Qurrat Ul-Ain＃Rene Kandler＃迪倫Gillespie阿蘭達蒂嘮叨＊
美國伍斯特克拉克大學卡爾森化學與生物化學學院*通訊作者:美國伍斯特克拉克大學卡爾森化學與生物化學學院，Arundhati Nag電子郵件:anag@clarku.edu
化學表位靶向是一種針對小分子或抗體無法到達的蛋白質特定區域設計具有高親和力和特異性的肽配體的新技術。本文綜述了該技術的關鍵步驟和重要應用。該技術的工作原理與抗體-抗原相互作用相同，包括化學合成蛋白質上的感興趣區域，稱為表位，作為具有生物素檢測標記的多肽和有策略地放置的炔或疊氮呈現氨基酸。構建的表位與相應疊氮或炔呈現肽的綜合線性或循環One Bead One Compound庫進行篩選，約有200萬個獨特成員。正確取向的結合劑經過近距離催化疊氮-炔環加成反應，並使用無銅檢測原位點擊化學。對全蛋白的後續結合試驗確定了解離常數在納摩爾範圍內的高親和力肽結合劑。這些單寡肽可以進一步發展為雙寡肽和三寡肽，它們是由連接子連接的兩個或三個肽配體的更大的大分子，對連續或不連續的表位具有更好的結合親和力。這項技術的應用已經產生了蛋白酶抗性和細胞滲透性化合物，具有潛在的治療和診斷目的。在這篇綜述中，我們重點介紹了不同的化學表位靶向配體的應用範圍，從生物標誌物和受體異構體的差異檢測到酶功能的抑製和蛋白質折疊狀態的穩定。
化學表位;肉毒神經毒素;生物標記物
化學表位靶向允許分離線性和大環肽配體針對蛋白質的特定區域，在此稱為表位。表位一詞借用自抗體-抗原相互作用詞彙[1]。當受到外來粒子或抗原的攻擊時，機體會產生一種叫做抗體的糖蛋白，作為對抗原[2]的免疫原性反應。抗原可以是蛋白質，如在癌細胞[3]上表達的受體，也可以是小分子和多肽，如激素[4,5]。與抗原特異性受體或抗體相互作用的抗原的氨基酸序列稱為表位[6]。表位可分為構象表位和線性表位。構象表位由抗原的氨基酸的不連續部分組成，並根據其三級結構[7]與抗體相互作用。另一方麵，線性表位是由來自抗原的連續氨基酸序列形成的，並與基於其初級結構[8]的抗體相互作用。雖然單克隆抗體是一個大的，150kda的蛋白質，但隻有抗體的特定部分包含獨特的高變量環，稱為互補決定區(CDR)與抗原結合。抗原與抗體的結合、特異性和親和力可以由非共價相互作用決定，如靜電相互作用、氫鍵、範德華力和氨基酸側鏈[9]之間的疏水相互作用。 The crystal structure of antibody with antigen shows 5-10 non-covalent interactions of the CDR of the antibody with the epitope [9]. In the Chemical Epitope Targeting strategy, we sought to find similar noncovalent interactions with the epitope, using a peptide macrocycle as an alternative for the antibody variable region. Akin to antibodies, Chemical Epitope Targeted macrocycles can reach areas inaccessible to small molecule binders of proteins, and detect subtle changes in protein structure such as phosphorylation at a single residue of a kinase [1] or a single point mutation [10].
