分子分析實現，這導致選擇內徑在0.1-10納米範圍內的通道來包含小的和大的生物分子，其中內徑在以下結果中使用的α -溶血素蛋白通道為1.5納米。鑒於通道的大小，它被稱為納米孔。在其他人的努力中，“納米孔”有時被用來描述100-1000納米範圍內的大通道，在這裏被稱為微孔。

為了在單分子通道中獲得捕獲狀態，需要一個真正的納米孔，並建立一個相幹捕獲信號，顯示非普通平穩信號統計量，納米孔的限製內徑通常需要為雙DNA通道調節劑的約1.5nm(正是圖1中所示的溶血素通道)。通過電泳方法，在通道的感興趣的時間間隔內捕獲調製阻滯劑。這是由施加的電位建立的，同時也建立了觀察到的通過納米孔的電流。

圖1:納米孔傳感器原理圖:經Winters-Hilt S[2]授權轉載。左圖:納米孔探測器由左室中葡萄球菌α溶血素毒素齊聚形成的脂質雙分子層中的單個孔和位於右上角的能夠測量微安培通道電流的膜片鉗放大器組成。中心:顯示在通道的順式前廳捕獲的生物素化DNA發夾分子，鏈黴親和素結合到附著在DNA發夾環上的生物素鏈接上。右圖:生物素化DNA發夾分子(Bt-8gc)。

提供通道封鎖的NTD分子還有第二種功能，通常是特異性地結合到一些感興趣的靶標上，根據結合狀態的不同，封鎖的調節方式有明顯的不同[2-4](例如圖2中生物素-鏈黴親和素的例子，或DNA退火)。因此，NTD調製器設計成雙功能:一端被捕獲並調製通道電流，而另一端，通道外暴露端，根據事件檢測設計成不同的狀態。例如，連接到抗體、抗體片段、適配體或核酸(用於退火-補體核酸檢測)等結合部分的通道外端。例子還包括“報告傳感器”分子(用於信號放大)，具有切割/非切割的通道外暴露端，通過例如UV或酶的方法[1]進行切割。通過使用帶有模式識別的信號處理來管理通道電流封鎖調製，並因此跟蹤工程到傳感器分子中的分子狀態，生物傳感器或分析儀得以實現。

圖2:結合傳感器具有固定水平封鎖的生物素-鏈黴親和素結合研究:單個封鎖事件的觀察結果以封鎖標準差(x軸)表示，並以觀察時間(y軸)標記。在這種情況下，標準偏差提供了一個很好的鑒別參數，因為傳感器分子被設計成不提供固定水平的封鎖(至少在未綁定時)，因此具有明顯高於典型噪聲或汙染物信號的標準偏差。在T=0秒時，引入1.0µM Bt-8gc，通過其平均值的個別封鎖標準差值在橫軸上顯示事件跟蹤。在T=2000秒時，引入1.0 μ M鏈黴親和素。隨後，觀察到的封鎖信號類別立即轉變為固定級別的封鎖信號，這可以從視覺上辨別出來。新的信號類型被推測是由於(Streptavidin)-(Bt-8gc)結合複合體捕獲。

在圖2中，我們看到Bt-8gc傳感器與鏈黴親和素結合時產生固定水平的阻斷。為了將捕獲的綁定傳感器“喚醒”到調製模式，以及檢查一般的chaotrope的影響，2M尿素在6000秒時引入，尿素濃度穩定增加到3.5M，提高8000秒。未觀察到綁定換能器的調製信號的變化，也未看到NTD性能的退化。使用Bt-8gc傳感器在尿素濃度高達5M(圖3)[5]的條件下對存在更極端朝異的NTD平台進行了進一步研究。如圖3所示，當超構象處於高濃度時，換能器具有兩種明顯不同構象或異構體的外消旋混合物。

圖3:Bt-8gc傳感器封鎖信號存在高尿素濃度:轉載經Winters-Hilt[5]授權。足夠強的尿素濃度(5M)會導致兩個環捕集變異體的外消旋化，而較弱的尿素(<2M)則不會。結果顯示，Bt-8gc在尿素濃度為0、2和3M時間隔30分鍾(垂直軸為1800 s)進行測量，在4M處間隔45分鍾，在5m處間隔60分鍾，x軸為信號阻塞平均值。結果與雙態環假設一致，也與觀察[2](見圖1)一致，不是由於尿素含量高，而是由於結合時的質量和電荷效應造成的高應變。

在之前的工作中，研究表明，使用nttd[3]可以確定一個特定的5堿基長度的核酸的存在，並且可以確定一個8堿基的DNA序列，具有非常高的特異性，這種特異性可以通過引入尿素作為chaotrope進一步增強。在處理集體結合事件(如DNA退火)時使用chaotrope可以更清楚地分離退火態和未退火態[2]。

8個和9個堿基對DNA發夾被用作通道調節劑[2]，其中調節劑具有共價連接的結合部分(生物素或鏈接抗體)，根據其通道捕獲的DNA發夾末端所顯示的通道調製來跟蹤其結合狀態(參見圖1和來自[1]的生物素-鏈黴親和素結合研究的其他圖)。在沒有使用連接子安排的情況下，采用了更為商品化的免疫- pcr標記方法，沿著這些方向進一步發展，形成了DNA“y -傳感器”平台(基於適配體的生物傳感見背景部分，單克隆抗體生物傳感見背景部分[4,6])。y -傳感器用於5-9堿基核酸上DNA-DNA退火的實驗，以及用於轉導dna -蛋白質結合事件:HIV整合酶和tata結合蛋白(TBP)[7,8]。所有這些努力的一個限製是調製所需的雙核苷酸的臨界長度，即使是在非結合狀態下，對於正在使用的α -溶血素納米孔平台來說，也在8到10個堿基對之間。(使用α -溶血素平台的原因已經在其他地方描述過，在這裏不再進一步討論。)短的雙工長度意味著報告分子在融化前隻能被觀察幾秒鍾或幾分鍾，這迫使NTD在傳感器/報告分子[9]上以快速采樣的“集成”檢測模式運行，而在單分子事件跟蹤模式下運行較少，而在其他情況下，單分子事件跟蹤模式可能是一些應用的最佳模式。

