摘要

摘要目的:與fms相關的酪氨酸激酶(FLT3)在造血和免疫係統發育中的作用。研究表明FLT3突變在急性髓係白血病(AML)的發病機製中起著關鍵作用。FLT3—內部串聯複製（(- itd)）被報道為兒童AML的重要預後標記。但對於急性淋巴母細胞白血病(ALL)目前還不清楚，目前關於ALL的數據非常少。研究調查FLT3土耳其兒童急性白血病的突變是非常少的。也FLT3-D835兒童白血病的突變狀態尚未得到很好的研究。因此，本研究的目的是篩選和分析FLT3土耳其兒童急性白血病患者的突變。

材料與方法:研究人群為27例小兒糖尿病患者(- itd)變異和183名兒童患者FLT3-D835他們被診斷為急性白血病。(- itd)采用實時聚合酶鏈反應(PCR)法中的熒光HRM (High Resolution Melting)分析進行突變篩選。FLT3-D835采用限製性片段長度多態性(RFLP)方法檢測變異。

結果:我們發現(- itd)在我們的研究組(n=27)中有33.3%發生突變。FLT3-D835篩查顯示7.6%的患者攜帶雜合子基因型。統計分析表明FLT3-D835雜合子突變與診斷和危險組相關。但沒有發現同樣的相關性(- itd)突變樣本。我們也沒有發現FLT3患者的突變和臨床特征。

結論:我們觀察到的百分比很高FLT3土耳其兒童急性白血病患者的突變與以前的研究相比。我們的結果顯示了……的重要性FLT3突變在兒童急性白血病患者中作為一種重要的預後和診斷標誌。

關鍵字

兒童急性白血病;(- itd)；FLT3-D835；酪氨酸激酶

縮寫:

AML:急性髓係白血病;ALL:急性淋巴細胞白血病;人力資源管理:高分辨率熔煉;PCR:聚合酶鏈反應;RFLP:限製性片段長度多態性

簡介

fms相關酪氨酸激酶(FLT3)是一種受體酪氨酸激酶，對造血祖細胞的增殖、存活和分化具有重要作用[1,2]。FLT3是III類酪氨酸激酶受體之一，由細胞外的五個免疫球蛋白樣結構域、一個細胞內近膜(JM)結構域、兩個帶激酶插入的激酶結構域和一個c端尾部[3]組成。FLT3該基因位於染色體13 (13q12)上，有24個外顯子[4]。高表達FLT3已在急性髓係白血病(AML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)和慢性髓係白血病(CML)的爆發危象[5]中得到證實。Rosnet等[6]也證明了這一點FLT3在AML和B-ALL白血病細胞中表達。兩種類型的FLT3白血病中已經描述了突變:FLT3內部串聯副本((- itd))和酪氨酸激酶結構域(TKD)突變。的JM域中有一個串聯重複序列FLT3由14和15號外顯子編碼。TKD突變FLT3包括第二酪氨酸激酶結構域的突變，尤其是在密碼子D835處。所有這些突變產生的氨基酸序列的變化，並引起本構激活FLT3激酶活性[7]。(- itd)據報道，兒童AML的突變患病率為11-33%，並被認為是預後不良的一個重要獨立預後因素[8-12]。(- itd)等位基因比(突變-野生型比大於0.4)也被發現是兒童AML[13]複發的重要預後因素。有人建議說(- itd)在診斷AML和治療[9]時，應考慮將其作為常規檢查進行檢測。其他類型的FLT3突變的頻率較低(- itd)急性白血病患者的突變。很少有研究進行調查FLT3土耳其兒童白血病患者的突變[14,15]。因此，在我們的研究中，我們旨在篩選(- itd)通過HRM和PCR分析TKD突變，尋找分子白血病可能的遺傳標記。

材料與方法

患者樣本

研究人群為27例(- itd)突變和183例患者FLT3-D835他們的年齡在1到15歲之間，被診斷為急性白血病，入住土耳其安卡拉的Losante兒童血液學腫瘤醫院。將血液樣本放入含有edta的試管中，用MagNA Pure自動DNA分離儀(德國曼海姆羅氏診斷公司)從外周血白細胞中提取DNA。在研究前收集患者父母的知情同意書。

的決心FLT3突變

為(- itd)基因突變:(- itd)用real - time PCR (gene -4uFLT3-ToolsetTM Roche Diagnostics, Gmbh, Manheim, Germany)使用基於基因型譜的熒光HRM分析。選擇陰性對照作為基線，繪製不同的圖。因此，所有其他樣品的熒光圖相對於這個樣品。對熒光信號進行分析，並將顯著差異作為[16]突變的指標。

為FLT3-D835基因突變:用PCR法進行基因擴增。用引物FLT3-D835突變如下:正向引物:5 ' -CCG CCA GGA ACG TGC TTG-3 ';反向引物:5 ' -GCA GCC TCA CAT TGC CCC -3 '。用引物FLT3-D835突變的設計如Moreno等人先前描述的[17]。密碼子835編碼一個天冬氨酸氨基酸，為限製性內切酶EcoRV提供一個識別位點;因此，突變體可以被檢測到通過酶限製位點的喪失。