在化學表位靶向策略發展之前，已有一些針對特定區域和蛋白質翻譯後修飾的研究。Kodakek等人[11]開發了一種遺傳選擇協議，用於篩選可作為其他肽的特異性受體的肽。他們分離出一種針對白介素-1β (IL-1β)激素位點的結合劑，在該位點，原激素被白介素轉換酶(ICE) 17切割。這是通過lambda重構實驗完成的。生成兩個質粒，一個表達dna結合域(DBD)，融合到目標白介素-1β激素肽，另一個表達可變肽庫，融合到第二個DBD。質粒被共同轉化成大腸杆菌（大腸杆菌)細胞和lambda噬菌體挑戰。正確的庫編碼肽與目標肽的相互作用使兩個dbd聚集在一起重建lambda阻遏子並使lambda阻遏子與操作符結合，從而產生相應的大腸杆菌對感染免疫的細胞從噬菌體lambda存在時形成的菌落中鑒定出IL-1β激素位點的肽結合物。Lin等人[12]使用不同的方法生成了一種DNA適體，該適體可以選擇賴氨酸16乙酰化的組蛋白h4蛋白，參與基因表達的調節，對靶識別效率為60%。這種適體被創造出來作為識別配體，用於合成核小體陣列的單分子原子力顯微鏡成像。這些先前的方法都沒有化學表位靶向技術使用廣泛。
化學表位靶向的一般方法包括篩選生物素標記的靶蛋白小片段，以分離出全長蛋白的肽配體。開發的多肽針對蛋白質的目標區域，與大抗體相比具有小的分子足跡。這些多肽可以選擇性地檢測磷酸化的表位和單氨基酸點突變，確定瘧疾蛋白生物標誌物的物種特異性序列，並檢測地理上可變的瘧疾生物標誌物蛋白[13]的一個普遍保守的小區域。在這篇綜述中，我們概述了化學表位靶向篩選的一般方法及其在調節蛋白質功能、差異檢測和蛋白質穩定三個方麵的應用。
對於使用化學表位靶向策略的篩選，通常使用循環一珠一化合物(OBOC)肽庫[14-16]。最常用的庫是TentaGel SNH上的七肽庫2珠(0.3 mmol/g胺負荷)，通過銅(I)催化疊氮-炔環加成(CuAAC)反應，端氨基酸側鏈(疊氮和炔)環化在珠上[13,17,18]。庫通常由一個五殘差變量區組成。在可變區域的氨基酸可以是除半胱氨酸和蛋氨酸以外的任何天然氨基酸。半胱氨酸和蛋氨酸可能在TFA裂解過程中被氧化，因此不在文庫中。因此，在這個七肽庫中有188萬個獨特的序列。為了確保庫中的所有序列都被表示出來，庫的數量超過了10倍。與噬菌體展示相比，該文庫的多樣性較低，但可能含有d -氨基酸等非自然氨基酸[13,19-21]。非自然氨基酸的加入增加了合成的靈活性和增加了蛋白酶的穩定性。此外，環肽上的遊離胺端允許用Edman降解法對文庫進行測序，而無需進一步修改[13]。該文庫還合成了一種含蛋氨酸的變體，可被溴化氰解理[22]解理，並與MaldiTOF/TOF[21]單珠測序兼容。
另一個已使用的珠上大環肽庫是一個八肽庫，包含末端烯丙基側鏈，允許珠上環通過Ru4-催化的閉環複分解反應(RCM)[23,24]。然而，在RCM反應過程中，過量的催化劑被吸附在TentaGel小球中，即使使用像二乙基二硫代氨基甲酸鈉這樣的螯合試劑反複洗滌，小球的棕色也很難去除。這使得在篩選過程中比色檢測和手動分離粘合劑變得困難。
文庫環化後，一端疊氮化物或炔偶聯到珠上環肽進行篩選(圖1A)。目標蛋白的表位，通常是一個9-30個氨基酸的長肽，用相應的炔或疊氮化合物合成(圖1B)。含有氨基酸的炔或疊氮要麼被添加到表位的C端或n端，要麼取代結構相似或疏水性的天然氨基酸。表位還附加了一個生物素標簽，由聚乙二醇(PEG)連接劑與肽分離。
圖1:1:大環肽庫一個用於單寡配篩選和線性肽庫B用於膽道屏，用Xn代表可變氨基酸[13]。1 b:蛋白質的靶區，化學合成為末端疊氮化物和生物素標記[13]的肽。1 c: I. PreScreen:循環庫一個對含有疊氮基的生物素化的打亂版表位進行篩選。在與辣根過氧化物酶(HRP)酶和HRP底物BCIP結合的α-生物素抗體進行後續處理後，可以觀察到結合劑的比色變化。文庫的其餘部分用變性劑鹽酸胍(GuHCl)處理，並在緩衝液中重新平衡。2MonoligandScreen:針對生物素化的靶表位進行篩選，並用生物素抗體- hrp偶聯物進行檢測。用Edman測序法對擊打肽進行測序，重新合成並測試其與全蛋白的結合。最好的肽結合劑1是用末端疊氮化物和生物素標記修飾的1’，用來篩查膽囊炎。3Biligand-Screen:1'是針對庫進行篩選的B根據前麵討論的預篩選程序識別和丟棄非特定粘結劑。剩下的文庫成員與預先孵育的蛋白進行篩選1”。利用生物素標記在原位點擊反應後識別命中肽。與單oligand篩選相似的步驟被用來識別最佳的bilogand。
