摘要

我們設計了新創合成了兩個係列的26個殘基的兩親性α-螺旋型陽離子抗菌肽(AMPs)，極性麵上有5個或6個帶正電荷的殘基(D-Lys, L-Dab(2,4-二氨基丁酸)或L-Dap(2,3-二氨基丙酸)，其他殘基均為d -構象。在最嚴格的溶血條件下測定了對人紅細胞的溶血活性，在37°C下18h, 1%的人紅細胞，肽濃度高達1000 μg/mL (~380 μM)。抗菌活性測定對7鮑曼不動杆菌對多粘菌素B和粘菌素(最後的抗生素)具有耐藥性的菌株，顯示極性麵上兩個不同位置(位置3,7,11,18,22和26)的正電荷殘留的影響與位置3,7,14,15,22和26)。所有10個多肽在非極性表麵的中心位置都有兩個D-Lys殘基作為“特異性決定因素”，位於13和16位，為原核細胞提供了對真核細胞的特異性。特異性決定因子在人類血清中也保持良好的抗菌活性。本研究表明極性麵正電荷殘留(Dab和Dap)的位置和類型是獲得最佳治療指標的關鍵。

關鍵字

革蘭氏陰性病菌;鮑曼不動杆菌；兩親α-螺旋多肽;抗菌肽(AMPs)，特異性決定因子;溶血性活動;極性麵帶正電殘基(d -賴氨酸、L-Dab和L-Dap)

縮寫

AMPs:抗菌肽;Dab:二氨基丁酸;Dap:二氨基丙酸;HC₅₀:肽濃度，導致50%的人紅細胞裂解(溶血活性);麥克風_通用汽車:最小抑菌濃度受試菌株數的幾何平均值;ti:治療指數;TFE: 2, 2, 2-Trifluoroethanol

簡介

臨床上對傳統抗生素具有顯著耐藥性的致病菌的日益出現是一個重大的公共衛生問題[1-5]。正如Falanga等人所指出的，我們正麵臨著傳染病在全球範圍內的重新出現和多藥耐藥(MDR)細菌的迅速增加，威脅著世界回到前抗生素時代。事實上，現在有“超級細菌”對大多數或所有可用的抗生素都有耐藥性[7]。2016年關於抗微生物藥物耐藥性的綜述[4]詳細報告了全球應對耐藥感染的挑戰範圍。因此，據估計，如果不迅速找到積極的解決辦法來減緩耐藥性的速度，到2050年，每年將有1000萬人因耐藥感染的增加而麵臨生命危險。目前，每年有70萬人死於常見細菌感染、艾滋病毒、結核病和瘧疾的耐藥菌株[4]。盡管2016年的審查[4]提出了大量減緩或預防細菌未來對抗生素耐藥性的方法(例如，促進疫苗使用、避免不必要的抗生素使用、改善水和衛生條件、減少環境汙染)，但事實仍然是，對傳統抗生素具有耐藥性的有機體仍然存在，必須予以處理。事實上，經常有人斷言，作為全球應對耐多藥細菌的一部分，我們必須增加有效抗菌藥物的數量，以戰勝對現有抗生素產生耐藥性的感染[4]。不幸的是，抗生素的發現在我們最需要它的時候停滯了。在1929年到20世紀70年代之間，超過20種新種類的抗生素(不僅僅是現有種類的類似物)進入市場。 Since then, only two new classes have reached the market, with the worldwide antibiotic pipeline for new antibiotic classes active against highly resistant Gram-negative bacteria being almost non-existent [3]. It is estimated that only 4 new classes of antibiotics can be expected in the next 30 years, while antibiotic resistance to some pathogens may more than double in the same period [4]. Although, in the 1970s and 1980s, the pharmaceutical industry did produce a stream of antibiotics, these were not new classes but analogs of existing classes [3]. The fundamental problem with this approach is that, although analog development is low risk compared to novel class discovery and development, analogs eventually became more difficult to come by and the process hits a dead end.

