摘要

原發性尿中白蛋白濃度的增加導致足細胞和小管細胞的凋亡和纖維化，是慢性腎髒疾病功能惡化的主要原因。本研究顯示，大鼠原代腎細胞中過量的白蛋白攝取幾乎立即導致凋亡因子Bax的線粒體積累。

我們發現，腎病患者顯示細胞缺氧hif -1α標誌物水平較高，且其依賴於腎功能損害和蛋白尿水平。作為不可逆腎損傷的標誌，硬化症的進展伴隨著促凋亡因子Bax表達的逐漸增加。

我們得出結論，白蛋白引起的腎病兒童疾病是由細胞凋亡控製係統紊亂和伴隨細胞缺氧引起的。

關鍵字

腎病綜合征;白蛋白;毒性;HIF-1α;伯靈頓;疣狀

簡介

蛋白尿腎病伴慢性腎髒疾病(CKD)是一個迅速增長的世界性公共衛生問題。CKD由多種原因引起，包括糖尿病、腎小球腎炎、高血壓、感染和多囊腎病[1]。大多數形式的CKD是進行性的[1,2]，其特征是腎小球熱選擇性[3]紊亂、腎小球硬化、蛋白尿、足細胞丟失和腎小球小管連接斷開[4,5]。蛋白尿是腎功能進行性喪失的一個有充分文獻記載的預測因子，也被認為是結構性腎髒損傷和功能喪失的一個原因[6-9]。

線粒體固有凋亡通路的激活是由Bcl2家族中促凋亡成員Bax在線粒體外膜的積累啟動的，Bax在線粒體外膜寡聚並滲透到線粒體內膜[10]。本文報道了大鼠原發性近端小管細胞(RPTC)吸收白蛋白後線粒體Bax積累、線粒體膜去極化的時間序列。

適用於CKD中腎髒損傷的主要病理結果是腎小球硬化、血管硬化、小管間質纖維化。原發性損傷後腎元的適應性變化無法再被時間補償，最終導致不可逆的疾病——疤痕、硬化和腎元的進一步丟失，導致終末期CKD (ES-CKD)的形成[5]。炎症在慢性腎髒病變的發生和進展中起著重要作用，是原發性和持續性的違例，是其他疾病的發病機製的基礎。包括腎病綜合征在內的慢性腎髒病理的腎髒組織學特征為典型的炎症體征，即白細胞浸潤、充血、纖維化等。除了炎症，纖維化在腎病綜合征中也有作用。伴隨這些疾病的有腎素-血管緊張素-醛固酮係統的激活、氧化應激、內皮功能障礙等[1-3]。上述病理生理損傷均可能伴有細胞凋亡。細胞凋亡是腎髒疾病發生時發生的程序性細胞死亡，在腎髒生理中起著重要作用。細胞凋亡的有害作用實際上是腎髒炎症、瘢痕、腎功能喪失期間大量腎髒細胞丟失的一個來源。依賴於凋亡激活的兒童腎病綜合征不可逆腎髒損傷的分子機製可能是CKD治療中的一個潛在的治療問題。

材料和方法

病人

對在烏克蘭基輔第7兒童臨床醫院小兒腎科住院的53名腎病綜合征患者(年齡10至15歲)進行了腎活檢檢查。所有患者均按當地方案進行治療。激素敏感型腎病綜合征24例(45,28%)，激素依賴型腎病綜合征29例(54,72%)。進行常規方法以外的綜合檢查(檢查、血壓監測、血液常規及生化檢查、每日蛋白尿測定、腎髒尿沉及濃縮能力研究、腹部超聲等)，免疫組化評估凋亡依賴性腎小球及小管間質損傷。通過腎小球濾過率(GFR)評估腎功能損害水平(慢性腎病分期，CKD)。GFR采用Schwartz公式計算。I期CKD指GFR正常或高(GFR >90 mL/min);II期CKD - GFR = 60-89 mL/min;IIICKD期- GFR = 30-59 mL/min;IV期CKD - GFR = 15-29 mL/ min; stage V CKD - GFR <15 mL/min.

