簡介
線粒體是年齡相關性神經退行性疾病中活性氧水平增加的來源之一[1]。ROS增加與線粒體DNA (mtDNA)損傷[2]相關。PBMC的線粒體氧化磷酸化在HIV-1慢性感染中被抑製，並與免疫失調[3]相關。結果表明，HIV-1 Tat抑製神經元細胞的存活通過線粒體功能障礙和線粒體氧化磷酸化的改變可能是HIV-1發病機製[4]的一個基本特征。HIV-1感染對線粒體[5]有多種影響，並被證明減少PBMCs中的mtDNA[6-9]。HIV-1 Tat通過產生線粒體ROS[10]增加人外周血b淋巴細胞的DNA損傷。HIV-1 Tat和gp120蛋白可增加人神經元[11]的線粒體碎片化。此外，HIV-1 Tat可導致活化的小膠質細胞[12]線粒體功能障礙。研究還發現，另一種HIV-1產物輔助調控蛋白Vpr可誘導atr啟動的DNA損傷信號通路激活，導致Chk1磷酸化，形成γ - h2ax和53BP1核病灶[13-16]。此外，Vpr被證明在DNA損傷反應中發揮作用通過與受損的dna結合蛋白(DDB1)和vpr結合蛋白(VprBP) (DDB1[17]的結合夥伴)相互作用。此外，高活性抗逆轉錄病毒療法(HAART)的主要成分，核苷類似物逆轉錄酶抑製劑(NRTIs)，抑製在體外DNA聚合酶-γ，它控製mtDNA複製[18]。線粒體基因組長度為16.6 kb，編碼37個基因:2個rrna, 22個trna和13個蛋白質亞基。所有這些分子都參與了氧化磷酸化的調節。線粒體基因由母體遺傳，大部分(99%)線粒體蛋白受核DNA (nDNA)調控，在細胞質中翻譯，然後轉運到線粒體間隔[19]。線粒體在10-25天內被替換，舊的線粒體被自噬(mitophagy)取代。HIV-1在hiv相關的神經認知障礙[20]中影響神經元中的線粒體裂變/融合。每個細胞包含多達數千個mtDNA分子。mtDNA以類核結構組織，每個類核包含2-10個mtDNA分子和幾個線粒體蛋白。腦內mtDNA的半衰期長達25天。mtDNA在線粒體內被複製和轉錄，獨立於核DNA複製由核編碼的mtRNA聚合酶，mtDNA聚合酶-γ。 mtDNA replication takes about one hour, and it involves regulation of mtDNA copy number. Interestingly, nDNA is less susceptible to oxidative damage than mtDNA. Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs), cause defective mtDNA replication by inhibiting Pol-γ mtDNA replication peaked after 72 h in cortical neurons. Each mitochondrion contains 4-10 DNA molecules, and each cell has 1,000- 10,000 copies of 16.5 kb of circular DNA.