因此，在Bt-8gc換能器研究中揭示了NTD方法的兩個問題:(1)被綁定換能器固定電平封鎖;(2)在高應變條件下(如高朝變性)換能器本身的異構體分裂。在本文中，我們將展示如何消除這兩個問題。對固定能級問題和換能器異構體分裂問題作了進一步的介紹。背景部分給出了適體和抗體的背景。在討論中給出了工程NTD傳感器方法的討論，在實驗方法和結果部分描述了應變條件下模擴散(或缺乏模擴散)的關鍵測試。

固定級別的封鎖問題

有時發現換能器/報告分子的結合狀態不轉化為不同的切換離子電流流阻塞，而是轉化為固定能級阻塞(即，換能器在未結合時提供獨特的通道調製，但在結合[1]時不提供獨特的固定能級通道阻塞)。為了實現自動化的高精度狀態識別和跟蹤(並允許多重檢測)，有界和無界傳感器都必須具有獨特的通道調製，這一點非常重要。在這種情況下，切換到固定級別的封鎖被認為是電泳持有的大型複合體迫使通道捕獲端駐留在一個封鎖狀態的結果。這在之前的實驗中已經被探索過，在實驗中，一個鏈黴親和素塗層的磁珠被連接到生物素化DNA發夾上，這些發夾已知是良好的調節劑或較差的通道調節劑[10]。一旦將塗有鏈黴親和素的磁珠附著在生物素化的發夾上，就會發現用切割激光束(激光鑷子拖拽)輕輕脈衝納米孔通道環境，就會產生獨特的通道調製(見圖4)。最近發現，誘導的阻塞調製有兩種類型(chaotrope誘導的[5];激光鑷子誘導[10])。進一步的激光鑷子結果顯示不同的，重疊的，模式將在結果中給出，其中的實驗是用dna發夾傳感器在之前的研究中進行的。然而，對於方便的y型換能器，同樣可以通過簡單地使用未使用的臂來完成，如圖5所示(進一步見討論)。

圖4:(左)通道電流封鎖信號，封鎖是由生物素化的9GC DNA發夾20 bp莖(9GCbiodT-ext)產生的。經Winters-Hilt S[10]授權轉載。(中)通道電流阻斷信號，阻斷信號由9GC-ext-mag產生，9GC-biodT-ext分子附著磁珠。(右)通道電流封鎖信號，其中封鎖由9GC-biodT-ext與磁珠連接(9GC-extmag)產生，並由以4hz切割的激光束驅動。每幅圖都顯示了電流水平(單位為皮安)隨時間的變化(單位為毫秒)。

在圖5中，我們使用帶有兩個臂的Y拓撲(因為其中一個臂有一個珠附件)。莖的長度到連接可以被設計成調節，當捕獲像以前一樣。

圖5:用於高特異性結合檢測或單個蛋白結合/構象變化研究的y激光傳感器:經Winters-Hilt S[8]許可轉載。y型換能器的目的是有一個研究分子區域9，與一個單鏈核酸連接子區域10相連，該區域10可能是一個堿基(非堿基配對)，連接到一個單鏈核酸區域11和12，該區域11和12將退火到第二個核酸，以創建如圖所示的y形核酸結構。

在圖5中，經過退火處理的y型傳感器由兩個可能是LNA/RNA/DNA嵌合的核酸組成，其中第一個單鏈核酸由區域1-3和7-8表示，第二個核酸由區域10-12表示。配對區域{1,12}，{2,7}和{8,11}意味著彼此互補(標準的沃森-克裏克堿基配對)，並設計這樣退火的y傳感器分子意味著由一個折疊構象主導(如圖所示)。區域3是一個生物素修飾的胸苷環，通常大小為4- 5dT(這裏顯示的是5dT和2dt，一個生物素化的dT，然後另一個2dt)，它被設計得太大，無法進入和捕獲α -溶血素通道，因此經過處理的y傳感器在納米孔檢測器中隻有一個捕獲方向(無珠，區域4，附著)。區域4是鏈黴親和素塗層磁珠(易受激光鑷子脈衝影響)。由{1,9}區域組成的堿基區被設計成在納米孔探測器捕獲時產生切換封鎖的雙工核酸。堿基對區域的典型長度通常為8、9或10個堿基對。例如，研究分子(區域9)，一種抗體，通過免疫聚合酶鏈反應工業的商品化過程與單鏈核酸相連，因此是一種廉價的、成熟的分子構建製造方法。

換能器不穩定性:短壽命和異構體在應變下分裂

兩種扭曲構象，由於發夾環和莖雙構象的不同構型(如B, B*或A/B構象雙DNA)，已經從DNA發夾在其他應變條件下的結果中懷疑，如高壓設置[1]。因此，激光鑷子實驗中出現兩種DNA發夾通道阻斷模式是一致的。這兩種模式被認為是剛體構型變化，或“切換”，和DNA內部發夾構型變化，或“扭曲”。雖然在使用通道調製器時，產生的切換/扭轉模式信號分析更加複雜，特別是如果由激光鑷子誘導，這實際上是一個非常有利的結果，因為在物理相關的切換和扭轉之外的其他調製模式沒有看到。綁定換能器現在一般可以通過使用帶有激光激發的珠附提供調製狀態，高應變模態擴散顯然僅限於兩種類型，如果有足夠的觀察時間，這是一個非常易於管理的情況。因此，隨機載波分析[1]可以像以前一樣進行，隻是需要更多的訓練數據來“學習”更複雜的背景“載波”信號的特征。因此，傳感器問題仍然可以用激光鑷子通用(無處不在)傳感器設計來處理。此外，在專門的換能器設計中，有能力將內部信號的扭轉模式類型轉化為我們的優勢，這將在討論部分中討論。