免疫組織化學

腎組織(3 μm切片)在處理前進行脫蠟和複水。抗原提取在檸檬酸緩衝液(10 mM檸檬酸，0.05% Tween 20, pH 6.0)中煮沸20分鍾。切片用Triton X-100 0.3% (Sigma-Aldrich NV/SA, Bornem，比利時)在PBS中處理20分鍾。PBS洗滌三次後，切片用阻塞緩衝液(5%牛血清白蛋白和Triton X-100 0.1%在PBS中)孵育1小時。兔多克隆抗bax抗體(Santa Cruz, CA, USA)在PBS中以1:50稀釋5%牛血清白蛋白，在4℃下過夜。PBS洗滌三次後，切片與次要Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(1:500)在室溫下孵育1h。細胞核用DAPI反染。所有樣品在相同的條件下，染色時間相同。每種染色的所有記錄都在一天內使用相同的增益設置完成。切片安裝在imumount (Thermo shon, Midland,Canada)，用Leica TCS SP倒置共聚焦掃描激光顯微鏡使用25x /0.8NA油浸鏡觀察。使用ImageJ軟件(NIH Image, Baltimore, MD, USA)進行圖像分析。每個部分的三個區域進行了分析。

免疫印跡法檢測Bax、HIF-1α

在Laemmli樣品緩衝液中溶解的蛋白質通過SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝膠中分解，轉移到聚偏二氟乙烯膜上。然後將膜阻塞在5%脫脂牛奶TBS-T (136 mM NaCl, 10 mM Tris, 0.05% Tween 20)中，並使用Bax和HIF-1α Ab(細胞信號技術，丹弗斯，MA，美國)和肌動蛋白小鼠單抗(BD, LexingtonKY，美國)在室溫下免疫印跡1小時。以小鼠肌動蛋白單抗作為加載對照。用TBS-T洗滌三次後，與馬蘿卜過氧化物酶標記的抗兔或抗小鼠二級抗體在室溫下孵育1小時。膜用TBS-T洗滌三次。用化學發光底物ECL觀察蛋白條帶。用密度分析法對蛋白質含量進行定量分析。

細胞

如前所述，RPTC是從20日齡雄性Sprague-Dawley大鼠腎髒中製備的。在瑞典進行的研究遵循了卡羅林斯卡學院有關實驗動物的護理和使用的規定，並獲得了斯德哥爾摩北方動物研究倫理評估委員會的批準。取出腎髒，置於室溫0.9% NaCl中。皮層層被解剖並置於Hank的平衡鹽(Invitrogen, Grand Island, USA)溶液中，37°C，用火拋光巴斯德移液器輕輕混合。在含有1%胰蛋白酶抑製劑的溶液中洗滌細胞兩次，反應停止。洗滌後，等量的細胞懸浮液被鍍在24孔培養皿中12毫米的玻璃蓋上。細胞在補充的DMEM (20mM HEPES, 24mm NaHCO)中培養3天_3.，青黴素10µg/ml，鏈黴素10µg/ml，胎牛血清10µg/ml)，含5% CO的玻璃蓋玻片₂在37°C。在第二天在體外當細胞被證明保持其近端小管的大部分特性時，將細胞單獨暴露於0、5、10或20 mg/mL的脂肪酸和無內毒素的牛白蛋白(Sigma-Aldrich, St.Louis, USA)，與瓦巴因(Sigma-Aldrich, St.Louis, USA)或與載體(PBS)中8或18小時。

伯靈頓易位評估

如前所述培養RPTC。在第二天在體外當它們被證明保持了近端小管的大部分特征時，細胞被暴露在線粒體靶向的綠色熒光蛋白CellLight下^®線粒體- gfp BacMam (Life Technologies, Grand Island, USA)在培養箱中過夜。第三天在體外在另一組實驗中，細胞用10 mg/mL白蛋白處理0、15、30或45分鍾。在Bax免疫染色中，細胞固定在4%的PFA中，用冷PBS洗滌一次，並用Triton X-100 (Sigma-Aldrich NV/SA, Bornem, Belgium)處理。小鼠單克隆抗bax [6A7] Ab一級抗體(Abcam, Cambridge, UK)在4°C下塗抹過夜。對照組進行同樣的處理，但忽略了一抗。次要Alexa Fluor 546山羊抗小鼠IgG IgG (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)在室溫下應用1小時。使用蔡司LSM 510激光掃描共聚焦顯微鏡和63X/1.4NA油物鏡將細胞安裝並觀察。利用Matlab圖像處理工具箱對線粒體的Bax易位進行分析。

統計數據

采用變異統計方法(STATISTICA 6.0)和非參數統計方法(MannWhitneytest)進行統計分析。結果以Mean±sem表示，p <0.05為差異有統計學意義。

結果

我們檢測到所有腎病綜合征患者血清中細胞缺氧標誌物(HIF-1 α)水平均高於對照組。此外，腎衰竭水平(GFR評估)與細胞缺氧之間的相關性已被證實。CKDⅰ期組HIF-1α水平高於對照組的28.6%(與對照組相比P<0.01)， CKD II-III期組HIF-1α水平高於對照組的41.3%(與對照組相比<0.01)(圖1)。

