摘要

吉西他濱已被證明在一係列人類癌症中有用，但口服吉西他濱由於其高親水性和低血漿半衰期導致口服生物利用度低。因此，本項目開發了肽CSKSSDYQC (CSK)修飾的n -三甲基殼聚糖(TMC)聚合物納米顆粒口服給藥吉西他濱，靶向腸杯狀細胞，從而提高藥物的攝取和口服生物利用度。以脫乙酰殼聚糖為原料，采用兩步法合成TMC，然後與CSK偶聯。離子凝膠法製備了載吉西他賓的TMC-CSK納米粒。進行了表征和細胞藥物攝取研究。結果表明，納米粒平均粒徑為173.6±6.8 nm, PDI為0.20±0.02,zeta電位為18.5±0.2 mV，包封效率為66.44±0.02%。它們呈非球形，具有最小的聚集。與普通藥物溶液相比，載藥TMC- csk和TMC納米顆粒表現出持續的藥物釋放方式。在細胞藥物吸收方麵，負載吉西他濱的TMC-CSK NPs比普通藥物溶液具有更強的細胞藥物吸收能力，並證明細胞吸收過程是能量依賴的。該研究表明，所開發的TMCCSK納米顆粒是一種很有前途的口服吉西他濱給藥係統。

關鍵字

CSKSSDYQC肽;N-trimethyl殼聚糖;口服生物利用度

簡介

吉西他濱(2′-脫氧-2′，2′二氟胞苷單鹽酸[β異構體]，dFdC)是一種抗腫瘤藥物，可有效治療多種惡性腫瘤，包括胰腺癌、乳腺癌和非小細胞肺癌[1]。口服吉西他濱由於其高親水性和廣泛的胞苷脫氨酶(存在於人類腸道和肝髒[2]中)的首過代謝易導致腸透不良，從而導致血漿半衰期約為8分鍾[3]，並導致口服生物利用度約為10%[4]。這些藥代動力學因素具有通過口服途徑限製身體接觸吉西他濱的總體效果。因此，需要更高劑量的口服吉西他濱來達到治療水平，然而，在先前的試驗中，毒性已經迫使停止使用，吉西他濱仍然僅限於腸外給藥[5]。

口服製劑引起了極大的興趣，因為它們被認為是所有劑型中最可接受的，因為它們是非侵入性的，並且有很高的患者偏好[4,6,7]。處方方法包括代謝抑製劑的共同管理和修改吉西他濱本身的化學結構。口服吉西他濱與3,4,5,6-四氫吡啶(一種胞苷脫氨酶抑製劑)聯合給藥已顯示出一定的成功，口服生物利用度為40%[8]，盡管其他藥代動力學方麵被認為是不利的。另一項化學修飾的研究，在吉西他濱胞苷環的n4位上添加了一個3-(十二羰基)吡嗪-2-羰基，理論上減少了脫氨作用，因此第一次通過代謝[9]。這導致半衰期增加，但隻有最低限度的增加，這限製了這種傳遞配方[10]的整體潛力。

納米顆粒(NPs)在口服藥物時具有優勢，它們是藥物在納米範圍(1- 1000nm)內的藥物載體，藥物吸附在顆粒表麵，或被包裹、包埋或溶解在顆粒基質中[11,12]。由於其體積小，NPs具有增強的穿透細胞膜的能力，從而允許更多的藥物到達體循環[13]。此外，NPs還能保護藥物不被機體降解和代謝。NPs的緩釋特性可減少抗腫瘤藥物的副作用[15,16]。NPs的功能在很大程度上取決於配方[17]中使用的聚合物的選擇。殼聚糖是地球上含量第二多的聚合物，在人體內具有高度的生物相容性和可生物降解性。殼聚糖NPs具有較高的藥物包封性和較強的黏附性。此外，它傾向於通過陽離子分子群與陰離子緊密連接蛋白相互作用，打開細胞間緊密連接，從而增強通透性[19]。然而，在生理pH值下，由於去質子化，這些特性會喪失。當pH值進一步超過[20]時，殼聚糖逐漸變得不溶。 N-trimethyl chitosan (TMC) is a partially quaternised chitosan derivative designed to overcome the limitations of chitosan. Unlike chitosan, TMC is soluble at neutral and basic environment which promotes a greater potential anatomical area for NP uptake within the gastrointestinal tract (GIT) [4]. TMC also has superior absorption compared to chitosan through mucoadhesion (thereby increasing contact with intestinal epithelium) and promotion of both transcellular and paracellular absorption [21]. CSKSSDYQC (CSK) is a naturally occurring peptide that actively targets goblet cells, which comprise the second most common group of intestinal epithelial cells [4]. CSK increases the uptake of NPs through caveolae and clathrin mediated endocytosis to occur. This has been shown using HT29-MTX cell and in vivo studies in rats where insulin loaded TMC-CSK NPs resulted in a 1.7 increase in ileal permeation and a 1.5-fold increase in bioavailability compared to TMC NPs [10]. Until now, very few studies of oral delivery of gemcitabine have been reported.