在年齡相關神經退行性疾病[21]中，nDNA比mtDNA對dna損傷劑的敏感性更低，在氧化應激後的人類細胞中，nDNA損傷比mtDNA損傷更小。線粒體DNA損傷的修複機製是堿基切除修複(BER)途徑。線粒體dna損傷的積累和ros誘導的線粒體dna損傷與年齡相關的誤碼率下降有關8-oxoguanine DNA glycosylase-1(OGG1)，一種可以修複8-oxoG DNA損傷[1]的酶。
與核DNA相比，對hiv - 1感染過程中神經元mtDNA的了解要少得多。最近的幾項研究證實了Tat對線粒體生物能學的影響，盡管沒有關於Tat和HIV-1對人類神經元線粒體DNA損傷的直接影響的信息。此外，Tat對PBMC mtDNA水平和線粒體功能的影響最近被描述為[22]。Tat對心肌細胞[23]線粒體生物能學的影響也被證實。此外，Tat對Jurkat細胞[22]線粒體基因和DNA的影響也顯示出來。其他研究討論了Tat對人外周血b淋巴細胞DNA損傷的影響通過線粒體ROS產生[10]。最後，最近有研究表明Tat可誘導人肝髒和心髒[24]線粒體膜通透。到目前為止，還沒有發現Tat或HIV-1感染對人類神經元mtDNA損傷的直接影響。
我們的目標是檢測Tat對神經線粒體DNA的影響，作為神經hiv神經退行性變和神經並發症的潛在事件之一。
有必要進一步研究感染過程中神經元mtDNA的損傷，以揭示HIV和HIV 1蛋白Tat或Vpr在mtDNA損傷和線粒體生物能學中的作用。為了回答這個問題，我們使用人類初級神經元培養模型和人類PBMC研究HIV-1感染過程中mtDNA的損傷，或HIV Tat和Vpr蛋白引起的mtDNA損傷。
材料和方法
細胞培養
人類初級皮層神經元由Darbinyan博士在我們的實驗室製備[4,25-28]。根據天普大學IRB批準的協議，從高級生物科學資源公司(ABR)， Alameda, CA 94501美國獲得選擇性流產產生的人類胎兒大腦。該方案也符合當時NIH的指導方針，盡管目前NIH的指導方針不允許新的人類胎兒組織的收集。簡單地說，收集16周胎兒大腦(約13 g)，用Tryple Express酶(Invitrogen, CA)、DNase I (10 U/mL;Sigma, St. Louis, MO)在7°C下浸泡15分鍾，然後用Hibernate E培養基洗滌三次。使用含有B27補充劑和0.25 mM穀氨酰胺的神經基培養基，用玻璃巴斯德移液器進行組織穿刺，然後細胞被鍍在聚d -賴氨酸塗層的60毫米培養皿(Sigma)上。16 h後，向細胞中加入1 μM的阿糖胞苷Ara-C (Sigma)，持續48 h。細胞在含有慶大黴素10 μg/mL、青黴素100單位/mL和鏈黴素10 μg/mL等多種抗生素的neurobasis培養基中培養。培養基中還含有1 μg抗真菌菌素(Life Technologies, Inc.)。細胞在37°C培養箱中保存。
神經細胞的治療
神經細胞用rTat 101 (ImmunoDiagnostics, Inc，)， (50 ng/mL，或3.6 nM)，或來自HIV-1感染PBMC的條件培養基(CM)處理56小時。20 ng魚藤酮R 8875 (Sigma)作為mtDNA損傷陽性對照。
質粒
pEYFP-C1 (BD Biosciences Clontech)和CFP-Tat質粒先前由Darbinian-Sarkissian N等人描述過。
轉染
根據製造商的說明，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA)和5 μg質粒DNA轉染神經元細胞，105個細胞被鍍在60 mm板上。每次用不同的質粒製劑重複轉染至少兩次，每個樣品重複三次。
PBMC感染HIV-1
根據天普大學(Temple University)批準的IRB協議，從收集的Buffy Coat中培養PBMC。PBMC感染使用HIV-1的JR-FL株進行，如前所述[30]。細胞在RPMI培養基中培養。將含p24的病毒原液50 ng加到1 × 10中6細胞。首先，將細胞與病毒原液一起在37°C無血清培養基中孵育2小時，然後用PBS洗滌兩次。同時，在hiv -1感染4天後製備未感染的對照細胞。收集細胞，用p24 ELISA法分析。在56°C下熱滅活病毒2小時。樣品在加熱時不斷混合。然後將病毒放在冰上孵育，並在3小時內使用。