短壽命的DNA換能器(在電泳驅動的捕獲應變環境中)和內部模式傳輸(過度扭曲模式)的問題是它們有太多的內部自由。如果有可能“鎖定”一些內部扭轉運動，那麼一個更強的發夾可能會產生，一個不太可能有扭轉調製在切換調製之上。這種核酸變體存在，被稱為鎖定核酸核苷(LNAs)。它們是一種核酸類似物，其中核糖環被鎖定在一個非常有利於沃森-克裏克堿基配對的配置中。通過從核糖環的2 ' -O原子到4 ' -C原子形成亞甲基橋來實現鎖定。LNA寡核苷酸可以用標準的磷酸酰胺化學方法合成(例如，與標準的酶催化過程兼容)，並可以與RNA和DNA[11]合並到嵌合體中。LNA對互補DNA或RNA的高親和力提供了更好的特異性和穩定性，並對外切酶和內切酶都具有耐藥性在活的有機體內而且在體外設置。親和力的增加導致更穩定的LNA發夾和其他LNA雙工配置。這在NTD環境中具有特殊的意義，因為專門設計的DNA發夾和y型換向器分子已經被確定為事件轉導分子，並且可以對LNA形式的換向器進行微小的更改(參見方法)，以保留轉導特性，但現在LNA[6]具有更長的壽命和改進的特異性和親和力屬性。生物素化發夾的LNA版本探索了鏈黴親和素結合在哪裏發生，在哪裏一個扭轉似乎占主導地位(因此隻有開關模式是重要的)，LNA/DNA嵌合傳感器分子在納米孔的高應變捕獲環境中的壽命現在是幾小時而不是幾分鍾[2,6,12]。

用於退火檢測的通用y型換能器(不需要激光鑷子)可以有如圖6所示的形式，其中LNA含量高的區域顯示在虛線框中，保護這些區域的分子免受終端磨損、環打開或連接打開的影響。

圖6:用於退火檢測特定病毒摘要存在的y型傳感器:經Winters-Hilt S[8]許可轉載。方框區域表示有利於LNA取代的區域，以保護這些區域的分子免受末端堿基對磨損、環開口或連接分支。

背景

下文的背景重點是通道換能器。納米孔實驗[1,12,16]的背景在這裏沒有詳細給出，因為重點是工程通道換能器。

Aptamer-based傳感器:適配體是對目標分子具有高特異性和高親和力的核酸，這些特性在單克隆抗體(mAb)診斷和生物傳感應用中非常有用。適體的選擇是通過一個被稱為SELEX的快速人工進化過程完成的。納米孔定向(NADIR) SELEX提供了一種加速SELEX過程並達到改進結果的方法，其中標準適體序列庫有一個約束，即序列的一部分自組裝(退火)，從而提供與納米孔檢測器的接口，提供調製阻斷，從而引入“隨機載波”(SCW)，從而實現NADIR設計/檢測過程[1,13]。受SCW約束，雙功能適配體結構已經滿足成為納米孔轉導報告器或事件“換能器”的標準。如果換能器有一個磁珠附著“臂”，那麼我們現在討論的是一個三功能分子，因此在接下來的討論中是y形DNA分子。然而，在某些情況下，適體設計可能相當複雜，例如當感興趣的結合目標涉及大分子特征(對於某些空氣或水汙染物)、大細胞表麵特征、重金屬螯合結合時，或者因為適體換向器天生就具有多個結合基團或功能而更加複雜。(見光盤。例如，連接的雙適體結構和雙適體/抗體結合部分。對於組織靶向抗體/適配體四功能換能器的排列，可以使用四向holliday結，類型的DNA分子，或通過更複雜的EDC連接器技術連接。NADIR增強SELEX程序在更複雜的適體設計設置中更有優勢。

在圖7中，中間和右邊的y型換能器由兩個可能是RNA/DNA嵌合的核酸組成，其中第一個單鏈核酸由區域1-5(中)或區域1-6(右)指示，第二個核酸由區域6-11(中)或10-15(右)指示。在左圖中，配對區域{1,9}，{2,4}和{5,8}是相互補充的(使用標準的WatsonCrick堿基配對)，並且被設計成退火後的y傳感器分子被一種折疊構象所主導(如圖所示)。區域3是一個圓環，通常大小為4dt，設計得太大，無法在α -溶血素通道中進入和捕獲，因此退火的y傳感器在納米孔探測器中隻有一個捕獲方向。由{1,9}區域組成的堿基區被設計成在納米孔探測器捕獲時產生切換封鎖的雙工核酸。堿基對區域的典型長度為8-10個堿基對。

圖7:離開了。用於高特異性適配體結合檢測的y型傳感器。中、右:用於檢測假設的miRNA結合位點和/或miRNA與已知miRNA結合位點相互作用的y型換向器:y型換向器的目的是將一個高特異性適配體連接在單鏈上，該單鏈可能是7區堿性(非堿基配對)核酸連接子，連接到6區適配體上。第6區適配體的草圖是為了顯示適配體的三維構象，其中g -四複合體的堆疊是適配體的一個常見但不是必需的特征。

圖8[11]顯示了Y型換能器的變化，其中圖7左圖中的適體被抗體取代，而圖8右圖顯示了Y型換能器的變化，在Y型換能器的莖區，堿基“Y”構象可以在有或沒有結合靶以及其核酸附件的情況下實現，需要對其進行處理。

圖8:用於高特異性抗體結合檢測的y型傳感器。

基於抗體的換能器和直接抗體糖譜分析:抗體是b細胞受體的分泌形式，其形式的區別在於重鏈區域的c端。圖9顯示了標準抗體示意圖。給出了常量重鏈序列(' CH '、' H '和' S '部分)、可變重鏈區域(' VH '部分)、可變輕鏈區域(' VL '部分)和恒定輕鏈區域(' CL '部分)的標準符號。舉個具體的例子，馬的IGHD基因[14]是重鏈的固定部分，其外顯子對應於CH1,H1,H2,CH2,CH3,CH4(S)，對於膜結合形式的IGHD，有兩個額外的外顯子，M1和M2是跨膜部分，因此，CH1,H1,H2,CH2,CH3,CH4(S)， M1, M2。在圖9中，長鏈和短鏈從左到右對稱，但它們的糖基化一般不對稱。關鍵的二硫化物鍵在鏈之間連接，每個VH和CH區域通常也有一個內部的二硫化物鍵。抗體的下部是水溶性的，可以結晶(記為Fc)。抗體的上部是抗原結合部分(標記為Fab)。