本研究開發了TMC-CSK NP作為口服吉西他濱的新型給藥係統，並首次進行了研究。負載吉西他濱的TMC- csk NPs顯示出良好的物理和化學性能，與藥物溶液和負載藥物的未修飾TMC NPs相比，腸上皮細胞攝取有顯著改善。

材料與方法

殼聚糖>90%脫乙酰，分子量400kda，購自康溫精細化工有限公司(中國常州)。CSK多肽購自中國杭州多肽有限公司。鹽酸吉西他濱，mw299.66，碘烷溶液(CH_3.I)、碘化鈉(NaI)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N ' -乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、三聚磷酸鈉(TPP)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、三聚磷酸鈉(TPP)、聚山梨酯80 (Tween 80)、3-(4,5 -二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯基溴化四唑(MTT)均購自Sigma Aldrich (St. Louise, MO, USA)。二甲基亞碸(DMSO)購自Labpartner(中國上海)。透析管，MW 12,000，采購自membrane - cel®(Viskase, USA)。所有試劑均為分析級。Millipore Millipack40提供milliq水，通過0.22µm過濾器過濾。

TMC合成和TMC- csk共軛

一步合成TMC:反應過程如下圖所示。簡單地說，2克殼聚糖和4.8克碘化鈉溶解在80毫升正甲基吡咯烷酮溶劑中，磁攪拌45分鍾。反應在黑暗中在60°C的水浴中回流。加入15 mL 15% w/v氫氧化鈉溶液和11.5 mL碘化甲酯，攪拌120分鍾。產品通過真空過濾和透析收集。透析過程中碘離子與氯離子交換。簡單來說，用5% w/v NaCl作為外媒透析2天，然後將外媒換成milliq水，繼續透析2天。

兩步TMC合成:上述程序的執行與產品收集點相同。將反應混合物倒進200毫升乙醇中，以10376克離心10分鍾。用60毫升乙醚在玻璃過濾器上清洗混合物，去除乙醇。將過濾後的產品用4.8 g碘化鈉溶解在80 mL n-甲基吡羅烷酮溶劑中，在黑暗中回流條件下磁攪拌，60°C水浴45分鍾。加入11 mL 15% w/v氫氧化鈉溶液和7 mL碘化甲酯，在60°C下繼續反應60分鍾。加入2 mL的碘化甲酯和0.6 g的氫氧化鈉球團，繼續反應60分鍾。合成完成後，用最終收獲的TMC聚合物的質量除以用於合成的殼聚糖的原始質量來計算凍幹TMC收率。

圖1A顯示了TMC甲基化步驟。備用電子對出現在殼聚糖脫乙酰葡萄糖胺單元的伯胺殘基上，攻擊CH的相對δ+甲基_3.一、同時通過SN2動力學破壞甲基碘鏈。這就形成了帶正電荷的二次銨離子。隨後的脫質子作用減輕了這個電荷並形成水，使反應重複進行。這兩個步驟重複兩次以上，從而形成一個整體上帶正電的三甲基殼聚糖。采用這種新的兩步合成方法，縮短了試劑反應時間，提高了全胺甲基化的可能性，從而形成了收率較高的產物[22]。

圖1:殼聚糖合成TMC的反應機理(A)TMC與CSK偶聯的反應機理(B)。

TMC-CSK接合:合成後，380毫克EDC。HCL and 228 mg of NHS catalyst were dissolved in 0.6% w/v TMC solution in a nitrogen environment. CSK was added to give a final concentration of 3% w/v, and left to stir at 500 rpm in the dark for 3 days to allow conjugation occurred sufficiently. The resulting TMC-CSK product was collected via dialysis in 2 L of milli-Q water for 3 days. The dialysed product was then freeze dried for 2 days. Figure 1B shows the CSK conjugated with TMC via amide bonds formed between the residual primary amino groups on TMC and the carboxyl groups on CSK [23]. The δ-hydroxyl group of CSK attacks the δ+ carbon atom on the carbodiimide group of EDC. The resulting electron rearrangement and subsequent nucleophilic attack by the amino group in TMC results in cleavage of the ester link in the EDC-CSK complex, and results in amide bond formation between CSK and TMC [23,24].