耐藥菌株危機的潛在解決方案在於自然界對細菌感染的普遍反應，即產生抗菌肽(AMPs)[6,8-24]。amp是由多種生物產生的，包括細菌、真菌、植物、昆蟲、兩棲動物、甲殼類動物、魚類和哺乳動物(包括人類)[25]。抗菌肽(特別是陽離子抗菌肽)是一種速效殺菌劑，具有廣譜活性[25]。此外，AMPs一般沒有特異性靶點(不像傳統抗生素)，它們的作用模式通常涉及與細菌細胞質膜的非特異性相互作用。這導致肽在膜內積累，導致通透性增加和屏障功能喪失[8,9,12,13,15-30]。由於這需要微生物細胞膜的脂質組成發生重大變化，因此預計不會產生耐藥性。目前臨床開發的amp大多針對革蘭氏陽性菌引起的皮膚感染，即僅外用[31]。此外，在過去30年裏，隻有4種天然抗AMP進入市場，美國聯邦藥物管理局(Federal Drug Administration)沒有批準係統性抗AMP[31]。盡管過去30年的嚐試和許多AMPs的良好抗菌活性，但臨床上批準的AMPs的缺乏主要是因為它們對正常細胞通常具有很高的毒性，這阻礙了它們作為全身藥物的使用。有趣的是，陽離子AMPs多粘菌素B和多粘菌素E(粘菌素)在20世紀60年代和70年代得到了廣泛應用。 However, their clinical use in the 1970s was scaled back considerably due to serious neurotoxicity and nephrotoxicity issues [32-36]. Despite these toxicity drawbacks, these two peptides returned as antibiotics of last resort with the emergence of prevalent Gram-negative bacteria with multidrug resistance. However, the aforementioned emergence of polymyxin-resistant “Superbugs” [32,33,36], due to the fact that these particular peptide antibiotics (unlike the AMPs presently under consideration) have specific targets and are thus prone to resistance, means that it is now critical to develop antimicrobials effective against both polymyxin B- and colistin-resistant microorganisms. Worldwide research for the past 30 years to remove toxicity from AMPs, thus enabling a shift of focus from development of peptide drugs for topical use towards agents for systemic administration, has been unsuccessful until recent work in our laboratory.

對天然和合成AMPs的大量結構/活性研究確定了抗菌活性的重要因素:疏水性和堿性(帶正電荷)殘基的存在，兩親性，預製或誘導二級結構(α-螺旋或β-片)[16]。我們一直假設a新創設計合成肽的方法來檢查這些參數的增量變化的影響，將使新肽amp的合理設計快速進展。因此，根據對抗菌活性重要因素的經驗教訓，如上文所述，我們使用了一個26殘基兩親和α-螺旋AMP的結構框架或模板，它具有優異的抗菌活性，但最初具有很強的溶血活性[16]。模板的26個殘基長度被設計為能夠接受氨基酸取代，對肽的性質和穩定性影響最小，除了被研究的肽;與此同時，類似物的合成和純化仍然很簡單。通過這種模板方法，我們確定了改變非極性表麵[37]的疏水性或極性表麵[38]上的正電荷殘基數量對生物活性的影響。此外，利用氨基酸的d -對映體導致了抗蛋白質水解消化的良好穩定性(這是AMPs作為注射用AMPs的一個關鍵特性)，同時保持了良好的抗菌活性[39]。

在這一點上，一個重要的裏程碑是我們發現了“特異性決定因素”，允許真核細胞和革蘭氏陰性微生物之間的選擇性，即產生了通過人類紅細胞溶血測定的毒性的顯著降低[39-41]。這些“特異性決定因素”是一個，之後是兩個，在兩親模型肽的非極性麵中間的lyss取代，這個肽段足夠長，允許這種取代，同時在非極性麵保持足夠的疏水性。簡單地說，我們利用帶正電荷的殘基作為26殘基肽的特異性決定因素(Lys殘基位於非極性麵的13和16位)。此外，我們還將疏水性、疏水性類型和疏水性位置作為設計參數。綜合來看，這些方法在治療指標(溶血活性/抗菌活性)方麵取得了前所未有的改善[40,41]。這一發現加快了我們模板設計的另一個方麵，即要求我們的多肽平行於膜表麵，即促進相互作用的“地毯模型”[24,42,43]，同時通過“桶壁”機製[24,44]防止真核細胞通過跨膜螺旋穿透膜，從而防止溶血。此外，我們證明，在這些兩親性α-螺旋肽的非極性麵，用Lys特異性決定因子修飾天然AMPs(22殘基Piscidin 1和28殘基Dermaseptin S4)可產生類似的抗菌活性提高和溶血活性顯著降低的結果[45,46]。這些結果對於AMPs作為治療藥物的未來具有至關重要的意義。

由於我們現在的重點是開發更好的革蘭氏陰性AMP，而不是以“一勞千金”的方式保持廣譜活性，因此加快了此類AMP的開發，我們最近將注意力轉向肽模板[47]的極性麵。也就是說，我們用精氨酸殘基和不同尋常的氨基酸:鳥氨酸(Orn)[22,48-53]、二氨基丁酸(Dab)[22,48-53]或二氨基丙酸(Dap)[22,48-54]取代賴氨酸殘基。令人興奮的是，具有特異性決定因子和極性表麵具有L-Dab和L-Dap的AMPs在高肽濃度(1000 μg/mL)下基本沒有溶血活性，這首次證明了這些不尋常的氨基酸殘基在解決AMPs長期溶血問題方麵的重要性，同時保持對7種抗生素的良好抗菌活性鮑曼不動杆菌對多粘菌素B和粘菌素有耐藥性的20株答:baumannii2016年和2017年對18種不同抗生素產生耐藥性的分離株。

