摘要

背景:研究mTOR/p70S6K信號通路與早期生長反應1 (Egr1)在調節去卵巢(OVX)小鼠認知功能衰退中的作用。

方法:采用Morris水迷宮(MWM)和電生理檢查，評估ovx -小鼠和Sham小鼠認知功能的變化。采用實時定量聚合酶鏈反應和Western blot檢測OVX組和Sham組腦室內雷帕黴素治療前後海馬組織中Egr1、mTOR和p70S6K的表達。此外，在SH-SY5Y細胞中轉染Egr1幹擾片段或Egr1過表達質粒後監測mTOR和p70S6K的表達。

結果:逃逸潛伏期顯著增加;與Sham相比，ovx -小鼠在目標平台象限的時間縮短，突觸可塑性受損。此外，與Sham相比，ovx小鼠海馬區Egr1、mTOR和p70S6K表達水平明顯升高。雷帕黴素治療後，OVX小鼠mTOR/ p70S6K和Egr1表達明顯下調。此外，在SH-SY5Y細胞中，無論是Egr1幹擾片段還是Egr1過表達質粒轉染都沒有改變mTOR和p70S6K的表達水平。

結論:我們的數據表明，與OVX認知能力下降相關的Egr1表達增加是由mTOR/ p70S6K信號調節的。有趣的是，mTOR抑製劑-雷帕黴素降低Egr1水平，可能是絕經後認知能力下降的潛在治療靶點。

關鍵字

認知障礙;早期生長反應1;mTOR / p70S6K信號通路;卵巢切除術;雷帕黴素

簡介

輕度認知障礙(Mild cognitive impairment, MCI)是阿爾茨海默病(Alzheimer 's disease, AD)的早期臨床表現，其特征是學習和記憶障礙[1,2]。如今，超過20%的80歲以上的人受到AD的影響。流行病學數據預測，到2050年，全球[3]將影響3500多萬人，這將造成沉重的社會和經濟負擔。到目前為止，從現有的治療藥物中獲得的減緩這種疾病進展的益處有限。

絕經期婦女，由於雌激素水平的下降，容易發生認知障礙[4,5]。雌性齧齒動物卵巢切除是一種公認的模擬人類絕經後病理生理變化的模型[6,7]。我們之前的研究結果[8]和其他實驗數據[9]表明，去卵巢的齧齒類動物雌激素水平下降與整體大腦活動下降和記憶力下降有關，特別是海馬依賴的學習[10]。研究人員Orawan等曾報道，切除卵巢的小鼠不僅血清17-雌二醇水平和子宮重量降低，而且在新型物體識別測試中物體識別能力下降，在y迷宮和水迷宮測試中空間認知能力下降[11]。

早期生長反應1 (Egr1)屬於轉錄因子的鋅指家族[12,13]，參與多種介導生長、增殖、分化和凋亡的機製[14-16]。最近有研究表明，Egr1的改變與記憶缺陷的進展有關[17,18]。Gersten等研究發現，在猴免疫缺陷病毒感染的海馬中，海馬相關學習記憶的關鍵分子Egr1被下調，導致認知[19]缺失。有趣的是，我們最近的研究表明，去卵巢小鼠的Egr1信使RNA (mRNA)和蛋白質水平升高，這與認知障礙[20]有關。

mTOR屬於一個特定的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。mTOR蛋白存在於兩個mTOR蛋白複合物mTORC1和mTORC2中，對雷帕黴素[21]的抑製作用具有不同的敏感性。p70S6K(絲氨酸/蘇氨酸激酶核糖體蛋白)是mTOR活性[22]調節的主要下遊靶點之一。近年來，越來越多的研究表明mTOR信號通路與認知缺陷密切相關[23,24]。此外，大量證據表明，在AD患者中發現mTOR信號通路活性升高[25,26]。caaccamo等報道，抑製mTOR信號通路可以挽救Tg2576小鼠的記憶缺陷，這些小鼠是廣泛使用的AD[27]動物模型。從機製上看，mTOR信號的減少可以恢複海馬基因信號[28]的表達。這些結果表明，過度活躍的mTOR信號通路可能是衰老促進AD發展的分子途徑。