納米顆粒製備

TMC(數量見表1)和50 mg吉西他濱溶解於5 mL毫q水中。加入吐溫80 (0.07 mL)，磁攪拌混合。根據表1配製不同濃度的TPP溶液。分別加入兩mL的TPP溶液，在室溫下攪拌1小時。對所有溶液的粒徑、zeta電位和包封效率進行了表征。

配方	(TMC) (毫克/毫升)	台灣記憶體公司 (毫克)	(TPP) (毫克/毫升)	泛太平洋夥伴關係 (毫克)	TMC:泛太平洋夥伴關係 重量比
一個	5.00	25.0	4.17	8.33	3:1
B	6.00	30.0	5.00	10．0	3:1
C	7.00	35.0	5.83	11.7	3:1
D	8.00	40.0	6.67	13.3	3:1
E	7.00	35.0	2.92	5.83	6:1
F	8.00	40.0	3.33	6.67	6:1
G	4.00	20.0	3.33	6.67	3:1
H	7.00	35.0	17.5	35	1:1

表1:納米粒子合成的配方參數

分別將25 mg的殼聚糖、TMC或TMC- csk聚合物溶解在5 mL的mL - q水中，並加入50 mg的吉西他濱。在殼聚糖溶液中加入99.8% (0.1 ml)的乙酸促進溶解。然後加入吐溫80 (0.07 mL)，以450轉/分的速度磁力攪拌5分鍾。根據配方參數，將8.33 mg TPP溶解於2 mL milliq水中。將此TPP溶液滴入聚合物溶液中，在室溫下以450轉/分的速度攪拌60分鍾。

描述

粒徑、多分散性指數、zeta電位:用Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd.， Malvern, UK)測量了殼聚糖、TMC和TMC- csk NPs的粒徑、多分散性指數(PDI)和zeta電位。

截留效率:采用高效液相色譜法間接測定包封效率(EE)。含50 mg吉西他濱的NPs以42018 g離心10分鍾。過濾上清液，用HPLC法測定藥物濃度(1260 Infinity, Agilent Corporation, Germany)。通過從添加到NPs的藥物量中減去未包埋的藥物來確定NPs的EE，並以百分比表示(見公式1)。

\ [EE \ % = \壓裂{{{rm \{}}藥物總金額{\ rm {}} {\ rm {}} - {\ rm{}}免費{\ rm{}}藥物量{\ rm {}}}} {{{rm \{}}藥物總金額{\ rm{}}}} \乘以100 \,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\ 左({\ rm{}}{方程1}\)\]

表麵形態:通過掃描電子顯微鏡(SEM) (philips XL 305 Field Emmsion Gun，荷蘭)測定納米顆粒表麵形貌。將凍幹的NPs放置在金屬板上，濺射鍍上鉑(Quorum Q150R S旋轉泵濺射塗布機)。對TMC NPs和TMC- csk NPs分別進行了SEM觀察。

在體外藥物釋放:在體外使用Franz擴散儀(FDC-6, Logan Instruments, Somerset, NJ)研究了吉西他濱從納米顆粒配方中的釋放。將1% w/v濃度的吉西他濱溶液和等量的載藥NPs添加到Franz擴散細胞的供體室中，使用纖維素膜(孔徑<100 nm, MW 12000, membrane - cel)^®(美國)夾在供體和受體腔之間。受體腔內充滿磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)，並保持在500 rpm恒定攪拌下，並保持在37±1°C。在預先確定的時間點(15分鍾、30分鍾、1小時、2小時、3小時、4小時、6小時、8小時、12小時和24小時)提取500µL，並用500µL新鮮pH 7.4磷酸鹽緩衝液替代。采用高效液相色譜法對樣品進行過濾和測定。

HT29-MTX-E12細胞培養及生長條件

杯狀細胞是腸上皮細胞中第二常見的細胞類型，它在上皮壁上產生粘液。HT29- MTX-E12細胞可以獲得杯狀細胞[25]的粘液產生特征。因此，為了研究杯狀細胞靶向CSK肽的能力，HT29-MTX-E12細胞被用於細胞藥物攝取研究。HT29-MTX-E12細胞使用Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA)，含有10%胎牛血清，1%青黴素-穀氨酰胺(Life Technology, NY, USA)和1%非必需氨基酸(Life Technology, NY, USA)， 37°C, 98%濕度和5% CO培養₂．將含有HT29-MTX-E12細胞的培養基5 mL以1 × 10的密度接種到60mm培養皿(美國Corning Coster Corp)上⁵細胞/ml，在細胞達到90%合流後進行細胞藥物攝取研究。

HT29-MTX-E12細胞攝取研究

HT29-MTX-E12細胞在37℃Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)中預孵育1小時，使用前用HBSS衝洗5次以去除細胞根尖側的分泌粘液。加入含500µg/mL藥液的HBSS轉運緩衝液2 mL及等效載藥TMC NPs和載藥TMCCSK NPs，分別於4℃和37℃與細胞孵育2小時，考察孵育溫度對藥物攝取的影響。隨後，2小時後將培養基吸出，用冰冷的HBSS衝洗3次。然後將細胞刮除到1 mL 0.02 N鹽酸/甲醇(1:1,v/v)的萃取溶液中。以乙腈/甲醇(3:1,v/v)為裂解緩衝液裂解細胞，60 W超聲作用10 min，最終提取的藥物用高效液相色譜法定量。此外，隨後將細胞蛋白質含量溶解在1ml的1m NaOH中，並使用阿bicinchoninic acid (BCA)測定試劑盒(Thermo Scientific, USA)測定。因此，總藥物攝取量表示為每毫克細胞蛋白攝取的藥物量(µg)。