在化學表位靶向篩選中有兩個階段。第一階段或預篩選涉及篩選文庫與表位序列的打亂版本，其中氨基酸以隨機順序打亂。通過與辣根過氧化物酶(HRP)和HRP底物5-溴-4-氯-3-吲哚酰磷酸(BCIP)[14]結合的抗生物素抗體處理，可以識別非特異性結合物，這將在珠上產生綠鬆石色沉澱(圖1C:I)。剩下的文庫用蛋白質變性溶液如鹽酸胍和二甲基甲酰胺清洗，並在緩衝液中重新平衡。對於第二階段或單寡基篩選，文庫與表位在室溫下孵育數小時。在變性條件下通過嚴格洗滌去除非共價結合的表位後，用抗生物素抗體- hrp偶聯物處理和隨後的BCIP處理識別命中的珠粒。使用Edman測序對命中的結合肽進行測序後，合成了不含疊氮或炔功能的結合肽(圖1C:II)，並測試其與目標表位和全蛋白的結合。通過選擇性和親和性試驗確定了最佳的粘結劑[14]。
二配體或三配體(圖1C:III)，即含有兩個或兩個以上肽配體的配體，由三唑連接子連接，通過多肽庫的多次篩選開發。由於親和性原理，雙配體和三配體對目標蛋白具有更好的親和性和選擇性。親和性原理指出，將兩個具有中等解離常數的結合物結合，會得到一個具有較低解離常數的雙配體或三配體，這是由於相互作用[25]。從線性肽庫到大環肽庫的轉變產生了具有良好親和力的單一大環結合物，而不需要進一步創建雙體和三體。然而，用於影響酶功能或檢測細微變化的配體，如單個殘基磷酸化，通常仍然需要發展成雙配體[26]。在biligand篩選過程中，使用全長活性蛋白而不是肽表位作為靶標，因此折疊蛋白的三級結構在分離特異性的、高親和力的結合劑中起著作用。圖2顯示了迄今已開發的各種肽配體的不同結構[21,27]。
圖2:不同表位靶向肽配體的結構。一個: Akt2 (pS474殘基附近)[1]c端表位的線性三聯體B:用於檢測瘧疾病毒亞型惡性瘧原蟲[13]的生物標誌物蛋白乳酸脫氫酶的環單寡配體。C由選擇性結合人類Akt2[26]的一個循環肽和一個線性肽組成。D:雙環配體與優化的PEG連接子協同結合白介素受體17F[21]的不連續表位。
利用化學表位靶向法獲得的肽大環配體具有抗體和小分子的一些優點。化學表位靶向環肽不需要明確的疏水結合袋與蛋白質結合。開發的一種多肽可以成功靶向瘧疾生物標記蛋白的小而普遍保守的區域，其序列在世界不同地區是不同的[28]。肽結合物也被分離出來，可以區分高度同源蛋白異構體之間的細微序列差異[1,13]。所有這些不同的配體都可以通過化學修飾來提高其效力、穩定性和親和力。在本節中，我們將討論化學表位靶向的三個主要應用，它們已經在不同的背景下被證明了——首先，在調節蛋白質功能，其次，在蛋白質生物標誌物檢測，第三，在影響蛋白質折疊方麵。
化學表位靶向技術開發的肽配體已被用於調節癌蛋白[1,10,29]和毒素[27]的功能。針對蛋白激酶B (PKB/ Akt)的不同區域或異構體，已經開發了幾種多肽多配體。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路[30]中起核心作用，其過表達或過激活可增加腫瘤對化療和放療[31]的耐藥性。因此，過度磷酸化或E17K突變的Akt作為一種癌蛋白發揮作用。
Nag等人[1]開發的肽三igands通過與Ser474殘基所在的疏水c端結合，既能激活Akt2，也能抑製Akt2[10,29]。Ser 474的磷酸化可使該蛋白變構活化，並使激酶活性提高10倍[32,33]。為了構建表位，首先合成了包含磷酸化Ser474的Akt2 450-481氨基酸(pS474)的肽段。然後合成了一個含有鋅二吡啶胺配合物、疊氮化物和生物素標簽的小分子。雙核鋅配合物與pS474上的磷酸基的配位共價相互作用產生了一個含有疊氮的修飾肽，該肽被用作篩選表位。該表位與含d -氨基酸六肽的炔線性庫進行篩選，得到一個初級配體(KD3µM)。最後兩個三重奏，N-tri而且C-tri對Akt2具有較高的親和力和選擇性。的triligandC-triAkt2對85%同源Akt1的選擇性為10:1。表麵等離子體共振實驗證明了高結合親和力N-triAkt2 (KD20海裏)。有趣的是，這兩種配體對Akt激酶活性有相反的影響C-tri抑製Akt2 (EC504µM)N-tri增加Akt2激酶活性。