對腎病綜合征患者血清中HIF-1α水平和每日蛋白尿相應水平的個體分析顯示，蛋白尿水平高的患者也表現出高水平的HIF1a(圖2)。

這些數據表明慢性缺氧依賴於腎髒濾過屏障的損傷程度，並證明了缺氧和CKD進展的直接影響。

促凋亡因子Bax在腎病綜合征患者腎組織中的表達

我們分析了促凋亡因子Bax在腎病綜合征形態學變異-局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)患者中的表達水平和定位。FSGS分期由腎小球硬化麵積水平決定。假設≤25%腎小球麵積對應的硬化水平為FSGS的I期，FSGS的II期- 25-50%，III期- 50-75%，IV期- 75-100%。對局灶性節段性腎小球硬化兒童腎活檢中Bax表達的分析顯示，在腎小球和小管間質段均存在高水平的Bax表達。與小管-間質段相比，FSGS I-II期腎小球內的免疫信號水平較高(43,57±0,88 a.u vs 24,9±0,41 a.u, P<0.01)。當完全性腎小球硬化出現時，周圍小管-間質段出現高水平Bax(13,7±0,42 a.u vs 22,5±0,65 a.u, P<0.01)(圖3)。

Вах轉位到線粒體是白蛋白毒性的一個主要事件

內源性凋亡途徑是由凋亡因子Bax轉位到線粒體啟動的，Bax在線粒體外膜滲透促進凋亡[3,11]。在本研究中，我們使用白蛋白誘導RPTC細胞凋亡。

圖1:腎病綜合征患者及對照組血漿中HIF-1α水平的變化。A - HIF-1α水平;B -HIF-1α免疫反應性;* (p < 0 05。WB - Western Blotting。

圖2:腎綜合征兒童hif -1α水平與日蛋白尿值的相關性

為了進一步描述線粒體參與白蛋白毒性，我們進行了時間序列研究，監測Bax和線粒體在白蛋白暴露大鼠近端小管的共定位。使用濃度為2.5 mg/mL的白蛋白。共聚焦顯微鏡分析免疫標記的bax和表達GFP的線粒體的共定位(圖4)。共定位以時間依賴性的方式增加，在2.5 mg/mL白蛋白孵育2小時後增加顯著。

討論

腎病綜合征的發病機製涉及炎症，導致不可逆組織損傷的進展和發展。缺氧是炎症發展的重要環節。HIF可能影響腎髒損傷的發病機製是通過調節炎症反應。微環境的變化，如缺氧，強烈影響炎性細胞的募集和功能[9]。此外，缺氧已被證明可誘導細胞凋亡，其中HIF-1發揮著複雜的作用。HIF-1α的表達與細胞凋亡及促凋亡因子如caspase-3、Fas、Fas配體等顯著相關。這一發現已被證實在體外模型(8、9)。

Bcl2蛋白家族中兩個主要的促凋亡和抗凋亡成員Bax和Bcl-xL之間的關係在決定細胞生存和死亡之間的平衡中起著至關重要的作用。我們發現，細胞對白蛋白的攝取導致Bax在線粒體周圍的快速積累，導致線粒體膜的失效和凋亡過程[10]的啟動。

在這裏，我們發現HIF-1α和凋亡因子Bax的過表達在腎病綜合征兒童中都有一席之地，這意味著慢性缺氧是該隊列患者中控製細胞凋亡係統紊亂的一個因素。我們的數據表明，缺氧水平、Bax過表達和CKD的分期之間存在相關性。我們發現腎病綜合征兒童腎小球硬化的進展伴隨著促凋亡因子活性的增加。Bax水平的拓撲結構與FSGS程度的相關性表明，蛋白尿影響下腎小球和小管間質疾病的發展在特定範圍內發生。

圖3:Bax表達在FSGS不同階段的局部特征。DAPI -核可視化;腎組織中的Bax - Bax免疫信號。* -腎小球，* p<0,05。

圖4:與2.5 mg/ml白蛋白孵育的RPTC中促凋亡因子Bax(紅色)的免疫熒光染色。細胞轉染線粒體標記BacMam 2.0(綠色)。計算Bax/線粒體共定位峰數。* * p < 0.01。采用Mann-Whitney U檢驗進行統計分析。實驗重複了四次。

在常規治療的基礎上，進一步研究調節細胞凋亡的藥物對腎病患者腎髒保護的分子機製具有重要意義。

確認

這項工作得到了烏克蘭基輔第7號兒童臨床醫院腎髒科的支持，該工作由撥款0105U 003769資助。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Burlaka I(2016)白蛋白誘導的腎病綜合征原發性疾病:實驗和臨床數據。J Mol Med Clin app 1(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2575-0305.103

版權:©2016 Burlaka I.這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可條款發布，該許可允許在任何媒體上不受限製地使用、發布和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2015年11月06

接受日期:2016年1月18日

發表日期:2016年1月24日