本研究旨在延續我們模板驅動的成功新創設計方法，嚐試微調我們最近的成果，利用不尋常的氨基酸(Dab和Dap)在我們的AMP極性麵消除溶血[47]。因此，我們已經確定了AMP極性表麵正電荷殘基位置的變化的影響，並消除了c端單一的正電荷殘基，這允許未來在需要延長半衰期時在c端半胱氨酸殘基上開發聚乙二醇化AMP。

材料與方法

固相多肽合成及反相純化

合成和純化方法已在以前的出版物[47]中詳細描述。

螺旋結構的表征

使用Jasco J-815分光光度計(Jasco, Inc.， Easton, MD, USA)在兩組條件下使用圓二色(CD)光譜法測定多肽的平均殘留摩爾橢圓度:pH 7.0時，緩衝液為50 mM NaH₂阿寶₄/ NaHPO₄在α-螺旋誘導溶劑2,2,2 -三氟乙醇，TFE， (50 mM NaH₂阿寶₄/ NaHPO₄/100 mM KCl, pH 7.0緩衝液/50% TFE)。將稀釋10倍的約500μM多肽原液裝入0.1 cm的石英細胞中，在195 ~ 250 nm範圍內掃描其橢圓度。用氨基酸定量分析法測定肽濃度。

肽定量的氨基酸分析

氨基酸分析采用Cohen and Michaud[55]法。每個多肽樣品被混合到玻璃管中，凍幹，然後在6 M HCl和0.1%苯酚中在110℃下酸水解48小時。使得到的溶液達到室溫，然後真空幹燥以去除HCl。在10 mM HCl中重懸，取20 μL加入0.2M硼酸鈉緩衝液60 μL, pH 8.8。在此混合物中加入20 μL的6-氨基喹諾基- n -羥基琥珀酰咪基氨基甲酸乙腈衍生樣品中的氨基酸。然後將樣品加熱到55°C 15分鍾，將Tyr的副產品轉化為一種形式。使用Agilent 1260係列儀器，Waters AccQTag柱，3.9 mm I.D. × 150 mm柱，在254 nm紫外吸收下分離和定量每個樣品中存在的衍生氨基酸。

本研究使用革蘭氏陰性菌株

的答:baumannii本研究使用的菌株包括從默克公司獲得的對多粘菌素B和粘菌素(最後的抗生素)耐藥的7株菌株(M89941、M89949、M89951、M89952、M89953、M89955和M89963)。麥克風_通用汽車本例中為本研究使用的七種鮑曼不動杆菌菌株的幾何平均MIC。

抑菌活性(MIC)測定

最小抑菌濃度(MIC)被定義為抑製細菌生長的最低肽濃度。在Mueller Hinton (MH)培養基中采用標準微量滴度稀釋法測定mic。簡單地說，細胞在37°C的MH肉湯中生長一夜，並在相同的培養基中稀釋。將連續稀釋的多肽按50 μL的體積加入微量滴定板，再加入50 μL的細菌，最終接種量為5×10⁵菌落形成單位(CFU)/毫升。37℃孵育24h，測定mic值。麥克風_通用汽車為MIC值個數的幾何平均值。

溶血活性(HC₅₀)確定

肽樣品(濃度由氨基酸分析確定)添加到1%的人紅細胞在磷酸鹽緩衝鹽水(100 mM NaCl, 80 mM Na₂HPO₄， 20毫米NaH₂阿寶₄pH 7.4)，反應混合物在37℃的微量滴定板中孵育18h。對肽樣品進行兩次連續稀釋。從溶血試驗中提取等分，離心(800 × g)去除未溶紅細胞，在570 nm分光光度法測定血紅蛋白釋放量。100%溶血的對照為紅細胞水處理樣本。未釋放血紅蛋白的對照組為1%的紅細胞樣本，不添加任何肽。由於紅細胞處於等滲介質中，在實驗過程中，沒有觀察到血紅蛋白的釋放(小於完全溶血時釋放的1%)。溶血活性HC₅₀是使紅細胞在18h後溶血50%的肽濃度。HC₅₀從裂解百分比與肽濃度(μM)的圖中確定，使用12種不同濃度，最高可達1000微克/ ml，在37°C下持續18小時。采用3次重複的平均值，平均方差小於4%。新鮮人體血液來自美國丹佛市維塔蘭特。

治療指數(t.i)測定

治療指數是代表原核生物抗菌肽特異性的一個被廣泛接受的參數與真核細胞。用溶血活性比(HC₅₀)和抗菌活性(MIC_通用汽車)．麥克風_通用汽車在這個例子中是七個的幾何平均MIC鮑曼不動杆菌本研究中使用的菌株。因此，治療指數越大，表明對原核細胞的特異性越強。因此，治療指標為HC₅₀/麥克風_通用汽車比率。