p24 ELISA
感染後5天收集上清，使用p24 ELISA試劑盒(BioChain Institute, Inc.， CA)檢測病毒p24的存在。用450nm濾片的分光光度計對樣品進行測定，確認樣品中存在HIV p24。
用qPCR分析mtDNA損傷
核(nDNA)和線粒體(mtDNA) DNA完整性的QPCR是用GeneAmp XL-PCR試劑盒(Applied Biosystems)進行的，該試劑盒允許對高達20kb的DNA產物進行長時間PCR。
DNA損傷的估計
采用Pico技術定量PCR產物，計算病變頻率[31-34]。
DNA分離和qPCR
使用QIAamp DNA分離試劑盒(Qiagen, Chatsworth, CA)純化基因組DNA，進行長鏈PCR[35,36]。qpcr采用GeneAmp PCR System 2400和GeneAmp XL PCR試劑盒進行。15 ng基因組DNA, 100 μg/mL非乙酰化牛血清白蛋白，0.2 mM DNTPs, 0.2 μM引物，1單位rThermus結合嗜熱菌DNA聚合酶進行長鏈定量pcr。PCR循環從75°C熱啟動開始。初始變性在94°C為1分鍾，然後25個周期，包括94°C變性15秒和68°C引物延伸12分鍾。循環結束後，在72°C下進行最後10分鍾的伸展。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行凝膠電泳，在TBE (90 mM Tris/64.6 mM硼酸/2.5 mM EDTA, pH 8.3)中，在80 V下電泳4小時。
引物
17.7 kb β-珠蛋白基因(GenBank: J00179)引物核苷酸序列βGlobinf 5 ' - ttgagacgcatgagacgtgag -3 '， βGlobinf -r 5 ' -GCACTGGCTTAGGAGTTGGACT-3 ';β珠蛋白-f 5 ' -CGA GTA AGA GAC CAT TGT GGC AG;線粒體基因組(J01415)的16.2 kb片段為MtL-f 5 ' -TGAGGCCAAATATCATTCTGAGGGGC-3 ';MtL-r 5 ' -TTTCATCATGCGGAGATGTTGGATGG-3 ' (RH1066)和Mt Short反向引物:5 ' -GTAGCCTCCTCAGATTCATTGAAC-3 '。
λDNA
從2 × 107起始拷貝，20.8 kb DNA靶物每100 mkl反應1 ng;4 mkl/lane (0.3 mkg)。基因組dna -每100 μL反應1 μg。
DNA損傷的頻率
這些可以計算為損傷DNA (AD)的擴增，將其歸一化為非損傷對照(AO)的擴增，這就產生了一個相對擴增比。假設病變隨機分布並使用泊鬆方程，每條DNA鏈的平均病變頻率被確定為λ =−ln aD/一個O
病變
損傷(斷裂頻率，BF)= mtDNA頻帶強度的-ln(治療/對照)使用泊鬆方程計算:每條鏈的平均損傷頻率可計算為λ =−ln AD/一個O．1個損傷/mtDNA分子(16.5 kbp)被認為是每1個kbp片段進行相對擴增0.061個損傷。
線粒體拷貝數:每個轉錄本的熒光圖像
這是在530納米波長下檢測到的。線粒體基因拷貝的量化是通過每個線粒體轉錄物的平均濃度與每個樣本[33]的平均管理核糖體或珠蛋白基因濃度的比值來完成的。
RNA製備
使用總RNA分離試劑盒(Ambion, TX, USA)從人類神經元中分離RNA。使用逆轉錄酶(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)將1 μg RNA用於cDNA合成。用2.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析擴增的DNA。
rt - pcr
SuperScript III鉑一步RT-PCR係統Taq(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。用1微克ogg1基因的總RNA和引物擴增ogg1。三步循環，分別執行退火和擴展步驟:1）cDNA合成和55°C預變性30分鍾;2）40次PCR擴增，94℃變性15秒，60℃退火30秒，68℃延伸1分鍾;而且3)最後在68°C下伸展5分鍾。用2.0 %瓊脂糖凝膠進行DNA凝膠電泳分析。