有趣的是，Egr1和mTOR/p70S6K信號的異常表達分別與認知障礙有關。Egr1的過表達與mTOR/p70S6K信號活性之間是否存在潛在的聯係還有待研究。因此，本研究通過研究OVX小鼠mTOR/p70S6K信號通路和認知功能的變化，進一步明確Egr1表達與mTOR/p70S6K信號通路的潛在關係。希望通過我們的研究，在未來的臨床實踐中為絕經後女性認知障礙的預防和治療提供線索。

材料和方法

動物和手術

雌性ICR小鼠(中國江蘇省南京醫科大學醫學動物中心)，實驗開始時體重25-30 g(8-12周)，在整個研究過程中使用。所有動物均置於標準明暗循環條件下，平均溫度(SEM)為23°C(±1°C)。小鼠(n=50)用水合氯醛(500 mg/kg IP)麻醉，隨機分為兩組，分別接受雙側卵巢切除術(n=25)或無菌手術技術腹側入路假手術(n=25)。目視檢查證實卵巢被完全切除。在所有手術前後，五隻老鼠被關在一個塑料吊籠中，並被允許自由獲得食物和自來水。該研究獲得了南京醫科大學第一附屬醫院動物與人類倫理委員會的批準。所有的努力都是為了減少動物的痛苦和減少使用的動物數量。

莫裏斯水迷宮試驗

采用Morris水迷宮(MWM)測試小鼠的學習記憶能力。它被分為四個象限:東南、西南、東北和西北，一個10厘米長的黑色圓形逃生平台放置在一個固定的位置，大約在水麵下2厘米。在25°C的室溫下暴露，水是不透明的，泳池上塗了黑色無毒的天婦羅漆。連續5天訓練小鼠尋找隱藏平台，每天4次訓練試驗。如果鼠標在60秒內到達平台，則允許它在平台上停留10秒;否則，它將被輕輕地引導到平台上，並保持在平台上10秒。探頭測試期間，視頻跟蹤係統記錄了到達平台(逃逸延遲)和在目標象限所花費的時間。

藥品監督管理局

通過立體定向裝置進行腦室內注射。小鼠用2%水合氯醛(20 ml/kg)麻醉，並放置於立體定向裝置(Kopf Instruments, Tujunga, CA)。通過注射印墨的初步實驗確定了注射部位。植入右側側腦室(後側0.3 mm，側側1.0 mm，胸側2.5 mm) 26規格的單導套管(plastic One, Roanoke, VA)。術後，在每個引導套管中插入一個28號假套管(plastic One, Roanoke, VA)。針的插入和鹽水的注射對生存率、行為反應或認知功能都沒有顯著影響。

雷帕黴素溶解在二甲基亞碸(DMSO, Sigma, St Louis, MO, USA)中，然後溶解在生理鹽水中，最終濃度為20 mg/kg。DMSO以最終濃度為2%的濃度作為車輛對照。用步進電動微注射器(Stoelting, Wood Dale, IL, USA)以0.5 ml/min的速度注射藥物(最終體積0.6µl/小鼠)。雷帕黴素(1.0 mg/kg)或等體積對照在2分鍾內逐漸給藥。

細胞培養和處理

SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞係(ATCC, Shanghai, China)是許多研究中非常流行的闡明阿爾茨海默病分子機製的細胞模型[29,30]。SH-SY5Y細胞培養於添加10%熱滅活胎牛血清(中國杭州天航)的杜爾貝科改良Eagle 's培養基/F12中，37˚C含5% CO2的潮濕氣氛中。為了評估Egr1和mTOR/p70S6K信號通路之間的關係，我們用Egr1過表達質粒(GV141- Egr1質粒)、GV141-Egr1對照(載體)、Egr1 siRNA和si-Egr1對照(si-Egr1 NC) (Genechem, Shanghai, China)轉染SH-SY5Y細胞，使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)。同時將mTOR抑製劑雷帕黴素(4µM)作用於細胞，進一步驗證了實驗結果。轉染或雷帕黴素治療48小時後收集細胞進行總RNA分離或蛋白質純化。