納米粒子的物理和化學穩定性

研究了最佳載藥NPs的物理和化學穩定性。最佳的NPs儲存在螺旋蓋的琥珀小瓶中，在3種不同的溫度下(4、25和40°C)保存3個月。在0、1、2和3個月時提取樣品，通過觀察其顆粒大小和PDI來評估其物理穩定性。通過測量NPs中保留的藥物量作為先前描述的藥物包封效率來評估化學穩定性

對照組使用與NPs中截留的藥物相當的藥物，在90天的儲存期間，每個月底對藥物溶液進行3種溫度的檢測。

統計分析

使用Microsoft Excel 2010軟件(華盛頓州雷德蒙德)進行統計數據分析。結果顯示為平均±95%置信區間。數據比較采用回歸分析、方差分析和雙尾t檢驗。p值≤0.05為最低顯著性水平。

結果與討論

合成TMC收率

從表2可以看出，一步法合成的TMC收率為43%。相比之下，兩步法產生了89%的TMC收率。關於納米顆粒的形成，配方G的產量有限，因此被排除在外。TMC-CSK偶聯使用200 mg TMC與120 mg CSK相互作用，形成242 mg TMC-CSK，產率76%。

	原材料及重量	最終材料及重量	百分比收益率
一步法合成	200毫克殼聚糖	86毫克TMC	43%
兩步合成法	200毫克殼聚糖	178毫克TMC	89％

表2:一步合成TMC，兩步合成TMC的收率

四元化程度由積分確定¹H核磁共振(¹H NMR, UNITY INOVA-400，瓦裏安公司，CA，美國)。從¹H NMR測定，得到季銨化度為12.7%的TMC;的結果¹H NMR測定證實了CSK肽序列中酪氨酸苯環的兩個質子分別在6.752 ppm和7.023 ppm處有TMC和CSK共軛。另外，根據氨基酸檢測結果，TMC-CSK聚合物中CSK含量為0.09 mmol/g。此外，殼聚糖脫乙酰程度對TMC產率有功能依賴性。殼聚糖脫乙酰化是指殼聚糖中不含乙酰基的遊離氨基與殼聚糖中氮原子總數的比值[26,27]。例如，在合成TMC[27]過程中，殼聚糖脫乙酰率為75%的殼聚糖將有75%的氮原子可用於甲基化。在配方中，去乙酰化>90%的殼聚糖比去乙酰化75%的殼聚糖更受青睞，因為在配方前研究中，去乙酰化程度越高，TMC產量越高。此外，一步甲基化法可生成較多的正二甲基殼聚糖(一種雜質)，兩步合成可生成四分之一化率較高的TMC。因此，與單獨一步合成相比，兩步四分化方法似乎可以產生更高純度和收率的TMC。高四分化是很有吸引力的，因為它在很寬的pH範圍內促進高溶解度[22]。因此，本研究采用兩步合成的方法來增加殼聚糖在胺基上的甲基化。

顆粒大小

從圖2A可以看出，除配方D和H的尺寸分別為1384.0±113.8和1035.5±207.7 nm外，其餘配方均在納米範圍內。配方A、C和G的粒徑最小，分別為382.9±18.2 nm、371.9±146.8 nm和310.9±5.4 nm。隨著TMC濃度的增加，顆粒尺寸增大(p=0.004)。從圖2B可以看出，隻有1:1的TMC:TPP比例不在納米範圍內，其尺寸為1035.5±207.7 nm。TMC:TPP比為3:1時，粒徑最小，為371.9±146.8 nm。隻有3:1和1:1之間的差異在統計學上得到證實(p=0.007)。從圖2C可以看出，所有配方的粒徑都在納米範圍內。TMC-CSK NPs的粒徑最小，為173.6±7.7 nm。殼聚糖NPs、TMC NPs和TMC- csk NPs的粒徑差異顯著(p≤0.05)。

圖2:TMC納米顆粒配方粒徑A-H。結果報告為平均±95% CI, n=3;B):不同TMC:TPP比例TMC納米顆粒配方的粒徑。結果報告為平均±95% CI, n=3;C): 4.17 mg/mL TPP和5 mg/mL聚合物製備的殼聚糖、TMC和TMC- csk NPs的粒徑。結果報告為平均±95% CI, n=3。

比較不同聚合物製備的NPs, TMC NPs的平均尺寸比殼聚糖NPs小(p≤0.05)，與前人研究一致[28,29]。根據dehouse等人[30]的研究，與殼聚糖相比，TMC上更高的電荷密度導致形成更致密的NPs。Ing等[28]支持的理論，認為TMC NPs由於與聚陰離子TPP[30]有強靜電相互作用，因此尺寸較小。本研究還觀察了CSK對降低顆粒尺寸的作用。TMC- csk與TMC的觀察差異有統計學意義(t檢驗p值≤0.05)。這與Jin等人的研究結果相矛盾，他們發現胰島素負載的TMC-CSK NPs表現出更大的[10]大小。根據作者的說法，這可能是由於CSK的引入，其MW為1018 Da[10,15]。然而，重要的是要注意，胰島素和CSK都帶負電荷，與我們的配方相比，靜電斥力可能在增加顆粒尺寸方麵發揮了作用。通過比較已知的中性生理電荷，吉西他濱可能不會幹擾TMC和CSK的靜電相互作用，從而產生比胰島素更緊湊的NPs。