實時的存在
使用RNeasy試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)分離總RNA。RT-PCR反應采用1 μg總RNA，使用one - step FAST RT-PCR SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)進行。采用StepOnePlus Real-Time PCR係統熱循環器。(應用生物係統公司)。PCR條件如下:激活95°C 5分鍾，PCR 45個循環:95°C 10秒，60°C 20秒，72°C 30秒，熔化曲線(95-65°C)，冷卻至40°C 30秒。為了進行相對定量，基因表達水平歸一化為管家基因β-actin。結果以任意單位表示，以對照百分比表示。
蛋白質提取物的製備
用冰冷的TNN緩衝液(Sigma)和1%蛋白酶抑製劑雞尾酒(Sigma)清洗細胞。在4°C (14000 RPM)下離心5分鍾去除細胞碎片。10微克蛋白質在95°C加熱10分鍾，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。
線粒體的提取製備
從50 × 10的樣品中提取線粒體提取物6細胞使用線粒體提取試劑盒(Imgenex)。
免疫印跡分析
蛋白質樣品通過SDS/PAGE分解，並轉移到負載硝化纖維素膜(Bio-Rad)，在4℃轉移緩衝液(25 mM Tris pH 7.4, 193 mM甘氨酸，20%甲醇)中2小時，如[29]所述。在室溫下用10%脫脂幹牛奶PBS- t (1 × PBS/0.1%吐溫-20)阻隔膜30分鍾後，清洗膜，在5%脫脂幹牛奶中以1:1000稀釋的一抗孵育2 h。洗滌三次後，用結合辣根過氧化物酶的抗鼠抗體或抗兔抗體(1:10 000稀釋)孵育印跡。蛋白質用增強化學發光檢測係統ECL+ (Amersham Pharmacia)進行可視化，並暴露於x射線膠片。
定量免疫印跡分析
線粒體蛋白10µg用6 × Laemmli SDS-樣品還原緩衝液稀釋，95°C加熱10 min, 1X Tris-GlycineSDS緩衝液中梯度SDS- page凝膠電泳(4-20%)分離，4°C轉移至硝化纖維素膜(Bio-Rad)和吸墨紙(GB003級)2 h。用奧德賽®CLx成像係統對印跡進行三次清洗，並用特定的一級抗體和二級IRDye®抗體檢測蛋白質。對於LI-COR係統，印跡用IRDye®800CW山羊抗兔和IRDye®680RD山羊抗鼠LI-COR染料進行培養，並使用Odyssey®CLx成像係統(LI-COR, Inc.， Lincoln, NE)使用Odyssey軟件(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA)進行可視化。
抗體
Lamin A、VDAC、Bax、Bad和細胞色素C抗體來自Santa Cruz生物技術公司(Santa Cruz, CA)。小鼠單克隆Grb2來自BD Biosciences (San Jose, CA)，抗α-微管蛋白克隆B512來自Sigma-Aldrich (SigmaAldrich Co, St. Louis, MO)，抗甘露糖苷酶ii -高爾基標記來自ABCAM (ABCAM Inc.)。馬)。
ATP測定
用ATP檢測試劑盒檢測ATP水平。用Tat或魚藤酮孵育人胎神經元，然後用差速離心分離線粒體片段。使用ATP測定試劑盒(分子探針，Eugene, OR)測定ATP。這是一種利用重組螢火蟲熒光素酶蛋白和底物d -熒光素定量測定ATP的生物發光試驗。在90 μL標準反應溶液、d -螢光素和2.5 μL螢火蟲螢光素酶(5 mg/mL)中加入10 μL裂解液。生物發光使用發光計(Femtomaster FB 12發光計，Zylux)測量。
活性氧測定試驗
神經元細胞在顯微鏡蓋眼鏡(Fisherbrand)上培養，轉染或用Tat處理。用1 mM MitoSOX red (Life Technologies)孵育30分鍾後，用共聚焦顯微鏡分析細胞。MitoSOX紅信號用Image J量化。