圖9:標準抗體示意圖:Karlsen KK[11]授權轉載。給出了常量重鏈序列(' CH '、' H '和' S '部分)、可變重鏈區域(' VH '部分)、可變輕鏈區域(' VL '部分)和恒定輕鏈區域(' CL '部分)的標準符號。完整的重鏈序列來源於VH部分和{CH,H,S}部分的重組(其中分泌區S也稱為CH4)。

圖10顯示了典型的n -糖基化抗體(馬的IGHD[14]的確切例子)。N-糖基化由雙天線N-聚糖(在人類中)和天冬酰胺(氨基酸' N '，即N-聚糖)之間的共價鍵(糖苷)組成。共價糖苷鍵是在細胞內質網和高爾基細胞器中最複雜的蛋白翻譯後修飾之一的酶作用下建立的，通常隻發生在序列“NX(S/T) - c端”的區域，其中X是“任何東西，但不是脯氨酸”，如圖所示，序列以c端為導向。經許可的治療性抗體通常顯示32種雙天線n -聚糖[15-20]，包括n -乙酰氨基葡萄糖胺殘基(GlcNAc，區域' 1 ');甘露糖殘基(Man， ' 2 '區域);半乳糖殘基(Gal，區域' 3 ')和唾液酸殘基(NeuAc，區域' 4 ')，如圖10所示。n -聚糖根據其唾液酰化程度和半乳糖殘基的數量進行分類:如果雙酰化(如圖所示)，則具有A2類。如果不對稱和單唾液酸化有A1類。如果沒有唾液化則中性(N類)。如果兩個半乳糖殘基(如圖所示)，則G2類，如果一個，則G1類，如果零，則G0類。 If there is an extra GlcNAc residue bisecting between the two antennae +Bi class (–Bi shown). If a core fructose is present (location near GlcNAc at base) then +F (–F shown). So the class shown is G2-A2. The breakdown on the 32 types is as follows: 4 G2-A2; 8 G2-A1; 4 G1-A1; 4 G2-A0; 7 G1-A0; 4 G0-A0 [20]. The N-glycans with significant acidity (A2 and A1) are 16 of the 32, so roughly half of the N-glycans enhance acidity. The other main glycosylation, involving O-glycans, occurs at serine or threonine (S/T). The main non-enzymatic glycations occur spontaneously at lysines (‘K’) in proteins in the blood stream upon exposure to glucose via the reversible Maillard reaction to form a Schiff Base (cross-linking and further reactions, however, are irreversible and associated with the aging process).

圖10:典型抗體n -糖基化:Karlsen K.K[11]授權轉載。典型抗體n -糖基化示意圖(取自馬的IGHD基因[14])，其中一個可能的n -糖基化位點位於CH2區域，三個可能的n -糖基化位點位於CH3區域。

抗體的堿基在調節免疫細胞活性方麵起著關鍵作用。堿基被稱為Fc區域，表示“片段，可結晶”，事實就是如此，為了將其與“片段，抗原結合”的Fab區域區分開來，Fab區域位於y型抗體分子的每條臂上。Fc區對特定抗原(與Fab區結合)觸發適當的免疫反應。Fab區使抗體具有抗原特異性;Fc區賦予抗體等級效應。IgG和IgA Fc區可以與中性粒細胞和巨噬細胞上的受體結合，將抗原與吞噬細胞連接，稱為調理化(調理蛋白將抗原粘附在吞噬細胞上)。這一關鍵細節可以解釋抗體與納米孔通道的相互作用。IgG, IgA和IgM也可以激活補體通路，其中C3b和C4b可以作為所需的調理蛋白。因此，抗體重鏈的c端和Fc糖基化結構，尤其是IgG，是一種高度選擇的結構，似乎是免疫受體所識別的，並且顯然是在NTD的情況下被識別為獨特的通道調節信號(單抗通道阻斷信號顯示在[10]的圖11和圖12中)。使用NTD，我們可以利用Fc糖基化(以及mAb糖基化和一般的糖基化)和c端區域的調理受體結合作用，使其具有通道調節作用。 This may also permit a new manner of study of the critical opsonization role of certain classes of antibodies (and possibly differentiate the classes in more refined ways) by use of the nanopore detector platform. The channel may also provide a means to directly measure and characterize antibody Fc glycosylations, a critical quality control needed in antibody therapeutics to have correct human-type glycosylation profiles in order to not (prematurely) evoke an immunogenic response.

圖11:多重抗體封鎖信號類:經Winters-Hilt S[10]許可轉載。一秒鍾的各種IgG區域捕獲的痕跡和它們相關的切換信號:在將單抗引入納米孔檢測器的分析腔(順式通道側，通常帶有負極)時產生的四種最常見的封鎖信號。其他信號阻塞也被觀察到，但不太頻繁或很少。

圖12:抗體-抗原結合-來自特定捕獲方向的清晰例子:經Winters-Hilt S[10]許可轉載。每個痕跡顯示了三分鍾記錄的前750毫秒，從抗體分子的封鎖信號開始，抗體分子的一部分插入α -溶血素通道，產生開關信號(a)。抗原在框架a的開始引入(100µg/ ml的200 kD多價合成多肽(Y,E) a- k)。在圖D中，我們看到一個過渡到一種新的阻斷類型，在沒有引入抗原的情況下是看不到的。

初步分析了納米孔探測器上的抗體封鎖研究，用於明確定義的合成多肽抗原[4,21]。在針對生物素、HIV和抗gfp的IgG亞類1單克隆抗體中也發現了類似的結果，所有抗體都產生了所需的調製信號，具有NTD換能器。Fc糖基化的關鍵作用已經被提到過，但在Fab區理解抗原-抗體結合方麵也有重要作用。疏水鍵非常難以用現有的晶體學和其他方法表征，通常貢獻了抗原-抗體鍵整體結合強度的一半[4,12]。生物分子的疏水基團在形成鎖和鍵互補形狀的同時排斥水。蛋白質-蛋白質相互作用中疏水鍵的重要性，關鍵位置的水化水，以及它們建立的複雜構象協商，可以通過納米孔檢測方法直接研究。抗體研究的進一步工作超出了本文的範圍，但將在其他地方介紹。