結果與討論

極性麵上的多肽設計，正電荷殘留的位置和類型

在本研究中，我們設計新創合成，純化和表征了十個潛在的兩親性α-螺旋抗菌肽(AMPs)，我們改變了α-螺旋極性麵上的正電荷殘基的位置。位置1由五、六帶正電的殘留在位置3、7、11、18、22日和26日或3、7、11、18 - 22(圖1)。位置2這些殘留在位置3、7、14、15日,22日和26日或3、7、14、15、22(圖1)。c端帶正電的殘渣(位置26)取代了從兩組安培Ser 26(表1)。10安培兩個“特異性因素”(D-Lys殘留在13和16個中心的非極性麵)。我們之前已經證明了這些AMPs中“特異性決定因素”的關鍵重要性，這些決定因素編碼了對革蘭氏陰性病原體的選擇性，並從廣譜AMPs中去除革蘭氏陽性活性和溶血活性[40,41,45-47]。此外，我們已經證明特異性決定因素在防止對人血清蛋白的高親和力方麵還有另一個重要作用[40,41,45,46]。

圖1:螺旋輪(上麵板)和螺旋網(下麵板)代表我們的螺旋放大器。
在螺旋輪中，非極性麵以黃色弧線表示(Leu殘基為黃色，Lys 1位置為粉色，13和16位置的特異性決定因子為粉色)。極性麵用黑色圓弧表示(帶正電荷的殘基用X表示，並以藍色表示)。

表1:amp中正電荷殘基的極性麵取代。
^一個D表示除L- dab和L- dap殘基為L構象外，每個肽的所有氨基酸殘基均為D構象。特異性決定因子是位於非極性表麵中心的帶正電荷殘基(Lys13/Lys16)(圖2)。
^b肽序列使用一個字母的代碼顯示所有氨基酸殘基，除了在X位置，其中使用三個字母的代碼。Ac表示Nα -乙酰，amide表示Cα -酰胺。X位是兩親性α-螺旋極性麵上的正電荷殘基(Lys, L-Dab和L-Dap)(圖1);-1表示極性麵上3、7、11、18、22和26位有6個正電荷殘基，或極性麵上3、7、11、18和22位有5個正電荷殘基(26位被Ser取代);-2表示極性麵上3,7,14,15,22和26位有6個正電荷殘基，或極性麵上3,7,14,15,22位有5個正電荷殘基(26位被Ser取代)。

圖1顯示了螺旋輪和螺旋網表示的一般氨基酸序列，其中X表示正電荷殘基在極性麵上的位置(藍色)。我們已經展示了螺旋網的兩個版本，其中沿螺旋網的中心顯示極性殘基。麵板A顯示位置3,7,11,18,22和26的極性麵殘基，麵板B顯示位置3,7,14,15,22和26的極性麵殘基。兩者的主要區別在於A區第11和18位和b區第14和15位。當正電荷殘基位於3、7、11、18、22和26位時，我們在肽名的末尾將這個方向標記為-1(表1)。當正電荷殘基位於3、7、14、15、22和26位時，我們在肽名的末尾把這個方向標記為-2(表1)。-2方向在序列的13、14、15和16位創建了一個帶正電荷的簇。位置13和16是D-Lys殘基作為非極性麵特異性決定因素，位置14和15是極性麵殘基(D-Lys, L-Dab或L-Dap)。這項研究中最有趣的一點是將l構象中的Dab和Dap殘基替換為d -抗菌肽。極性表麵的5或6個帶正電的殘基被替換為d -賴氨酸，L-Dab或L-Dap(表1)預計不會對構象產生任何不良影響，因為我們的目標是在水條件下有盡可能少的α-螺旋結構，但在膜的疏水性存在下有最大的誘導α-螺旋結構(這裏模擬的是在50%三氟乙醇存在下用圓二色光譜(CD)測定螺旋結構)。我們並不認為Dab或Dap殘基的5或6個l取代會對整體結構產生顯著影響，因為在膜的疏水性存在的情況下，26個位置中有20或21個位置維持結構。 The use of the L-conformation for Dab and Dap residues was based on the fact that they are significantly less expensive for peptide synthesis and would not introduce any susceptibility to proteases since the Dab and Dap residues are unusual amino acids and are not recognized by proteases. The hydrophobic/non-polar faces of all ten AMPs have eight Leu residues in two clusters of four (colored yellow) separated by two Lys residues (specificity determinants in the center of the non-polar face (colored red)) (Figure 2). Position 1 in all peptides is D-Lys which we consider is on the non-polar face; thus, the non-polar face contains three D-Lys residues at positions 1, 13 and 16 to give a net charge of +3 on the nonpolar face and +5 or +6 on the polar face resulting in an overall net charge on these AMPs of either +9 or +8 depending on whether there are 6 or 5 positively charged residues on the polar face (Table 1).