顆粒大小在化療藥物的輸送中是至關重要的，因為它影響滲透和保留[31]。直徑小於300nm的NPs具有幾個優點，包括提高穿透黏液層的能力，增加全身分布，並通過M細胞和腸細胞[32]增強腸道吸收。然而，這些NPs必須大於8nm，因為小於8nm的NPs會滲透到健康組織的內皮間連接，導致靶向性降低和副作用增加[33]。此外，癌細胞具有更大的內皮細胞間連接(在40 ~ 1000nm之間)，這有利於更大的滲透。這與腫瘤中的淋巴引流不良一起促進了納米顆粒滯留，並減少了潛在的副作用。Win、Feng及其同事證明，Caco-2細胞係[34]對100-200 nm大小的聚合物NPs的攝取是最佳的。作者還提到，這些NPs被認為是通過受體介導的內吞作用內化的，而較大的NPs更容易被吞噬[34]。這些結果表明，與平均粒徑大於300 nm的殼聚糖和TMC NPs相比，173.6±6.8 nm的TMC- csk NPs可能具有胃腸道吸收優勢。

多分散性指數

PDI是衡量同質性的一個指標，較高的PDI意味著更寬的規模分布[13]。從圖3A可以看出，配方A、B、F、G的PDI值均小於0.5 (PDI值分別為0.399±0.033、0.424±0.054、0.389±0.042、0.43±0.027 nm)，較其他配方更為均勻。這也反映在它們的小95% CI中，這意味著較小的尺寸分布和顆粒的均勻性增加。此外，PDI隨著TMC濃度的增加而增加。圖3B顯示，所有比值的PDI值變化為0.053，均為> 0.5,TMC:TPP比值對PDI的影響在所有TMC:TPP比值值上不被認為具有統計學意義(p≥0.05)。此外，從圖3C可以看出，殼聚糖、TMC和TMC- csk NPs三個配方組的PDI均< 0.5，而TMC- csk NPs的PDI最低，為0.20±0.02。3個製劑組的PDI差異有統計學意義(p≤0.05)。

圖3:A):納米顆粒配方的PDI A- h。結果報告為平均±95% CI, n=3;B):不同TMC:TPP比例的納米顆粒配方的PDI。結果報告為平均±95% CI, n=3;C):用4.17 mg/mL TP和5 mg/mL聚合物製備殼聚糖、TMC和TMC- csk NPs的PDI。結果報告為平均±95%CI, n = 3。

電動電勢

從圖4A可以看出，所有配方(A-H)的ζ電位均為正，而配方C和E的ζ電位分別為+25.7±1.0和+12.6±4.6 mV，均位於+10 ~ +30 mV的理想ζ電位範圍內。此外，zeta電位隨著TMC濃度的增加而降低。圖4B顯示，TMC:TPP比例為1:1時，zeta電位為+0.12±0.13 mV，不在+10和+30 mV的理想範圍內。而TMC:TPP比例為3:1時zeta電位最大，為+25.23±1.74 mV，是TMC:TPP比例為6:1時zeta電位的兩倍，是TMC:TPP比例為1:1時zeta電位的25倍。3個不同比例組的zeta電位差異顯著(p≤0.05)。由圖4C可知，隻有TMC- csk NPs的zeta電位為18.5±0.2 mV，處於+10 ~ +30 mV的理想範圍內，殼聚糖、TMC和TMC- csk NPs的zeta電位差異顯著(p≤0.05)。

圖4:A): TMC納米顆粒配方的Zeta電位A- h。結果報告為平均±95% CI, n=3;B):不同TMC:TPP比例的納米顆粒配方的Zeta電位。結果報告為平均±95% CI, n=3;C): 4.17 mg/mL TPP和5 mg/mL聚合物製備的殼聚糖、TMC和TMC- csk NPs的Zeta電位。結果報告為平均±95% CI, n=3。

TMC NPs的zeta電位低於殼聚糖NPs (p≤0.05)。高zeta電位是有利的，因為它代表粒子之間的靜電排斥，從而賦予一定程度的配方穩定性[35]。TMC NPs通常會引起殼聚糖NPs更大的ζ電位。根據Boonyo等人的說法。TMC NPs具有較高的zeta電位，這是因為TMC鏈[29]上有帶正電荷的位點。據此，Sadeghi等推測殼聚糖的氨基向季銨基的轉變是其具有較高正電荷和ζ電位[36]的原因。TMC的合成涉及到殼聚糖中伯胺基團的甲基化，這種甲基化本身已被證明可以降低分子的zeta電位。這是因為甲基取代以穩定的方式影響電荷分布[37]。正因為如此，殼聚糖的甲基化可能會降低整體的zeta電位。此外，CSK的共軛使zeta電位進一步下降，這歸因於CSK的陰離子特性。 Higher zeta potentials are preferred, however, values greater than 30 mV are unfavourable, since the strongly cationic characteristic can be disruptive to cell membrane integrity [4]. TMC-CSK NPs exhibited a mean zeta-potential of +18.5 ± 0.2 mV, and are therefore less likely to disrupt cellular membranes compared to chitosan and TMC NPs.