方法

納米孔探測器實驗

每次實驗都使用α -溶血素通道插入二植酰-磷脂酰膽堿/十六烷雙分子層，穿過直徑通常為20微米的水平特氟龍孔徑。α -溶血素孔具有2.0 nm寬的前庭開口，允許dsDNA分子被捕獲(當DNA分子轉移時)。雙分子層的有效直徑主要在1 ~ 25 μ m之間。這個值有一定的波動，取決於孔徑的條件，使用的納米孔站，以及雙分子層每天的應用。雙分子層兩側的70微升腔中含有1.0 M KCl, pH值為8.0 (10 mM HEPES/KOH)緩衝，除非緩衝實驗中鹽濃度、pH值或特性可能會發生變化。電壓施加於Ag-AgCl電極之間的雙分子層。DNA控製探針通常以10-20 nM的最終濃度添加到順式室。所有實驗均在室溫(23±0.1℃)下進行，使用Peltier設備。

被忽視的熱帶病控製探針

5個DNA發夾被用作高度敏感的對照(從經過PAGE純化的IDT DNA中獲得)，這5個DNA發夾在之前已經仔細描述過[22,23]。9個堿基對發夾分子共有8個堿基對發夾核心序列，加上鈍端末端可能存在的4種沃森-克裏克堿基對排列中的一種，即5 ' -G|C-3 '， 5 ' -C|G-3 '， 5 ' -T|A-3 '和5 ' -A|T-3 '。分別表示為9GC、9CG、9TA和9AT。9GC發夾的完整序列是5 ' -GTTCGAACGTT TTCGTTCGAAC-3 '。8堿基對DNA發夾(8GC)與9GC序列的核心8堿基對部分相同，隻是末端堿基對更改為5 ' -G|C-3 '(如5 ' -GTCGAACGTT ttcgttcgc -3 ')。每個發夾設計采用一個堿基配對結構。

被忽視的熱帶病傳感器

被忽視的熱帶病Y-transducer /記者調查:在SNP實驗中使用的y形ntd傳感器分子設計[1,4]，並在討論中引用，具有三向DNA連接幾何結構:5 ' -CTCCGTCGAC GAGTTTATAGAC TTTT GTCTATAAACTC GCAGTCATGC TTTT GCATGACTGC GTCGACGGAG-3 '。兩個連接臂在一個4t環中終止，其餘臂長度為10個堿基對，通常設計為鈍端。鈍端臂或“杆”被設計成這樣，當它被納米孔捕獲時，它會產生一個可切換的封鎖。y型換能器可以與基於適配體的治療方法相聯係[24-28]，這將在討論中討論。

生物素化DNA轉導器(來自IDT DNA, PAGE純化):

8GC-BiodT: 5 ' - GTCGAACGTT/iBiodT/TTCGTTCGAC -3 '

9GC-BiodT: 5 ' - GTTCGAACGTT/iBiodT/TTCGTTCGAAC -3 '

生物素化LNA/DNA嵌合換能器(來自Exiqon, HPLC純化):8GC-BiodT:5 ' - +G+TCGAA+C+GTT/iBiodT/ TT+CGT+T+CG+AC -3 '。8GC-Bt的LNA版本有8個以“+”開頭的LNA堿基，12個DNA堿基和1個生物素dT堿基。

9GC-BiodT: 5 ' - +G+CTTGAA+C+GT/iBiodT/TT+CGTT+CAA+GC -3 '。9GC- bt莖的LNA版本與基於DNA的9GC沒有相同的序列，除了帶有生物素附著的修飾dT外，隻有一個3dT環，有7個以“+”開頭的LNA堿基，14個DNA堿基和1個生物素dT堿基。

激光誘捕傳感器(從IDT DNA，高效液相色譜純化):20bp發卡帶4dT環:9GC-ext:

5 ' - gttcgaacgggtgagggcgctt ttgcgccctcacccgttcgaac -3 '

20bp帶5dT環的發夾，其中中心環dT被修改為與生物素連接:9GC-BiodT-ext:

5 ' -GTTCGAACGGGTGAGGGCGCTT / iBiodT TTGCGCCCTCACCCGTTCGAAC 3 '

磁珠的共軛

被鏈黴親和素包被的磁珠直徑約為1微米，質量約為1 pg。一些磁珠製備涉及使用牛血清白蛋白(BSA)緩衝液，這要求在納米孔檢測器上對牛血清白蛋白有耐受能力。這是單獨確認的濃度，高達8mg/mL BSA[6]的水平。

激光設置

激光照明的相幹半徑為635-25。光纖前的輸出功率為25mW，波長為635 nm。光束以4赫茲的頻率被切斷。在激光激發研究中，法拉第籠被移除。在沒有激光照明的情況下，移除籠子時看不到顯著的60Hz牆功率噪聲，但移除籠子後，在激光照明下可以清楚地看到60Hz的線噪聲。因此，60hz的線路噪聲在激光電源處被采集，並通過激光激發過程作為單獨的調製源傳輸到探測器環境中。在光纖之後，大約5-10mW的照明聚焦到大約1mm的照明直徑產生在納米孔探測器的孔徑。

數據采集和基於fsa的信號采集

根據實驗目標，數據采集和處理有兩種方式:(i)使用來自Axon Instruments (Redwood City, CA)的商業軟件來獲取數據，其中電流通常使用模擬低通貝塞爾濾波器在50 kHz帶寬下過濾，並使用Axopatch 200B放大器(Axon Instruments, Foster City, CA)耦合到Axon Digidata 1200數字化儀以20µs間隔記錄。施加電位為120 mV (反式一麵正)除非另有說明。在一些實驗中，使用Clampex (Axon Instruments, Foster City, CA)對過渡水平阻塞、電流和持續時間進行了半自動分析。(ii)使用基於Lab View的實驗自動化。在本例中，離子電流也使用Axopatch 200B片鉗放大器(Axon Instruments, Foster City, CA)采集，但隨後使用NI-MIO-16E-4 National Instruments數據采集卡(National Instruments, Austin TX)記錄。在Lab View格式中，數據經50khz的放大器單元低通濾波，並以20 μ s的間隔記錄。使用有限狀態自動機(FSA)從20 μ s的樣品流中采集信號[1,22,29]。