圖2:螺旋輪(上麵板)和螺旋網(下麵板)代表我們的螺旋放大器。
在螺旋網中，極性麵上的帶正電的殘基被框成藍色，其他極性麵上的殘基用一個打開的黑盒子表示。紅色開框表示非極性麵上的賴氨酸殘基(賴氨酸1和特異性決定因素賴氨酸13和賴氨酸16)。X表示的位置是極麵上3、7、11、18、22和26位(麵板A)或3、7、14、15、22和26位(麵板B)的正電荷殘基的位置。正電荷殘基之間的潛在i到i +3或i到i +4靜電排斥用黑色虛線表示。

在螺旋輪中，非極性麵以黃色弧線表示(Leu殘基為黃色，Lys 1位置為粉色，13和16位置的特異性決定因子為粉色)。極性麵用黑色弧表示(帶正電荷的殘基用藍色表示)。在螺旋網中，非極性表麵的殘基被染成紅色的賴氨酸殘基(賴氨酸1和特異性決定因子賴氨酸13和賴氨酸16)和兩個簇(n端簇為L2、L5、L6、L9, c端簇為L17、L20、L21和L24)包圍。黑色開口框表示極性表麵3,7,11,18,22和26位置的正電荷殘基(麵板A)和3,7,14,15,22和26位置(麵板B)。大型疏水分子之間的潛在i到i +3或i到i + 4疏水相互作用用黑色實線表示。

抗菌活性

表2顯示了對7種不同菌株的抗菌活性鮑曼不動杆菌對多粘菌素B和粘菌素(最後的抗生素)具有耐藥性的菌株。測定了10個amp的幾何平均MIC值，其中極性麵上的正電荷殘留在D-Lys、L-Dab和L-Dap的兩個不同位置指定為-1或-2(表2)_通用汽車極麵3、7、11、18、22和26位的賴氨酸殘基值為0.5 μM, 3、7、14、15、22和26位的賴氨酸殘基值為0.4 μM。這表明抗菌活性不受極性表麵正電荷殘基位置變化的顯著影響。同樣，將D-Lys殘基替換為L-Dab殘基對MIC影響很小_通用汽車(0.9 μM位置為-1,0.7 μM位置為-2)。用L-Dap替換D-Lys殘基更為顯著(D-Lys殘基在-1位置為0.5 μM, L-Dap殘基在-1位置為1.2 μM)。在-2位點，D-Lys殘基有一個MIC_通用汽車0.4 μM，而相同位置的L-Dap殘留量為0.8 μM。顯然，縮短從Lys到Dab再到Dap的側鏈對抗菌活性有微小但顯著的影響。麥克風_通用汽車在-1位置時，D-Lys、L-Dab和L-Dap的MIC值分別為0.5 μM、0.9 μM和1.2 μM(比較D84、D86和D105，表2)_通用汽車D-Lys、L-Dab和L-Dap的含量分別從0.4 μM到0.7 μM到0.8 μM變化(對比D88、D89和D106，表2)。當使用Dap殘基時，兩個位置差異最大(對比D105(Lys¹-6 Dap-1) MIC_通用汽車D106(Lys¹-6 dap2) MIC_通用汽車0.8 μM)。將Dap殘留在極麵的14和15位，而不是11和18位，似乎有一個主要的優勢。14位和15位位於非極性麵上13位和16位的兩個特異性決定因子(D-Lys殘基)之間。這是在序列(D-Lys¹3, L-Dap14, L-Dap15和D-Lys 16)(表2)。從宏觀上看，與極性麵殘基由D-Lys改為L-Dab和L-Dap(側鏈中4個碳原子，2個碳原子和1個碳原子)對溶血活性的影響相比，幾何平均MIC值的變化較小。(表2)。我們發現，我們可以消除位置26處的正電荷殘留，而對幾何平均MIC值沒有顯著影響(比較D86-(Lys¹-6 da -1)， MIC_通用汽車0.9 μM ~ D102(Lys¹-5 da -1)， MIC_通用汽車0.7 μM和D89(Lys¹-6 Dab2)， MIC_通用汽車0.7 μM ~ D104(Lys¹-5 da -2)， MIC_通用汽車0.8 μM)(表2)。