截留效率

圖5A顯示，所有配方的EE均大於70%，平均EE為73.3%。配方D的EE%最高，為73.6±0.9%。對於殼聚糖，大多數藥物的摻入是通過與殼聚糖中遊離的正胺基團相互作用[4,38]。吉西他濱通過離子凝膠[4]形成時，通過離子和氫鍵相互作用。由於EE對所有聚合物都具有可比性，因此可以推測，即使對於甲基化的TMC(和TMC- csk)，這種相互作用仍然通過與殘留的伯胺基團和可用氫的相互作用發生。TMC濃度的增加被推測對藥物包埋有更大的阻礙[4]。因此，從結果可以看出，增加TMC濃度對EE有增加作用。圖5B顯示，所有TMC:TPP比值組的EE值均大於70%。最高EE為TMC:TPP，比例為6:1,EE值為73.4±0.4%。此外，觀察到TMC:TPP各比例組的EE無顯著差異(p≥0.05)。 Figure 5C displayed that all the delivery systems of chitosan, TMC and TMC-CSK NPs had an EE of greater than 65%. TMC-CSK NPs displayed a lower EE than TMC or chitosan NPs by a margin of 0.3%. This difference however, was statistically confirmed (p ≤ 0.05). TMC NPs yielded better EE than chitosan NPs by 0.03% but this difference could not be statistically confirmed (p=0.33).

圖5:A):配方A- h的EE %值，每個配方用50 mg吉西他濱製備。結果報告為平均±95% CI, n=3;B):不同TMC:TPP比例的納米顆粒配方的EE%。結果報告為平均±95% CI, n=3;C): EE%的殼聚糖、TMC和TMC- csk NPs，分別用50 mg吉西他濱、4.17 mg/mL TPP和5 mg/mL聚合物製備。結果報告為平均±95% CI, n=3。

在對EE進行聚合物比較時，最佳聚合物為TMC，其次為殼聚糖和TMC- csk。殼聚糖與TMC的粗脂肪含量進行t檢驗，差異無統計學意義(p值為0.33)。與殼聚糖相比，TMC NPs具有更低的ζ電位，並且由於定義上離子相互作用的正電荷密度的差異，我們可能預期看到吉西他濱與TMC之間的相互作用相對較少。然而，這被證明是微不足道的，這可能表明在目前的反應條件下，吉西他濱-胺相互作用的潛在位點沒有飽和[2]。TMC- csk NPs的EE值較TMC和殼聚糖NPs低。TMC和CSK是大分子，當第三個分子(如吉西他濱)試圖合並自己[39]時，這些分子的共軛會產生空間位阻。此外，輔料也會影響納米顆粒的EE。然而，Hosseinzadeh等人的一項研究發現，在殼聚糖納米顆粒配方中添加不同數量的吉西他濱時，包封效率沒有差異，盡管使用的濃度要小得多(0.2-1.0 mg/mL vs 7.1 mg/mL)[2]。在未來，可以探索不同濃度的吉西他濱來優化TMC-CSK NPs的包封效率。

總體而言，配方A表現出最有利的組合，粒徑為382.9±18.2 nm, PDI為0.40±0.03，ζ電位為+35.6±0.2 mV。以此為模型配方，考察殼聚糖、TMC和TMC- csk NPs之間的差異。配方D和H被排除在進一步表征的基礎上的大小。配方G表現出良好的特性，但產量較低，表明該配方的生產不經濟，因此被排除在外。

表麵形態

利用掃描電鏡進行形態學研究。圖6顯示了TMC NPs和TMC- csk NPs的SEM照片，通過離子凝膠法製備的TMC NPs表麵略粗糙，呈多麵體形狀[29,40,41]。眾所周知，納米顆粒的特性高度依賴於TPP和聚合物重量比等參數，盡管這更多地與納米顆粒大小和表麵電荷有關，而不是形貌或地形[40]。其他研究表明，當通過離子凝膠製備最佳時，典型的球形聚合物NPs，因為球體是溶液[42]中能量最有利的構象。Wang等人提出了一種理論，可以解釋我們的觀察結果，他們假設多麵體形狀是可能的，其中凝膠作用形成一個核，從核中發生聚合結晶，從而產生多麵體NPs[39]。此外，與新鮮配方[4]相比，冷凍幹燥的NPs容易膨脹、碎裂，並可能導致更粗糙的表麵。冷凍幹燥的TMC-CSK NPs在掃描電鏡下顯示為大團聚體，納米顆粒懸浮液的製備和直接用馬爾文zeetasizer測量，因此，與冷凍幹燥的NPs[40]相比，團聚體較少。因此，在冷凍幹燥前製備的懸浮液中的NPs可能比所描述的更小，更對稱。此外，兩張顯微照片都顯示了納米範圍內的粒子。在不同的製劑中，聚合是最小的，這表明納米顆粒相對穩定，這與我們通過分析zeta電位[43]的電動動力學研究確定的相對較高的表麵電荷是一致的。