基於機器學習的信號處理

完成了有限狀態自動機(FSA)預處理和隱馬爾可夫模型(HMM)濾波，去除采集信號中的噪聲，並從中提取特征。一種配置中的HMM(用於控製探針驗證)以50個狀態實現，對應於電流阻塞，增量為1%，範圍從20%殘留電流到69%殘留電流[1,22]。編號為0到49的HMM狀態對應於所處理序列中的50個不同的當前封鎖級別。初始設置HMM的狀態發射參數，使能級L = j+20對應的狀態j (0 <= j <= 49)可以發射所有可能的能級，並將發射能級的概率分布設置為均值L和單位方差的離散高斯分布。狀態之間的所有轉換都是可能的，並且初始都是等可能的。每個封鎖信號通過對HMM參數進行5輪期望-最大化(EM)訓練去噪。EM迭代之後，從HMM中提取150個參數。從50個狀態的HMMEM/Viterbi實現中獲得的150個特征向量是:不同封鎖級別(來自Viterbi回溯狀態)的50個停留百分比，與不同狀態相關的發射概率分布的50個差異，以及來自初級和次級封鎖占領級別的50個“合並”轉移概率。所謂合並，是指從主要封鎖水平取躍遷概率，並將它們與來自第二大最主要水平的躍遷概率按分量相加，這對於壓縮雙狀態主要調製封鎖信號很有效。根據需要對HMM 50狀態實現進行更改，以包含所研究的信號類。

然後使用訓練過的支持向量機(SVM)對每個封鎖信號提取的150分量特征向量進行分類。支持向量機的訓練是離線進行的，使用的數據隻包含一種類型的分子作為訓練數據(袋式學習)[1,22]。

對於模式識別(PRI)采樣的實驗，通道封鎖捕獲信號在通過DAQ發送之前被過濾和放大。從基線下降後檢測到的前200毫秒通過TCP-IP協議發送到HMM軟件，該軟件為發送的每個信號生成一個配置文件。使用支持向量機分類器對hmm生成的剖麵進行處理，以確定信號是否可接受。如果信號是可接受的，繼續記錄的消息被發送到實驗室Windows軟件繼續記錄，分子不被放大器從通道中彈出。如果不是，放大器會短暫地反轉極性，將分子從通道中彈出。PRI采樣的納米孔實驗是在1:70的9GC:9TA[9]的混合物中進行的。

白蛋白可以插入雙分子層(膽固醇也可以)，最初這加強了雙分子層，降低了係統RMS電流噪聲，但最終，好事太多了，白蛋白可能聚集並導致雙分子層中斷，反過來，這可能危及整個實驗。可以引入多種緩衝修飾來保護雙分子層，包括阻斷白蛋白插入。然而，在這樣做的過程中，新的幹擾分子會被引入，從而破壞通道。然而，可以觀察到，隻有在協議沒有響應的情況下，新的幹擾問題才會成為問題，例如，如果封鎖沒有被識別為“壞的”封鎖並立即彈出(如果不立即彈出分子就會“卡住”)。可以使用自動彈出周期，將其設置為感興趣的實驗中每個封鎖所需的最小觀察時間，以幫助減輕壞信號問題。研究發現，信號的好壞識別對操作具有一定的輔助作用。一般來說，任何調製的信號都是好的，因此如果采用這樣的規則，即如果信號在其前0.5秒內非調製則拒絕該信號，這提供了一個非常好的操作設置。因此，PRI采樣可以間接地用於提供通道保護和長時間維持運行狀態。在本文中，信號處理隻對上述基於pri的通道保護至關重要。因此，下麵的結果是對信號模式類型數量的定性分析，而不是對封鎖信號直方圖剖麵的定量信號分析[1,12,16]。

結果

扭轉模式指示

實驗用生物素化的DNA20bp發夾(9GCbiodT-ext)與鏈黴親和素包被的磁珠(形成(GC-ext-mag)在ph8緩衝液中進行。傳感器DNA發夾莖長20個堿基對(20bp)，環大小5dt，胸苷激酶通過生物素的連接子修飾。這種形式的發夾被稱為9GC- biodt -ext，因為它是生物素化9GC控製分子的一個20bp的延伸，有一個9bp的莖。然後將發夾與帶有鏈黴親和素塗層的磁珠溶液混合，通過鏈黴親和素-生物素連鎖的方式，導致磁珠複合物連接到DNA發夾通道調節器(9GC-ext-mag)上。磁珠的質量基本上大於發夾，因此在捕獲時，扭轉模式被激發的可能性甚至更大(捕獲時將出現更大的角動量脈衝)，盡管它最初仍然相對罕見。然而，隨著實驗的進行，扭轉調製捕獲的可能性增加，因為更多的珠子與發夾結合得更緊密，從而產生更多的質量和電荷，從而捕獲時更大的角動量脈衝(圖13)。

圖13:一個較不常見的，短持續時間，全長9GC-ext-mag封鎖信號顯示(在擴散逃逸之前)，另一個信號的開始在最右邊。法拉第籠已經到位，42pA電平被視為之前的上一級切換(但由於籠到位，噪音比之前更小)。可以看到兩個明確的封鎖水平，並被認為與兩種不同的分子通道封鎖構型/構象通常相關。然而，toggle信號被認為描述了分子環/分子杆'扭曲'構象之間的切換，而不是在兩個通道封鎖構象之間的切換(其中分子內部構象相同)。

在生物素化的20bp DNA發夾[10]上，激光鑷子脈衝已經被發現可以誘導從固定水平到切換封鎖的轉變。然而，當時並不清楚，是否同時存在空間構型切換和扭轉構型切換，因為後者的切換之前沒有見過。然而，隨著實驗開始探索各種應變條件，如高尿素(如2-5M濃度的chaotrope，見圖3)[5]，高於120 mV應用電位(如150-180 mV)，更高的pH(9或更大)，或存在較大的束縛電荷/質量物體(如streptavidin, streptavidin-bead，抗體，或大抗原附著)，兩個環/杆扭轉配置的存在開始變得明顯。