肽的名字一個	肽質量	麥克風(µm)b							麥克風通用汽車(µM)b	HC50(µM)c	T.I.d
		MB9941	MB9949	MB9951	MB9952	MB9953	MB9955	MB9963
D84(賴氨酸16 Lys-1)	2865.6	0.3	0.7	0.3	0.7	0.7	0.3	0.7	0．5	54.3	108.6
D86(賴氨酸16 Dab-1)	2697.3	1．5	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.9	> 742	> 824
D105(賴氨酸16 Dap-1)	2613.1	0.8	0.8	3.	0.8	3.	0．5	1．5	1．2	> 1148	> 957
D101(賴氨酸1爵士265 Lys-1)	2824.5	0.7	0.7	0.7	0.7	1．5	0.7	0.7	0.8	103.9	129.9
D102(賴氨酸1爵士265 Dab-1)	2684.3	0.4	0.7	0.7	0.7	1．4	0.7	0.7	0.7	> 708	> 1012
D88(賴氨酸16 Lys-2)	2865.6	0.7	0.7	0.3	0.3	0.3	0.3	0.4	0.4	80.6	201.5
D89(賴氨酸16 Dab-2)	2697.3	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	> 1112	> 1589
D106(賴氨酸16 Dap-2)	2613.1	0.8	0.8	1．5	0.8	0.8	0.4	0.8	0.8	340.2	425.3
D103(賴氨酸1爵士265 Lys-2)	2824.5	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	134.9	192.7
D104(賴氨酸1爵士265 Dab-2)	2684.3	0.7	0.7	0.7	0.7	1．5	0.7	0.7	0.8	> 1490	> 1863
粘菌素	1155.5	> 28	> 28	> 28	> 28	> 28	> 28	> 28	> 28
多粘菌素B	1301.6	> 25	> 25	> 25	> 25	> 25	> 25	> 25	> 25

表2:對7株鮑曼不動杆菌對多粘菌素B和粘菌素耐藥，溶血活性和治療指標。
^一個表1描述了序列和-1或-2的名稱。
^bMIC為37°C muller - hinton (MH)培養基中24h對不同菌株生長的最小抑製濃度(µM)， MIC由三組測定結果決定;麥克風_通用汽車為對最後的抗生素多粘菌素B和粘菌素耐藥的七種鮑曼不動杆菌的MIC值的幾何平均值。粘菌素和多粘菌素B結果由默克公司提供。
^c溶血活性，HC₅₀，是在37°C下18小時後使人紅細胞溶血50%的肽的濃度。
^d根據HC計算治療指數(t.i)₅₀(μM) /麥克風_通用汽車(μM)。

溶血活性及治療指標

十種類似肽的生物活性見表2。溶血活性用HC表示₅₀值，該值是導致人類紅細胞溶血50%的肽的濃度。為了確定我們能夠消除人紅細胞的溶血，我們使用了最嚴格的溶血活性測試(在37°C和高達1000 μg/mL或>350 μM的AMP下18h)。這與其他研究人員通常隻使用0.5-2小時的孵化時間形成鮮明對比。我們已經證明，當暴露時間從不足2小時增加到18h[16,20,39]，觀察到的溶血量大大增加。顯然，溶血應該在人體紅細胞上進行監測，暴露時間不超過18小時，因為少於18小時會導致誤導性的結果。圖3顯示了肽濃度對人紅細胞裂解的影響，從圖中可以看出，極性麵上使用兩種不同尋常的氨基酸殘基Dab和Dap導致溶血活性顯著下降。含有Lys的多肽(D84(Lys¹-6 Lys-1)和D88(Lys¹-6 Lys-2)有HC₅₀值為54.3和80.6 μM，顯示在高肽濃度下100%溶血(圖3和表2)。另一方麵，含有Dab和Dap殘基的兩種肽在1000 μg/mL時基本不溶解人紅細胞(圖3)(D105(Lys¹-6 Dap1)和D89(Lys¹6 Dab-2))。極性表麵正電荷殘基的位置對溶血有重要影響，最佳位置取決於是使用Dab還是Dap殘基。與D106(Lys)相比，使用-2位點的Dap殘基(Dap在14和15位置)會導致比-1位點(Dap在11和18位置)更多的人紅細胞裂解¹-6 Dap2)到D105(Lys¹-6 Dap-1(圖3)。見圖1，觀察極麵上-1和-2位置的位置差異。當使用Dab殘留物時，觀察到完全相反的效果。Dab殘留在-2位置(Dab在位置14和15)導致在1000 μg/mL (D89(Lys¹-6 da -2)，圖3)。這些結果表明側鏈長度、碳原子數量和位置可以影響溶血。HC₅₀在1000 μg/mL未觀察到50%溶血時，通過對圖3中觀察到的圖進行外推估計。治療指標由HC計算₅₀(μM) /麥克風_通用汽車(μM)。我們還證明，我們可以去除c端帶正電的殘基，用Ser取代它²⁶而不產生任何後果(表2)。比較去除c端賴氨酸殘留D84(賴氨酸¹-6 Lys-1) (TI=108.6)至D101(Lys . 1¹-5 Lys-1) (TI=129.9)和D88(Lys¹-6 Lys-2) (TI=201.5)到D103(Lys -2¹-5 Lys-2) (TI=192.7)。同樣，在去除c端Dab殘留時，比較D86(Lys¹-6 da -1) (TI > 824)到D102(Lys¹-5 da -1) (TI= >1012)和D89(Lys¹-6 da -2) (TI>1589)和D104(Lys¹-5 da -2) (TI= >1863)