RNA提取和實時熒光定量PCR

使用基於trizol的商業試劑盒(Takara Shuzo Co. Ltd, Kyoto, Japan)，按照製造商的說明進行新鮮海馬組織的均質化和總RNA的分離。每個RNA樣品的純度通過在260和280 nm處的吸光度比來確定。用含0.005%核酸染料的1.2% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳評價RNA製劑的完整性，Goldview (Shanghai SaiBaiSheng, Shanghai, China)。提取的RNA含有核糖體28S和18S RNA，吸收強度比為1.0-1.5，用於qRT-PCR。在實時PCR反應中，以cdna為模板進行擴增，使用定量SYBR綠色PCR試劑盒(Takara Shuzo Co Ltd, Kyoto, Japan)量化目標基因的mRNA水平。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)或U6作為樣品加載和歸一化的內部對照。比較Ct(閾值周期)法與算術公式(2^——ΔΔCt)用來測定mRNA的相對含量。

免疫印跡分析

總蛋白樣品在含有蛋白酶抑製劑和磷酸酶抑製劑的RIPA緩衝液中均質。使用BCA蛋白測定試劑盒(KC-430;陳Kang)。用8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質樣本，並轉移到聚偏二氟乙烯膜上(Millipore, Billerica, MA)。在37˚C下，用5%脫脂牛奶或5%牛血清白蛋白在tris緩衝鹽水+1% Tween 20(TBST)中阻塞膜1小時。然後用適當的一抗孵育膜:兔抗磷tor (p-mTOR)抗體(1:1000,Ab109268;Abcam，倫敦，英國)，兔抗mtor抗體(1:1000,Ab87540;Abcam)，兔抗磷p70s6k (p-p70S6K)抗體(1:1000,Ab109393;Abcam)，兔抗p70s6k抗體(1:1000,Ab32359;Abcam)，兔抗egr1抗體(1:5000,ab194357; Abcam), and rabbit anti-tubulin antibody (1:5000, ab176560; Abcam) overnight at 4°C. After five washes with TBST for 10 minutes at 37°C, the membranes were incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (Beijing ZhongShan, Beijing, China) for 1 hour at 37°C. Bands were detected using an ECL detection kit (Amercontrol Biosciences,London, UK).

免疫熒光和共聚焦成像

為了通過免疫熒光和共聚焦顯微鏡來評估細胞內egr1和mTOR的表達水平，SH-SY5Y細胞被培養在聚d-賴氨酸包被的覆蓋物上24小時。然後在覆蓋物上的細胞被固定在4%多聚甲醛的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中20分鍾，PBS衝洗一次，在0.1% Triton X-100中滲透，在1% BSA, 50 mM甘氨酸和2%正常血清中阻塞。使用針對以下蛋白質的一級抗體:兔抗mtor抗體(1:100)，兔抗egr1抗體(1:100)，在4°C下過夜。次日，用PBS衝洗蓋玻片，然後與FITC(異硫氰酸熒光素)標記的二抗孵育，室溫下敷1 h。為了染色細胞核，加入1 μg/ml(w/v) 4 '， 6-二胺基-2-苯林多(DAPI, Sigma, USA) 5分鍾。在Olympus fluview 1000激光掃描共聚焦顯微鏡上使用20倍和40倍的數字孔徑1.42物鏡獲得共聚焦免疫熒光圖像(1024×1024像素)。

電生理分析

迅速取出腦組織，放置於含氧人工腦脊液(ACSF)中，ACSF由(mM) 124NaCl, 2CaCl組成₂， 4.5KCl, 1.0 MgCl₂26 nahco_3.1.2不₂PO4和10d -葡萄糖，通過95% O起泡調整到pH7.4₂/ 5%股份有限公司₂混合物。冠狀腦組織切片(400毫米厚)使用振動切片機(micro切片機DTK 1500, Dousaka EM Co，日本京都)在冰冷含氧(95% O₂/ 5%股份有限公司₂) ACSF。