然後用適當的限製性內切酶(EcoRV使用測序儀(Beckman-Coulter CEQ 2000 XL DNA分析係統，美國)對不同條帶進行測序。

統計分析

采用社會科學統計軟件包(SPSS) 20版本軟件進行統計分析。之間的相關性FLT3采用單因素方差分析(One way ANOVA)分析突變、診斷組或危險組。Mann-Whitney檢驗用於確定相關性FLT3患者的突變和臨床和實驗室特征。P值小於0.05為有統計學意義。

結果

選取27例診斷為急性白血病的兒童進行篩選研究(- itd)突變。通過熒光HRM分析進行篩選(圖1)。圖1顯示了HRM分析的評價(- itd)突變。

圖1:HRM檢測FLT-ITD突變

27名兒童的詳細臨床實驗室資料見表1。我們確定(- itd)其中9例(33.3%)發生突變。27例患者中有1例(3.7%)同時攜帶兩種疾病(- itd)突變和FLT3-D835雜合子表型。的分布(- itd)診斷陽性患者為:AML (n=5);b (n = 3);Pre B-ALL (n=1)。過渡段過渡段陽性患者的中位年齡為8歲(範圍:2-13)，過渡段過渡段陰性患者的中位年齡為5.25歲(範圍:1.2-10)。男性患者比例均高於女性患者(- itd)陽性(男性:66.6%;女性:33.3%)和(- itd)陰性(男性:61.1%;女性:38.8%)樣本。中位白細胞計數(WBC)(- itd)陽性患者為12600 × 10⁹l^－1而在(- itd)陰性患者為12150 × 109 L-1。中位血紅蛋白(Hb)水平(- itd)陽性患者為9.3 g dL^－1而在(- itd)陰性患者為8.3 g dL^－1．中位血小板(PLT)(- itd)陽性患者為75000 × 10⁹l^－1而在(- itd)陰性患者為26000 × 10⁹l^－1．正中骨髓爆發(- itd)陽性患者占98%(- itd)陰性患者100%。CD34中位數(- itd)陽性患者占10%(- itd)陰性患者占35%。患者的診斷分布及臨床特征總結見表2。

特征	(- itd)積極的病人	(- itd)負病人
沒有病人	9	18
診斷不。（％）
AML	5 (55.5)	4 (22.2)
前b	1 (11.1)	8 (44.4)
b	3 (33.3)	2 (11.1)
所有	0	2 (11.1)
JMML	0	1 (5.5)
所有	0	1 (5.5)
年齡中位數	8 (2 - 13)	5.25 (1.2 -10)
性,沒有。（％）
男性	6 (66.6)	11 (61.1)
女	3 (33.3)	7 (38.8)
中位數白細胞數(× 10)9l－1）	12600	12150
中位Hb (g dL－1）	9.3	8.3
中位PLT (× 109l－1）	75000	26000
BM爆炸中位數(%)	98	One hundred.
中位數CD34 (%)	10	35
T(9、22)
積極的	1	3.
負	8	15

表格1：包括27例患者的臨床特征和突變狀況FLT3基因突變篩查

表2:包括27例患者的臨床特征和突變狀況FLT3突變篩選WBC:白細胞;Hb:血紅蛋白;PLT:血小板;BM: Bone Morrow;WT:野生型;HR:高風險;標準風險;MR:中度風險，NA:不可用。

篩查FLT3-D835對183名被診斷為急性淋巴母細胞白血病或髓係白血病的兒童進行了突變。采用RFLP法進行篩選(圖2)。實驗結果顯示，183名兒童中有14名(7.6%)攜帶雜合子基因型。雜合子患者的基因測序顯示在C .32705位點有雜合子的“C/ a”變異。14例雜合子患者中有9例(64.2%)被診斷為Pre B-ALL。14例雜合子患者中2例(14.2%)診斷為B-ALL。其餘雜合子患者(14例中有3例)的診斷為T-ALL、ALL和JMML。

圖2:a)PCR擴增FLT3-D835地區。b)擴增片段的消化產物，用於檢測FLT3-D835突變。

實驗結果表明FLT3-D835雜合子突變和診斷(p=0.003)以及風險組(p=0.045)。兩者之間沒有相關性(- itd)突變和診斷或風險組。我們探索了相互關聯的可能性FLT3突變與患者的臨床特征(年齡、WBC、PLT、Hb、CD34和BM blast)無相關性。