在圖14中，我們可以看到由於9GC-ext-mag在激光鑷子脈衝(使用偏離目標的邊緣照明強度梯度聚焦的切割激光束)存在的通道阻塞。上麵的“扭轉水平”可以簡單地看到(42pA水平)，然後切換到較低水平的扭轉封鎖，它有自己的，激光誘導，切換，在粘附在較低扭轉狀態的較低封鎖水平在軌跡的末端(粘附可能是由於磁珠附著其他生物素化發夾增加電荷和整體電泳驅動力)。圖14中右邊的圖像是較低扭轉狀態的激光誘導切換的放大視圖，當它最終“卡在”一個水平時。注意清晰的60hz線噪聲明顯在放大視圖。這種噪聲在沒有激光照明的9GC-ext-mag屏蔽中是不存在的，所以60Hz的線路噪聲是在激光束中傳播的，而不是通過沒有屏蔽的環境。研究發現，當以4Hz的頻率切割時，激光在較低的扭轉狀態下誘導最顯著的開關。

圖14:離開了。使用激光鑷子調製(無籠)的9gc -ex -mag阻斷信號:上層扭轉狀態現在在~45pA，而較低的扭轉狀態本身在30pA和15pA之間切換(磨損的“尖峰”到0pA，如其他發夾研究[22,23]所示)。右圖:放大的低電平扭轉切換，然後粘在它的低電平(注意60Hz的噪聲來自激光;沒有激光，但沒有籠子，沒有60Hz的噪音)。波束斬波頻率為4Hz，但“喚醒”隨機調製是非周期性的。

顯然，扭轉開關在空間構型開關的基礎上增加了複雜性，這影響了換能器的設計。使用LNAs來鎖定扭轉配置有望消除環杆扭轉切換的複雜性，但在大多數情況下，信號處理並不是不能管理雙切換模式信號。因此，調整LNA/DNA嵌合體中的LNA含量的主要目的是選擇結合事件到通道調製器的最有效的傳輸，其中最有效的可能是通過長DNA臂的大質量長係繩的扭轉模式傳輸(圖15和16)，而對於低質量短係繩連接，最有效的換能器可能需要非常剛性的LNA/DNA嵌合體(大量LNA)。關於扭轉模式和長壽命LNA/DNA嵌合換能器[6]的進一步結果超出了本文的範圍，因此隻在需要時進行討論。

圖15:使用扭轉模式調製的單分子研究用y型換能器:經Karlsen KK[11]許可轉載。區域14表示感興趣的研究分子(用於抗體檢測的抗體或用於構象/結合研究的蛋白質)，其中一個磁珠被附加用於激光鑷子調製(區域6)，其中換能器設計有足夠的LNA替換，以允許激光鑷子激勵以扭轉模式脈衝傳輸(顯示在編號為{3,10}的區域)，同時根據研究分子狀態保持明顯不同的信號。在圖15中，配對區域{1,16}，{2,11}，{4,9}，{12,15}被設計成以所示的顯性構象退火，通常長度最少為8或9個堿基對。區域13和區域{12,15}中的連接臂是當杆(區域{1,16})被捕獲並固定在納米孔上時，在區域14和區域6之間提供足夠空間間隙所需的連接臂。

圖16:使用扭轉模式調製的單分子退火研究用y型換能器:經Karlsen KK[11]許可轉載。區域10表示感興趣的單鏈核酸研究分子:其區域10切片退火到換能器的區域3的核酸;其中，附加了用於激光鑷子調製的磁珠(區域6)，其中，換能器設計有足夠的LNA替換，以允許激光鑷子激勵作為扭轉模式脈衝通過退火目標區域傳輸。扭轉模式隻會在退火目標被束縛的情況下發射，產生非常不同的通道調製信號。

討論

傳感器設計有適配體或抗體，可能有磁珠附著

當使用較長的莖長DNA發夾捕獲時，觀察到雙端主要位於一個固定的封鎖構型[4]，這可能是由於電泳力強烈地將較大電荷核酸拉入通道。在早期的測試中，對固定封鎖狀態進行退火的y型換向器通常沒有問題，特別是對於未結合的情況，但如果結合的對象“很大”或核酸的長度很長，或者通過退火到免疫pcr標記的抗體或其他蛋白質來處理商品化的連鎖，則在結合時就會變得複雜。當處理具有大質量/電荷附件的較長的DNA發夾時，有時會發生相反的情況，大的結合延伸似乎會誘導偶爾的突變，而之前沒有觀察到這種突變(如鏈黴親和素塗層珠結合生物素化的20bphp發夾[6])。為了有一種可控的方式來擁有一個簡單的基於核酸的傳感器，然後嚐試通過連接到磁珠來恢複獨特的調製封鎖信號，在磁珠上激光鑷子的“拖動”可以用於在單分子水平[10]注入動能。最初的結果表明了一種簡單廉價的探頭設計的可能性，如下所述，但考慮到在激光鑷子調製下觀察到的封鎖模式的擴散，尚不清楚對更複雜的換能器調製信號進行隨機載波信號處理是否可能。在最近的研究中，對DNA發夾調製器的異構體有了更好的理解，然而，這表明捕獲的雙工核酸中存在兩種調製模式:位置/方向和扭轉/拉伸，其中新的信號並發症是由於扭轉/拉伸模式的出現。由於雙工核酸通道阻斷隻有一種新的模式類(扭轉模式)，限製了模式擴散，可以進行SCW信號處理。