為了記錄，切片被轉移到持續灌注30˚C含氧ACSF (2ml/min)的室中。在BLA中記錄刺激誘發的種群峰值(PS)，方法是用玻璃微管填充2m NaCl (4-5 MΩ)，連接到Axoclamp2B放大器(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)。使用pCLAMP軟件(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)對PS響應進行采樣。通過繪製興奮性突觸後電位(EPSP)隨0.1 mA至1.1 mA刺激強度的斜率，建立了輸入輸出(I/O)曲線。EPSP從激發PS的閾下強度到激發最大反應的閾下強度不等。為了誘導長期變化，我們進行了單列100 Hz、1 s、50%最大刺激強度的高頻刺激(HFS)。為了評估長期增強(LTP)，在hfs後繼續記錄與hfs前相同的記錄60分鍾，數據以hfs前平均值的百分比表示。成功的LTP誘導需要穩定階段(hfs後30分鍾>)的PS振幅增加至少超過20%。

統計分析

數據以均數±標準差表示，采用SPSS 20.0統計軟件包(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)對結果進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Scheffe多區間檢驗。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對組間差異進行一般評價，采用Scheffe多區間檢驗對兩組間差異進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

去卵巢12周小鼠認知行為的變化

在訓練過程中，所有小鼠發現隱藏平台的時間逐日減少，但在訓練試驗最後一天，12周齡的OVX小鼠明顯比年齡匹配的假手術小鼠表現出更長的逃避潛伏期(P<0.05, n=25;圖1 a)。與Sham小鼠相比，12周齡OVX小鼠在隱藏平台之前所處象限的停留時間更短(P<0.01;圖1 b)。如圖1C所示，Sham小鼠的探索特征典型遊泳模式的特征是目標象限的距離明顯更長，而OVX小鼠的同心圓遊泳路徑代表平台交叉減少。

OVX對海馬LTP誘導的影響

為了探討卵巢切除對神經元的影響，我們研究了穿孔通路-顆粒細胞突觸的電生理變化。如圖1D所示，在0.1 ~ 1.1 mA的刺激下，切除卵巢的12周小鼠的EPSP斜率始終小於年齡匹配的Sham小鼠(P<0.05;n = 6)。HFS可誘導Sham小鼠海馬穿孔徑粒細胞突觸EPSP顯著增加，持續時間至少60分鍾(稱為LTP)。然而，在去卵巢小鼠中，類似的HFS不能誘導LTP(圖1E)。

小鼠海馬中Egr1和mTOR通路的表達

與Sham組相比，12周齡OVX小鼠海馬組織中Egr1 mRNA和Egr1蛋白表達水平顯著升高(P<0.01;圖2 c)。值得注意的是，我們發現在OVX小鼠中mTOR/p70S6K信號通路mRNA水平也上調。如圖2A和2B所示，卵巢切除後12周，海馬區mTOR和p70S6K mRNA表達量分別比正常小鼠高1.45倍和1.38倍(P<0.05)。此外，我們的研究結果表明，OVX小鼠不僅mTOR和p70S6K總蛋白上調，Ser2448位點的phospho-mTOR和Ser371位點的phospho-p70S6K均顯著高於Sham小鼠(P<0.05;圖2 g)。

為探討Egr1與mTOR信號通路的關係，采用MWM試驗後的OVX小鼠經腦室注射(i.c.v)給予mTOR抑製劑雷帕黴素(1.0 mg/kg)治療一周。與對照相比，雷帕黴素處理負向調節了Egr1 mRNA的表達(P<0.01;圖2F)，以及mTOR信號通路(P<0.01;圖2D和2E)。蛋白變化結果與mRNA分析結果一致(P<0.05;圖2 h)。

SH-SY5Y細胞中Egr1表達與mTOR信號通路的關係

通過免疫熒光和共聚焦顯微鏡，評估了SH-SY5Y細胞中Egr1和mTOR的亞細胞定位。Egr1的亞細胞定位主要在核周細胞質和細胞核中(圖3A)，而mTOR主要在核周細胞質中(圖3B)。接下來，我們用siEgr1片段或過表達Egr1質粒轉染細胞，研究Egr1對mTOR/p70S6K表達的影響。轉染過表達egr1質粒或si-Egr1片段48 h後，SH-SY5Y細胞中mTOR和p70S6K的mRNA和蛋白表達與對照組相比均無變化(P>0.05;圖4 a-4h)。為了進一步證實Egr1與mTOR/p70S6K的相關性，最後用雷帕黴素(4 μ M)處理細胞48小時。與上述結果一致，雷帕黴素對OVX小鼠海馬組織中Egr1 mRNA表達有負向調節作用(P<0.01;圖5C)，以及mTOR/p70S6K信號通路(P<0.01, P<0.05;圖5A和5B)。雷帕黴素治療後的蛋白質水平也有類似的結果(P<0.05; Fiure 5D).