Henning等人進一步發展了[29]N-tri而且C-tri[1]轉化為蛋白水解靶向嵌合分子(PROTACs)，促進Akt在癌細胞中的快速降解。N-tri與穿透細胞的TAT序列[34]和一個肽配體結合，該配體結合缺氧誘導因子(HIF-1)蛋白[35]中的E3泛素連接酶Von Hippel Lindau蛋白(VHL)，並誘導Akt2降解。用這種肽結構治療OVCAR3細胞顯示，EC後Akt2水平呈劑量依賴性下降50的128 μ M[29,36]。
Das等人推廣了化學表位靶向技術，消除了對表位像磷酸鹽一樣具有特定功能的需求。這是通過用在肽表位中含有疊氮基團的非自然氨基酸取代某些氨基酸如賴氨酸和精氨酸來實現的。為了使表位呈現炔基，可以用含有非自然氨基酸的炔基取代異亮氨酸和纈氨酸[10,27]。為了開發抗單點突變的結合劑，含有疊氮或炔基的非自然氨基酸的替代定位在離突變殘基3到4個殘基的地方。[13]利用這種通用技術開發了一種抑製E17K突變Akt1的抑製劑，該抑製劑對突變蛋白的選擇性比野生型(WT)蛋白的選擇性為10:1。E17K Akt1是Akt1[37]的一個致癌變體，因為Akt1 Pleckstrin同源(PH)結構域的突變增加了突變Akt1對磷脂磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PI(4,5)P2)的親和力，並促進膜結合，從而激活PI3K-Akt通路。Deyle等人[10]合成了含有E17K突變的Akt1的33個氨基酸的長肽表位，一個生物素標簽，並用丙甘氨酸取代異亮氨酸進行原位點擊屏幕。抗原表位與含疊氮的d肽庫進行篩選，該庫具有188萬個獨特序列。結果顯示E17K Akt1 (KD而WT Akt1 (KD1.2µM)。配體定向標記實驗證實配體與蛋白質的靶區結合。多色熒光顯微鏡實驗顯示，在hek - 293t細胞中，Cy5標記的配體與GFP標記的E17K PH結構域選擇性共定位。而原始配體不能破壞E17K Akt1與PIP的PH結構域之間的強相互作用3.，以Akt1 PH結構域為靶點，通過多次篩選得到的三聯體具有足夠的空間位阻抑製相互作用。
利用肉毒神經毒素(BoNT)的動態特性及其進入機製，Farrow等人開發了一種針對BoNT血清型a的競爭性抑製劑，靶向其閉塞活性位點。BoNT是一種化學去神經鋅依賴性蛋白酶，通過選擇性結合神經受體，通過受體介導的內吞作用進入細胞，通過ph誘導的易位逃離核內體，並在細胞質[38]中分裂其SNAP-25底物，從而中毒細胞。該蛋白含有一個與受體結合的重鏈，該重鏈與催化輕鏈(LC)二硫連接。這種二硫鍵必須是完整的，毒素才能進入細胞，但LC在這個階段被結構堵塞了。在細胞質中，二硫鍵減少，LC可催化裂解SNAP25底物[39-41]，暴露活性位點並使其僅在細胞內可藥物作用[42-44]。Farrow等人利用這一生物機製開發了一種具有IC的模擬底物的雙環肽抑製劑50下午165[27]。配體中的第一個循環，Inh1，是一個類似SNAP-25底物[45]的螺旋底物，一旦配體進入細胞，它可以結合在肉毒杆菌活性位點附近。針對表麵暴露的BoNT LC殘基166-179開發了第二個環配體，該殘基將介導配體進入細胞。一個原位通過點擊屏幕顯示兩個環配體之間連接的連接子的正確長度和性質，使雙環配體與BoNT具有高親和力結合。該雙環配體通過一個自發易位肽序列進行修飾，使BoNT獨立穿透細胞[46]。最終的配體在低納摩爾濃度[27]時對BoNT中毒具有顯著的保護作用。