圖3:人體紅細胞溶解百分比與肽濃度的amp。
表1顯示了這6個多肽的序列(所有多肽都在非極性表麵的第13和16位包含賴氨酸特異性決定因子，在非極性表麵上包含賴氨酸特異性決定因子1。命名法，見表1;6 Lys-1表示極性麵上3,7,11,18,22和26位的6個Lys殘基;同樣，6 Lys-2表示極性麵上3,7,14,15,22和26的6個Lys殘基。

肽的疏水性

反相高效液相色譜法(RP-HPLC)是表征肽整體疏水性的優良方法。盡管兩親性α-螺旋肽的非極性麵是其與反相柱的疏水基質相互作用的首選結合域[56,57];整體的疏水性還受極性表麵殘基的組成(5或6個帶正電荷的殘基)的影響(圖1)。這兩個係列肽的RP-HPLC結果如圖4和表3所示。圖A顯示了在-1位置(位置3,7,11,18,22和26或3,7,11,18和22)有帶正電荷殘基的5個多肽的分離。圖B顯示了在-2位置(位置3,7,14,15,22和26或3,7,14,15,22和22)帶正電荷殘基的5個多肽的分離。極性表麵上帶正電荷的殘基類型對整體疏水性有顯著影響，Dab殘基比Dap殘基親水(疏水較少)，盡管Dab殘基在側鏈上比Dap殘基大一個碳原子:Dab肽D86 (6da -1)停留時間為113.9分鍾，Dap肽D105 (6da -1)停留時間為126.6。同樣，在-2位點，D89 (6da -2)肽的保留時間為115.8 min，而D106 (6da -2)肽的保留時間為128.8 min(圖B)。這可以解釋為Dab殘基比Dap殘基更能穩定α-螺旋結構。這意味著Dab肽段的極性麵比Dap肽段的極性麵與疏水基質的相互作用更大，這導致了保留時間(t_R在-1位點為126.6分鍾，t_R為113.9 min，即減少了12.7 min)或t_R在-2位點為128.8 min, t_RDab肽為115.8 min，減少13.0 min)。比較圖4和表3的麵板A和麵板B。表1所示的所有+9肽的序列都是相同的，除了6個極性麵替換是D-Lys, L-Dab或L-Dap殘基。類似地，表1中的+8肽在兩個不同的位置(-1或-2)有5個Lys或5個Dab殘基。在-1或-2位置，Lys肽總是比Dab肽更疏水。這與側鏈含4個碳原子的Lys肽相一致，而側鏈含2個碳原子的Dab肽則不同。

圖4:用反相高效液相色譜法測定AMPs的相對疏水性。
柱:Zorbax 300 XB-C8, 150 × 2.1 mm ID，粒徑5 μm，孔徑300- Å;在0.3 mL/min的流速下，線性AB梯度(0.25%乙腈/min)，其中洗脫液a為20 mM aq. TFA，洗脫液B為20 mM TFA，在乙腈中，溫度為25℃。這10個多肽的序列見表1。圖A表示極性麵3,7,11,18,22和26位的6個正電荷殘基或極性麵3,7,11,18和22位的5個正電荷殘基(-1係列;表1)。圖B表示多肽，在極麵3,7,14,15,22和26處有6個正電荷殘基，或在極麵3,7,14,15,22處有5個正電荷殘基(-2係列;表1)。

肽的名字一個	淨電荷	疏水性b	水溶液pH值7		50% TFE	Δ(θ)222	%螺旋d誘導
		pH 2 tR	(θ)222c	%螺旋d	(θ)222c	TFE-aqueous
特異性決定因素
D84(賴氨酸16 Lys-1)	+ 9	136.9	8230年	24	33653年	25423年	76
D86(賴氨酸16 Dab-1)	+ 9	113.9	1769年	6	27923年	26154年	94
D105(賴氨酸16 Dap-1)	+ 9	126.6	5961年	25	24192年	18231年	75
D101(賴氨酸1爵士265 Lys-1)	+ 8	139.4	2538年	7	38538年	36000年	93
D102(賴氨酸1爵士265 Dab-1)	+ 8	112.2	5962年	25	23385年	17423年	75
D88(賴氨酸16 Lys-2)	+ 9	135.5	9154年	28	33115年	23961年	72
D89(賴氨酸16 Dab-2)	+ 9	115.8	1692年	6	27923年	26231年	94
D106(賴氨酸16 Dap-2)	+ 9	128.8	4462年	19	23231年	18769年	81
D103(賴氨酸1爵士265 Lys-2)	+ 8	137.9	8462年	29	29114年	20692年	71
D104(賴氨酸1爵士265 Dab-2)	+ 8	115.2	1462年	6	23000年	21538年	94