討論

在本研究中，我們通過MWM測試證實了卵巢切除後12周小鼠的學習和記憶能力可能受到損害，包括逃避潛伏期增加，在目標平台象限停留時間縮短，這與我們之前的結果[31]相似。此外，我們還發現OVX和Sham小鼠的電生理檢查有顯著差異，去卵巢小鼠的EPSP斜率始終小於Sham小鼠，OVX出現LTP誘導的缺陷。一般用EPSP斜率和LTP誘導來評價神經元的突觸可塑性，而突觸可塑性與認知功能密切相關[32,33]。許多研究表明，雌激素可顯著增加海馬樹突棘和突觸的密度，其在認知方麵的保護功能近年來已被充分發現[34,35]。因此，在我們的研究中，卵巢切除12周後小鼠缺乏雌激素會損害突觸可塑性，最終導致認知能力下降。這些結果得到了其他一些關於哺乳動物模型中降低雌激素水平後電生理變化的研究的支持[36,37]。

圖1:卵巢切除術後12周認知功能的變化
一個:卵巢切除(OVX)和假手術(Sham)小鼠在其他三個非靶象限中尋找平台的逃逸潛伏期比較。B:各組在Morris水迷宮(MWM)訓練5天期間，探頭試驗在目標象限遊泳的時間。C:各組MWM第6天探針試驗代表性路徑跟蹤圖。D:輸入輸出(I/O)曲線。EPSP斜度由0.1 ~ 1.1 mA電流的射孔通路誘發。每個點代表EPSP斜率的組均值(SEM)。E: 100hz - cs誘導LTP後OVX和Sham小鼠切片通路顆粒細胞突觸傳遞的變化。* * * P < 0.05, P < 0.01。

圖2:去卵巢小鼠(OVX)和假手術小鼠(Sham)海馬組織中Egr1、mTOR和p70S6K的表達
mTOR信使RNA水平的定量逆轉錄聚合酶鏈反應分析(一個而且D), p70S6K (B而且E)及Egr1 (C和F)在去卵巢小鼠和雷帕黴素治療小鼠。G: Western blot檢測卵巢切除術後12周Egr1、mTOR和p70S6K蛋白水平。H:雷帕黴素治療一周後Egr1、mTOR、p70S6K相對蛋白水平。* * * P < 0.05, P < 0.01。

圖3:共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察SH-SY5Y細胞中Egr1和mTOR的亞細胞定位。
A: Egr1蛋白的亞細胞定位。B: mTOR蛋白亞細胞定位。將細胞接種到蓋玻片上，分別用Egr1和mTOR抗體染色，然後用FITC(綠色)標記二抗。用4 '，6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI，藍色)觀察細胞核。

Egr1被很好地描述為海馬體相關學習和記憶的參與者。它在LTP的維持和形成以及成人神經發生中起著至關重要的作用，表現為它在齒狀回新生神經元[38]的選擇、成熟和功能整合中的作用。與我們之前的報道類似，在我們最近的研究中，在卵巢切除術後12周，海馬體中發現了Egr1的過表達。然而，由於也有報道顯示，在猿猴海馬中，Egr1表達下調，導致認知[19]缺陷，因此，需要進一步研究不同物種和細胞中Egr1表達的測定，以闡明這些差異。有趣的是，我們本研究還發現，當卵巢切除12周後小鼠出現認知障礙時，海馬區mTOR、磷酸化mTOR及其下遊靶標p70S6K和磷酸化p70S6K水平升高，與一些已收集的研究結果一致[39,40]。