除了影響蛋白質功能外，化學表位靶向還被用於鑒別檢測，如區分受體異構體[21]或不同瘧疾種[13]的同源蛋白。該技術已被用於識別可以檢測在受感染的人類血液中發現的瘧疾生物標誌物的配體，即乳酸脫氫酶(LDH)和富組氨酸蛋白2 (HRP2)。通過篩選不同瘧疾物種的LDH中不同的表位，惡性瘧原蟲(Pf)而且間日瘧原蟲(Pv)， Das等人[13]開發了肽配體，可以區分PfLDH和光伏LDH。具有13:1選擇性的粘合劑PfLDH /光伏分離到的乳酸脫氫酶與人乳酸脫氫酶沒有交叉反應性結合。
此外，Das等人[13]篩選了一種針對PfHRP2蛋白[13]普遍保守基元的選擇性結合劑。PfHRP2蛋白是一種內在紊亂蛋白，其序列在世界不同地理區域存在差異[28,47]。它由含有大量組氨酸和丙氨酸殘基的重複基序組成。使用c端附近的兩個保守基序作為靶向表位，與環肽庫進行篩選。具有強親和力的粘合劑(KD54.3 nM)和選擇性PfHRP2被鑒定為[13]。
多肽大循環已開發用於細胞因子白細胞介素- 17a (IL-17A)和白細胞介素17f (IL-17F)[21]的鑒別檢測。這兩種促炎細胞因子的序列同源性約為55%[48]，由免疫細胞分泌，與多種免疫和自身免疫疾病相關[49,50]。Lai等人[21]合成了兩個不連續的IL-17F表位和一個連續的IL-17A表位，並篩選結合劑。他們分離出一種對IL-17A比IL-17F具有3:1選擇性的粘合劑。兩個IL-17F表位的結合劑與聚乙二醇(PEG)連接劑連接，形成一個與不連續表位結合的協同雙環膽道體。熒光極化實驗證實了膽汁素(KD252 pM)的親和力(高17倍)和特異性(高2.5倍)均優於單個單寡聚體[21]。
化學表位靶向技術的另一個應用是生成影響超氧化物歧化酶1 (SOD1)蛋白質折疊的環肽。細胞內的應激因子產生自由基，高活性的氧自由基被SOD1轉化為過氧化氫和氧[51]。SOD中已知約有160個點突變，降低其穩定性並促進[52]錯誤折疊，導致肌萎縮性側索硬化症(ALS)等神經係統疾病[52-55]。Bunck等人[51]靶向了參與SOD1結構失穩的SOD靜電環(殘基121-141)[56]，並確定了一個配體(EC508 μ M)與環結合。配體與靜電環的結合導致了整體結構的收緊，並穩定了折疊的WT載脂蛋白。有趣的是，與突變體G85R、G93A或D90A SOD1的apoform孵育配體也導致折疊蛋白結構的穩定，這從動態光散射實驗中流體動力半徑的降低可以看出。因此，肽配體在WT和突變體SOD的折疊過程中充當化學伴侶[51,57]。
化學表位靶向最初是為了靶向與磷酸功能相鄰的肽表位，現在已經發展成為一種普遍適用的技術。它已經成功地檢測到蛋白質的非常特定的區域，這是其他任何多肽、小分子和核酸適體文庫篩選過程很少能達到的目標。肽結合劑已被開發用於許多蛋白質，包括屬於不同家族的蛋白質，如細胞內激酶(Akt1, Akt1 PH域，磷酸化Akt2)[1,10]，必需酶(SOD)[51]，分泌血蛋白(PfLDH,光伏LDH,PfHRP2)[13]、毒素(BoNT)[27]、病毒包膜蛋白(L1R)[13]和細胞表麵受體(IL17A和IL17F)[21]。化學靶向技術已被用於複雜的應用，如增加或減少Akt2激酶活性，從BoNT毒素效應中拯救神經元，穩定突變SOD亞型的蛋白質折疊狀態。
一項具有廣泛意義的重要進展是成功地將該技術串聯應用於PROTAC技術[29]。當它們一起使用時，可以通過分離蛋白質的肽結合劑來選擇性降解突變的蛋白質，並使其成為PROTAC。另一個重要的進展是不連續表位的成功靶向[21,27]，這可能會在該技術的進一步應用中發揮重要作用
獻給係統生物學研究所所長James R. Heath教授
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引用:l- ain Q, Kandler R, Gillespie D, Nag A(2018)化學表位靶向:一種新的篩選技術綜述。醫學化學與藥物雜誌1(2):dx.doi.org/10.16966/2578-9589.110
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