表3:生物物理數據。
a D表示每個肽中的所有氨基酸都是D構象，表1中注明的除外。
b t_R表示在pH值為2、溫度為25℃的RP-HPLC中保留時間，是對肽整體疏水性的測量。
c平均剩餘摩爾橢圓率[θ]₂₂₂(mdeg厘米²/(dmol*res))，波長為222 nm，在25°C的水溶液條件下(100 mM KCl, 50 mM Na₂HPO₄/不₂阿寶₄(pH 7.0)或在含有50%三氟乙醇(TFE)的水溶液緩衝液中進行圓二色光譜分析。
d肽的螺旋含量(百分比)與50% TFE存在時肽的摩爾橢圓值相關。%螺旋誘導是在50% TFE存在時肽的摩爾橢圓度(百分比)的增加。

肽螺旋性

我們的十個多肽的生物物理數據見表3。在pH值為7 (50 mM PO4, 100 mM KCl)和50%三氟乙醇(TFE)存在的水條件下，使用圓二色(CD)光譜法測定α-螺旋的含量，以模擬疏水膜的疏水性和α-螺旋誘導能力，我們的amp的目標。我們的策略是在水條件下減少α-螺旋結構，在膜的疏水性存在下使誘導α-螺旋結構最大化。根據肽的不同，水條件下的%螺旋在6%到29%之間變化，誘導α-螺旋的%在71到94%之間變化(表3)。特異性決定因子(非極性表麵中心位置13和16的賴氨酸殘基)被用來破壞模板的連續疏水表麵，形成兩個疏水亮氨酸殘基簇，簇1由亮氨酸殘基在2,5，第6和第9簇和第2簇由17、20、21和24位的亮氨酸殘基組成(圖2)。盡管所有AMPs都滿足水條件下α-螺旋含量較低的一般要求，在50% TFE存在時α-螺旋含量急劇增加，但與極性表麵使用的正電荷殘基(賴氨酸、Dab或Dap)的類型和螺旋含量沒有直接關係。綜上所述，誘導α螺旋結構在提供我們的amp所需性能方麵起著至關重要的作用。

結論

本研究的目標是確定我們的模板驅動從頭設計的肽方法(使我們能夠實現消除AMP毒性的長期目標)是否可以進一步改進，以進一步提高治療指標，並允許肽模型的聚乙二醇化，在治療使用期間提高AMP的半衰期(如果需要)。因此，我們最初的26個殘基兩親和α-螺旋AMP模板，包含非極性麵13和16位的兩個D-Lys特異性決定因子和極性麵3、7、11、18、22和26位的正電荷殘基(D-Lys, L-Dab或L-Dap)(圖1和2)，經過兩種方式修改:(1)將極性麵上帶正電荷的殘基原先位於11和18位(-1方向)的位置更改為14和15位(-2方向)，後者在13、14、15和16位創建一個帶正電荷的簇(圖1和2);(2)用絲氨酸置換去除26位的帶正電荷殘留。有趣的是，極性表麵正電荷殘基的位置對溶血有重要影響，最佳位置取決於使用Dab還是Dap殘基，即側鏈長度、碳原子數量和殘基位置似乎都影響溶血。值得注意的是，6dab0 -1模擬物(>1012)的治療指數上升到>1589,6dab2模擬物的療效顯著提高。此外，5Dab2的ti為>1012的5dab1類似物的ti(>1863)甚至有更大的增加。

比較6Dab和5Dab肽係列，6Dab-1和5Dab-1的T.I.值分別為>824和>1012;6da -2和5da -2肽的T.I.值分別為>1589和>1863。因此，我們已經證明，我們可以去除c端帶正電的殘基，並將其替換為Ser²⁶沒有任何後果的;事實上，對於Dab的類似物，我們觀察到了T.I.的改善。這樣的結果現在允許我們研究c端Cys殘基的聚乙二醇化的有效性，以取代帶正電荷的殘基，以便在需要時延長肽半衰期。

我們持續的研究清楚地表明，我們的兩源性ampp作為潛在的治療藥物的潛力，可以取代現有的抗生素，以及我們的前沿肽設計新創設計模板表示。

致謝

我們感謝科羅拉多大學醫學院生物物理核心設施的設施經理Shaun Bevers進行了圓二色實驗，並對我們的amp進行了氨基酸定量分析。我們感謝Robert S. Hodges為該項目提供資金支持，以及NIH SBIR撥款給AMP Discovery, LLC, R43 AI 131870 (R.S. Hodges, PI)。丹佛維塔坦公司為我們的溶血性化驗提供了新鮮的人體血液。

利益衝突

作者聲明沒有利益衝突。

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文章類型:研究文章

引用:Mant CT, Jiang Z, Gera L, Davis T, Hodges RS(2019)用於治療耐藥革蘭氏陰性菌鮑曼不動杆菌的新型無毒性α-螺旋抗菌肽設計。醫藥化學雜誌2(2):doi dx.doi.org/10.16966/2578-9589.114

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出版的曆史:

收到日期:2019年5月15日

接受日期:2019年5月24日

發表日期:2019年5月30日