近十年來，mTOR信號通路在AD模型中被廣泛報道，證明mTOR信號通路異常上調可能與神經退行性過程的發展有關[41,42]。為探討OVX小鼠認知障礙中Egr1與mTOR信號通路的關係，采用mTOR抑製劑雷帕黴素對OVX小鼠進行治療。與對照相比，雷帕黴素治療對Egr1 mRNA和蛋白表達有負調控作用，這與其他一些研究一致[43,44]。

最後，我們在SH-SY5Y細胞中執行並驗證了Egr1基因與mTOR信號通路之間的這種關係。在SH-SY5Y細胞中，Egr1和mTOR的亞細胞定位共存。轉染si-Egr1片段和過表達Egr1質粒後，mTOR和p70S6K mRNA和蛋白表達無明顯變化。與以上在OVX小鼠海馬中的結果一致，雷帕黴素處理負向調節了Egr1 mRNA和蛋白的表達，以及mTOR/p70S6K信號通路。

圖4:轉染過表達Egr1質粒或si-Egr1片段後SH-SY5Y細胞中Egr1、mTOR和p70S6K的表達細胞分別轉染si-Egr1對照(si-Egr1 NC)、si-Egr1片段(si-Egr1)、GV141-Egr1對照(載體)、GV141-Egr1 (GV141- Egr1)。轉染過表達Egr1質粒或si-Egr1片段後SH-SY5Y細胞中Egr1 (A和D)、mTOR(B和E)和p70S6K(C和F)信使RNA水平的變化。G, H:轉染後Egr1、mTOR、p70S6K的相對蛋白水平。* * * P < 0.05, P < 0.01。

圖5:雷帕黴素處理SH-SY5Y細胞後Egr1、mTOR和p70S6K的表達(4 μ M)。雷帕黴素作用48小時後SH-SY5Y細胞中mTOR (A)、p70S6K (B)和Egr1 (C)信使RNA水平的變化。D:雷帕黴素治療48小時後Egr1、mTOR和p70S6K的相對蛋白水平。* * * P < 0.05, P < 0.01。

綜上所述，我們的研究結果表明，Egr1和mTOR/p70S6K的過表達導致了OVX小鼠的認知能力下降，而Egr1可以通過mTOR/p70S6K信號通路進行調控在活的有機體內而且在體外研究。Egr1可能是認知衰退發病機製中mTOR/p70S6K信號通路的下遊調控因子。這一結論與最新研究相似，表明Egr1的表達可以被mTOR[45]的經典下遊調控因子4EBP1調控。但要全麵了解OVX模型中mTOR/p70S6K/ Egr1和認知障礙的分子機製，我們還需要進一步的研究。

到目前為止，對於絕經後婦女的認知障礙/AD，還沒有有效的治療方法或常規藥物。認知缺陷的信號網絡是複雜的，有許多下遊生理輸出，因此其與年齡相關的作用機製尚未完全闡明。據我們所知，本研究首次證實mTOR/p70S6K/ Egr1信號通路參與認知功能障礙的發生和進展，可能在該疾病的發病機製中發揮重要作用，是絕經後衰退臨床實踐的潛在靶點。

結論

總之，我們的數據表明，在體內外研究中，Egr1和mTOR/p70S6K的過表達導致了OVX小鼠的認知能力下降，而Egr1可以通過mTOR/p70S6K信號通路進行調控。我們目前的研究結果表明，mTOR/p70S6K/ Egr1信號參與了認知功能障礙的發病機製。我們的發現可以為臨床實踐中絕經後衰退的發展和進展提供新的機製。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有利益衝突。

作者的貢獻

SZ:實驗表現，數據收集，稿件撰寫，JC:實驗表現，數據分析，WZ:數據分析，JW:項目開發，稿件編輯。

認定和資金

感謝南京醫科大學生理學係陳玲教授對電生理檢測的技術支持。本研究得到國家自然科學基金(81170540)、江蘇省科委自然科學基金(81170540)資助。BK2011846)，江蘇省神經退行性變重點實驗室(編號SJ11KF06)資助吳傑。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:張鬆，叢娟，周偉，We J (2016) Mtor/P70s6k通路對Egr1的調控與去卵巢小鼠認知能力下降相關。J Mol Med Clin app 1(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2575-0305.101

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出版的曆史:

收到日期:2015年12月12日

接受日期:2016年1月02

發表日期:2016年1月07