圖6:TMC NPs的SEM顯微圖(A);TMC-CSK NPs (B);TMC-CSK NPs與更多粒子(C)。

在體外藥物釋放

從圖7中可以看出，單獨使用吉西他濱時，藥物釋放在前四小時內發生了81.6±3.5%的釋放，在24小時內發生了93.7±2.7%的釋放。吉西他濱的納米給藥形式證明了藥物的持續釋放，在24小時內，被包裹的藥物從聚合物基質中穩定擴散。這兩種納米顆粒遞送係統具有相似的釋放譜。TMC- csk NPs的釋藥速度比TMC NPs略快。24小時結束時，TMC- csk NPs中捕獲的吉西他濱釋放了89.3±2.4%，而TMC NPs中吉西他濱釋放了77.6±4.1%。

圖7:在體外殼聚糖、TMC和TMC- csk NPs在37℃PBS (pH 7.4)中釋放吉西他濱。所示值為平均值±95% CI, n=3。

持續藥物釋放是納米顆粒給藥配方的理想參數，因為它延長了給定藥物[17]的有效劑量。非配方吉西他濱釋放迅速在體外這有問題的影響，包括由於細胞暴露而增加的副作用風險原位，可能導致局部細胞毒性損傷，意味著增加給藥頻率以維持目標治療濃度[43]。與TMC- csk NPs相比，偶聯TMC- csk NPs表現出更快的藥物釋放。這種效應可能是由於分子水平上的聚合排列，其中大的共軛CSK肽代表了致密納米顆粒形成的空間屏障，導致與納米顆粒本身的直徑無關[10]。這將促進更低密度、更多孔的納米顆粒，更容易被水滲透，從而允許更快速但可能更完整地釋放封裝的吉西他濱分子。

細胞藥物攝取研究

由圖8可知，分別在4°C和37°C的溫度下進行藥物攝取研究。37℃下，吉西他濱溶液、吉西他濱負載TMC NPs和吉西他濱負載TMC- csk NPs 2小時後的吸收量遠高於4℃下的吸收量，表明吸收是能量依賴的。此外，在4°C (p< 0.05)和37°C (p<0.01)，裝載吉西他濱的TMC- csk NPs和裝載吉西他濱的TMC- csk NPs的藥物吸收量均顯著高於吉西他濱溶液(p<0.01)，裝載吉西他濱的TMC- csk NPs的藥物吸收量均顯著高於裝載吉西他濱的TMC NPs (p<0.01)。此外，在37°C下進行的實驗表明，載藥TMC NPs的攝入量是4°C下的1.9倍。而對於載藥TMCCSK NPs，在37℃時攝取的量是4℃時的2.3倍。

圖8:500µg/mL吉西他濱溶液、裝載吉西他濱的TMC NPs和裝載吉西他濱的TMC- csk NPs在4℃和37℃2小時後的溫度依賴性攝取(均值±SD, n=3;與對照組差異顯著，*:p<0.05， **: p<0.01;與TMC NPs差異顯著，##:p<0.01)。

內吞作用是一個依賴能量的過程，在低溫下被阻斷[45]。在37°C孵育時，細胞代謝活躍，可以發生能量消耗攝取。相反，在4°C時，代謝降低，從而減少了NPs與細胞膜的結合。我們的結果證明TMC NPs和TMC- csk NPs的細胞攝取都是由內吞作用介導的。這與之前的研究結果一致，即HT29-MTX-E12細胞[4]攝取TMC基NPs的主要機製是內吞作用。此外，CSK肽的存在促進細胞攝取是由於CSK能夠靶向腸杯狀細胞。此外，加載藥物的TMC-CSK NPs與藥物溶液相比，在2小時內細胞攝取顯著增加。值得注意的是，2小時足以使裝載吉西他濱的NPs到達小腸並達到腸上皮細胞最大攝取，這表明對腸道藥物吸收有很大的益處。因此，在本細胞攝取研究中，TMC-CSK NPs顯示出極大的腸道藥物攝取益處，從而提高藥物的口服生物利用度。此外，盡管從之前的藥物釋放研究來看，TMC-CSK NPs釋放吉西他濱的速度比TMC NPs更快，但CSK在細胞藥物吸收進入體循環方麵的優勢仍有待觀察，因為這是未來臨床使用的一個重要因素。