討論

的意義FLT3在正常的淋巴造血幹/祖細胞功能已經知道。因此FLT3突變在白血病的發病中起著至關重要的作用。(- itd)突變是成人AML中最常見的突變之一，約有20-27%的患者發生[9,18-21]。在小兒急性髓細胞白血病患者中(- itd)突變比成年患者[20]低(5.3-22.2%)。這方麵的研究並不多FLT3-D835兒童急性白血病患者的突變。Liang等人[22]進行了調查FLT3-D835在兒童AML患者中發現了3.3%的突變頻率。Nasiri等人[23]研究FLT3-D835在100名兒童急性白血病患者中發現該突變的頻率為3.7%，在ALL患者中為1.3%。在沙特兒童ALL患者和塞爾維亞兒童AML患者中進行的研究顯示FLT3-D835突變率分別為2.1%和9.5%[24,25]。據我們所知，隻有兩項研究進行了調查FLT3土耳其兒童急性白血病患者的突變[14,15]。Ozbek等人[14]報道FLT3- ITD突變率為4%，並進行了觀察FLT3-D835僅有1例患者存在點突變雜合度(2.0%)。Karabacak等[15]在ALL患者中發現7.5%的FLT3- ITD突變，在AML患者中發現22.5%的FLT3- ITD突變。他們沒有識別FLT3 /跆拳道他們任何一個病人的基因突變。在研究中，我們發現(- itd)55.5%的AML確診患者和22.2%的ALL確診患者發生突變。FLT3-D835雜合子率為7.6%。因此，我們的結果顯示更高(- itd)而且FLT3-D835與Ozbek et al.[14]和Karabacak et al.[15]相比，Ozbek et al.[14]采用PCR法進行篩選(- itd)突變。但我們更喜歡用人力資源管理分析來識別(- itd)突變。HRM分析方法比PCR[26]更靈敏。我們的高(- itd)突變率可能是由於我們的分析方法敏感。此外，與Ozbek和Karabacak研究相比，我們的結果在由AML患者和ALL患者組成的研究組中顯示了差異和顯著性，我們觀察到7.6%FLT3-D835白血病組的雜合性。

我們研究組的一個病人表現出(- itd)突變和FLT3-D835點突變雜合性一起。該患者為8歲女童，診斷為B-ALL，屬於高危組。她有12000 (× 10)⁹l^－1白細胞計數，10.5 (g dL^－1) Hb, 115000 (× 10⁹l^－1) PLT計數，18% BM爆炸和8% CD34。細胞遺傳學檢測顯示她的骨標本中有8號三體。她在28歲時第一次進入緩解期^th化療那天。但18個月後，她被診斷為複發。報道的雙突變病例非常少[14,17,27]。這些研究是針對AML患者進行的。在報道的研究中，雙突變攜帶患者在治療期間或複發後死亡。據我們所知，這是第一例雙重感染的病例FLT3突變，8三體和ALL。旁邊FLT3突變、三體8可能是該患者預後不良的原因。因此,雙FLT3ALL突變可能與AML患者預後不良和複發有關。

在我們的研究中，我們發現了顯著的相關性FLT3-D835雜合子突變和診斷(p=0.003)以及風險組(p=0.045)。但沒有檢測到相似的相關性(- itd)突變和診斷或風險組。

Ozbek等人[14]報告沒有相關性FLT3在由AML患者組成的研究組中，基因突變和年齡、性別、白細胞計數、母細胞率或FAB分類。Karabacak等人[15]得出結論，實驗室結果與FLT3 / ITDALL和AML患者均呈陽性。但是他們發現FLT3 / ITD陽性和年齡增加。我們發現兩者之間沒有相關性FLT3我們研究中患者的突變和臨床特征(年齡、WBC、PLT、Hb、CD34和BM blast)與Özbek和Karabacak的研究相似。但也有一些研究發現，高白細胞計數和高骨胚細胞百分比正相關(- itd)陽性樣本[9,23]。

我們的統計分析顯示FLT3-D835雜合子突變和診斷(p=0.003)以及風險組(p=0.045)。這個結果表明FLT3-D835突變可作為ALL的預後標記，對診斷有幫助。眾所周知，(- itd)突變是急性白血病預後不良的標誌。但我們沒有發現類似的相關性(- itd)突變和診斷或風險組。這一結果可能是由於我們的小而混合的研究小組。

細胞遺傳學預後因子在臨床應用中更受青睞。但需要加強對突變狀態等分子因素的分析和臨床應用Flt3, mll, npm1, cepa尤其是在正常核型的情況下。

我們的研究是為數不多的分析FLT3土耳其兒童急性白血病患者的突變狀況。它還指出了……的重要性FLT3-D835ALL預後突變。

利益衝突

作者聲明他們沒有任何利益衝突，包括與所包括的主題或材料相關的具體經濟利益、關係和/或附屬關係。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Akin DF, Mumcuoglu M, Oner DA, Ozturk M, Ezer U，等(2016)土耳其兒童急性白血病患者FLT3基因突變(FLT3 - itd和D835)的篩選。J Mol Med Clin app 1(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2575-0305.104

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收到日期:8月31日

接受日期:10月17日

發表日期:10月21日