因此，當激發充分時，納米孔捕獲的DNA發夾調製器不僅可以顯示空間/方向切換，還可以顯示扭轉/扭轉切換。當激光鑷子脈衝引起信道調製時，這種效應最為顯著。對激光鑷子誘導調製器的新認識表明，誘導調製器的信號類別限製在那些已經看到的，從而可以實現一個易於管理的信號分析平台。在實踐中，需要一種能產生最簡單的、非固定水平的平穩信號封鎖的隨機信道調製器，這樣就可以使用隨機載波(SCW)信號處理方法。調製器中的位置和扭轉切換模式共同構成了一個更複雜的SCW係統，但可以通過調製器在其不同狀態(如連接到綁定或未綁定分析物)期間的足夠樣本觀測來管理。如前所述，使用基於dna的通道調製器的一個相關並發症是它們的壽命很短，直到熔化。在涉及同分異構體[6]的應用中，通過使用鎖定核酸核苷(LNAs)消除了這個問題，其中LNAs通過鎖定核酸來減少扭轉模式，從而在扭轉/拉伸方麵限製其內部自由度。這可能是一件好事，因為它將簡化上麵提到的SCW信號訓練。但是，簡單的SCW分析並不重要，隻要SCW學習可以用可管理的訓練數據完成。因此，通過“鎖定”增加LNA的調製器來完成的主要優化是有效地調諧具有更大或更小扭轉模式事件傳輸的分子變體。 For annealing-based detection this could be critical since the properly annealed nucleic acid duplex will transmit twist mode excitations notably differently than improperly annealed DNA (if even present). For this reason some modulator arrangements with lasertweezer pulsing may have their bead attachment on the same arm as the annealing binding site (see Figures 15 and 16), and have a low number of LNA bases in the LNA/DNA chimeras in the binding template (keeping blunt terminus and Y-nexus regions strongly LNA based to prevent melting as much as possible, but permitting twisting). In Figure 15 a description is given for a Y-transducer for single molecule studies using twist mode modulations. A ‘twist mode’ specialized Y-transducer for single molecule annealing studies using twist mode modulations is shown in Figure 16. Figure 17 shows a 4-way transducer (a.k.a, a Holliday Junction transducer), for dual aptamer/antibody tissue-targeting functional aptamer delivery studies [24-28], where a modulatory transducer is enabled by lasertweezer coupling.

圖17:四路換能器(又稱Holliday Junction換能器):用於雙適體/抗體組織靶向功能適體傳遞研究，其中通過激光鑷子耦合使調製換能器生效。

在圖16中，配對區域{1,16}，{2,12}，{4,9}，{13,15}被設計成以所示的顯性構象退火，通常長度最少為8或9個堿基對。區域14的環被設計成不傾向於通道捕獲，而強烈傾向於區域13-15的莖環區域的單一構象。

y形DNA轉導分子也是一種多功能結構，可作為中間退火複合體進行測試(詳情見單核苷酸多態性SNP檢測努力[4])。通過設計y型換向器對核酸靶序列進行退火，使SNP變異出現在Y-nexus區域[4]，從而使經過退火的y型換向器的通道調製有明顯的差異，可以實現對y型DNA轉導分子的高精度SNP檢測。NTD方法提供了一種非常高精度的SNP變異檢測手段，當使用更高特異性的LNA形式的換能器時，這種方法可能會進一步提高[6,12]。

螯合劑設計，靶向治療適體傳遞設計

將兩個y型換能器臂功能化用於結合實際上導致了許多其他選擇，如雙適體分子(見圖18，可能用於重金屬螯合)，雙適體/抗體換能器(見圖19，用於腫瘤定向適體傳遞)，其中有兩種藥物獲得FDA批準[24-28]，以及雙DNA退火測試(見圖19)。

圖18:左、右:用於高特異性雙適體結合檢測的y型傳感器:左圖所示的y型傳感器意味著有兩個高特異性適體，由單鏈(可能是堿性(非堿基配對)核酸連接子連接，第8區為第7區左臂連接子與左臂適配體連接子，第3區為第4區右臂連接子與右臂適配體連接子。第4和第7區域的適配體草圖是為了顯示適配體的三維構象，其中g -四複合體的堆疊是適配體的一個常見的，但不是必須的特征。

圖19:左、右:用於高特異性雙適體/抗體結合檢測的y型傳感器;以及用於雙重檢測特定病毒摘要是否存在的y型換能器。

在圖18中，y型換能器由三個可能是RNA/ DNA嵌合的核酸組成，其中第一個單鏈核酸用區域1-4表示，第二個單鏈核酸用區域5和6表示，第三個核酸用區域7-10表示。配對區域{1,10}，{2,5}和{6,9}是相互補充的(標準的沃森-克裏克堿基配對)，並且設計成退火後的y傳感器分子被一種折疊構象所主導(如圖所示)。堿基區，包括區域{1,10}，被設計成形成雙工核酸，當被納米孔探測器捕獲時產生切換封鎖。堿基對區域的典型長度通常為9或10個堿基對。同樣的y型換能器顯示在右側，但有一個結合靶物11，定位為螯合型結合配置，這除了在個體適體與對象11的單獨結合過程中在其部分上可能的螯合結合外。

結論

激光鑷子實驗中出現了兩種DNA發夾通道阻斷模式。這兩種模式被認為是剛體構型變化(或“切換”)和DNA內部發夾構型變化(或“扭曲”)。通過使用含有不同數量LNA的LNA/DNA嵌合體，扭轉模式可以被鎖定。傳感器的熔化時間也可以直接設計。因此，通過使用帶有激光激發的珠附，高應變束縛的換能器可以在調製狀態下使用，高應變模態增殖限製為兩種類型(在目前所見的結果中)。使用隨機載波分析和充分的訓練數據來“學習”換能器的“載波”信號特征，然後可以建立一個穩定的NTD生物傳感平台。因此，傳感器問題似乎可以通過涉及LNA/ dna嵌合換能器的激光鑷子通用(無處不在)換能器設計解決。

確認

作者要感謝META LOGOS公司的研究支持和研究許可。作者要感謝Meta Logos的納米孔技術人員Eric Morales, Joshua Morrison, Evenie Horton，以及新奧爾良兒童醫院SWH實驗室的納米孔技術人員的早期工作:Amanda Alba和Andrew Duda。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:溫特-希爾(2017)納米孔傳感器工程與設計。J Mol Med Clin app 1(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2575-0305.108

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出版的曆史:

收到日期:2017年3月23日

接受日期:2017年4月19日

發表日期:2017年4月26日