負載吉西他濱的最佳配方的穩定性

研究了優化後的TMC NPs和TMC- csk NPs在不同條件和時間間隔下的穩定性。在90天的儲存期內，提取最佳配方並評估其大小和保留藥量。兩種最佳納米顆粒配方的物理和化學穩定性結果見表3和表4。

從粒徑分析數據(表3)可以看出，NPs的粒徑在4℃條件下穩定3個月，在25℃條件下穩定2個月。結果表明，貯藏溫度對其穩定性有顯著影響。在較高的溫度下，NPs的聚集速度比在低溫下更快。這可能是因為傳遞給囊泡的熱能導致囊泡之間的碰撞速率和力都增加了。碰撞和聚集導致顆粒尺寸增大。這些結果表明，所製備的NPs的存儲溫度為4°C，在3個月的時間內，粒徑變化最小。

批#	儲存條件	粒徑(d.nm)
		0月	1個月	2個月	3個月
載藥TMC NPs	4°C	382.9±18.2	388.9±28.2	382.9±8.2	392.9±11.4
	25°C	382.9±18.2	392.9±24.1	402.1±24.2	407.9±22.0
	40°c, 75% rh	382.9±18.2	402.1±17.0	441.5±19.1	452.9±27.8
藥物加載TMC-CSK NPs	4°C	173.6±6.8	168.6±11.2	183.6±2.9	178.6±12.1
	25°C	173.6±6.8	175.6±16.4	183.0±7.7	198.5±4.5
	40°c, 75% rh	173.6±6.8	201.4±15.4	244.5±26.1	257.2±13.3

表3:貯藏條件對凍幹最佳NPs顆粒大小的影響(均值±標準差，n = 3)

另一個要確定的穩定性參數是製備的NPs在90天儲存期間的藥物泄漏。在4℃、25℃和40℃三種不同的溫度下，測量了NPs中藥物保留的百分比。存儲溫度對NPs 90天內藥物保留量的影響見表4。從表中可以看出，分析的最佳NPs的初始藥物含量隨著時間的推移逐漸降低，說明溫度對顆粒穩定性有顯著影響。特別是在40°C/75% RH條件下，TMC NPs和TMC- csk NPs的藥物含量在3個月的存儲時間內發生了相對顯著的變化。TMC NPs和TMC- csk NPs的藥物含量在第三個月分別降低到約83%和74%。在高溫和潮濕條件下，聚合物的降解可能導致藥物含量的降低[46]。

批#	儲存條件	吉西他濱用量(初始用量%)
		0月	1個月	2月	3個月
載藥TMC NPs	4°C	One hundred.	102.1±4.2	97.1±2.2	103.1±2.0
	25°C	One hundred.	93.4±6.2	86.1±3.7	87.4±6.6
	40°c, 75% rh	One hundred.	85.7±8.5	91.1±2.2	83.1±4.8
藥物加載TMC-CSK NPs	4°C	One hundred.	99.2±5.2	98.1±3.4	91.4±2.6
	25°C	One hundred.	87.4±5.3	92.1±5.1	90.3±2.6
	40°c, 75% rh	One hundred.	83.7±8.5	78.1±12.2	74.1±11.8

表4:貯藏條件對吉西他濱化學穩定性的影響(Mean±SD, n = 3)

根據觀察，載藥TMC NPs和TMCCSK NPs應保存在4℃，在此條件下，TMC NPs的顆粒大小和藥物含量均保持穩定。

結論

吉西他濱是一種具有既定臨床作用的抗癌藥物。然而，其較差的口服生物利用度限製了它隻能通過腸外給藥。開發新的給藥係統是為了使口服吉西他濱有效給藥。本研究以殼聚糖為原料，采用兩步法甲基化合成TMC，再與CSK偶聯製備NPs。TMC-CSK NPs粒徑相對較小，在最佳zeta電位範圍內，具有良好的口服給藥效果。TMC NPs和TMC- csk NPs均表現出持續釋藥方式。與藥物溶液和TMC NPs相比，TMC-CSK NPs明顯改善了細胞攝取，證明了CSK肽的杯狀細胞靶向能力。基於穩定性研究，載藥TMC NPs和TMC- csk NPs應在4℃保存，在此條件下，它們的顆粒大小和藥物含量均保持穩定。我們的研究結果表明，TMC-CSK NPs具有良好的口服給藥性能，可作為未來研究的初步基礎，最終目標是創建可用於臨床和社區環境的吉西他濱口服給藥係統。

確認

藥學410組學生在本研究項目中的貢獻。他們是Angus Tan, Alanna Adams, Pooja Kumar, Ryan Moxham Smith和Georgina Soo。

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文章類型:研究文章

引用:陳剛，黃燕，文傑(2018)CSKSSDYQC肽修飾n -三甲基殼聚糖納米顆粒口服吉西他濱的先進給藥體係的研製。醫學化學藥物雜誌1(2):dx.doi。org/10.16966/2578 - 9589.109

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出版的曆史:

收到日期:2018年5月15日

接受日期:2018年6月29日

發表日期:2018年7月5日