超氧化物歧化酶(SOD)活性測定
用OxiSelect SOD活性測定試劑盒測定原代神經元細胞中的SOD活性。製備神經元細胞的胞質組分，用黃嘌呤氧化酶溶液在37℃下孵育1小時。生成的超氧陰離子在490 nm處測定。測定SOD活性抑製顯色原還原。超氧陰離子濃度在SOD的存在下降低，導致比色信號減弱。SOD活性以對照組的%表示。
統計分析
數據分析采用Excel軟件、Student’s t檢驗和Image J軟件(NIH)。誤差條表示兩個實驗中三個獨立讀數的標準差。
顯微鏡
使用IPLAB軟件捕獲tat處理的神經元細胞圖像。使用藍色(CFP)熒光對CFP-Tat蛋白和Tat缺失突變體進行熒光染色。將人神經元植入聚l -賴氨酸包被玻片室，用50 ng/mL Tat蛋白孵育48 h後，顯微鏡下分析細胞。使用Adobe Photoshop 5.5版本調整對比度和亮度。熒光圖像原始放大倍數為400倍，相位圖像為200倍。
結果
HIV-1誘導人類皮層神經元和PBMC線粒體DNA損傷
我們比較了HIV-1感染PBMC或用HIV-1條件培養基處理神經元對mtDNA損傷的影響。我們證明，HIV-1感染PBMC(圖1B)或HIV條件培養基(圖1A)均導致人類皮質神經元和PBMC mtDNA損傷增加。我們還證明，雖然線粒體和核DNA都受到了損傷，但mtDNA的損傷比陽性對照魚藤酮處理的效果更強。此外，用HIV-1毒株或熱滅活HIV-1感染人PBMC細胞5天。來自PBMC的條件培養基進一步用於神經細胞處理24小時(右麵板)，並純化基因組DNA (gDNA)進行mtDNA研究。進行qPCR，生成線粒體(上條)和β-珠蛋白片段(下條)。對照培養物在魚藤酮培養基中培養。瓊脂糖凝膠的代表性圖像顯示，擴增的17.7 kb β-珠蛋白片段(較低的麵板)和16.2 kb的線粒體片段(上麵板)．對mtDNA和nDNA進行短鏈聚合酶鏈反應，以歸一化從長鏈聚合酶鏈反應獲得的數據。在hiv -1培養或感染的細胞中，相對擴增的減少用圖表表示。結果，在右側的相同樣本中顯示病變增加。這些發現清楚地表明失活的HIV-1不能引起mtDNA損傷。我們還表明，雖然HIV-1不能感染神經元，但HIV-1分泌分子，包括Tat和Vpr蛋白，以及炎症細胞因子和趨化因子在神經元細胞死亡中發揮了重要作用。
圖1:HIV-1和HIV-Tat誘導人類皮層神經元和PBMC線粒體DNA損傷。
一)首先用HIV-1或熱滅活HIV-1感染人PBMC細胞5天。PBMC細胞條件培養基處理神經元細胞24小時，分離細胞總DNA。對兩種線粒體DNA (16.2 kb的完整mtDNA，或0.2 kb的短mtDNA，用於歸一化;上板)和β-珠蛋白核DNA (nDNA)片段(下板)。mtDNA和核DNA損傷被計算並顯示為相對擴增和病變/10 kb(右麵板)。對照培養物在含有魚藤酮的培養基中培養，魚藤酮是一種導致mtDNA損傷的藥物。來自瓊脂糖凝膠的代表性圖像描述了17.7 kb的β-珠蛋白片段(核DNA或nDNA)的擴增減少(下圖)和16.2 kb的線粒體片段(上圖)。相對放大的減小用圖表表示。數據用至少兩個生物實驗的平均值±CD表示，其中每個實驗對三個重複的線粒體(mtDNA)或核DNA (nDNA)進行pcr。*表示處理和未處理樣本之間的差異有統計學意義(p<0.05)。
B)感染HIV-1或熱滅活HIV-1的人PBMC細胞的mtDNA損傷，持續5天。數據表示為平均值±SD (n=6)的兩個獨立實驗的三個副本。p24 ELISA檢測感染HIV-1 JR-FL株的PBMC細胞，顯示有效感染。對3個樣本進行ELISA檢測，用Student’s t檢驗計算p值。*表示感染和未感染樣本之間的差異有統計學意義(p<0.05)。
HIV-1 Tat和vpr誘導的人原代神經元細胞線粒體DNA損傷
皮質神經元轉染pECFP或pECFP- tat(圖2A)或Vpr(圖2B) 48小時。對線粒體DNA(上圖)和nDNA的核β-珠蛋白片段(下圖)進行QPCR。mtDNA和nDNA qPCR結果(相對擴增，在倍數變化中)與對照進行比較。我們證明HIV-1 Tat和Vpr蛋白都會導致mtDNA損傷。為了定位Tat內的響應區域，一係列Tat缺失突變體被用於轉染反應(圖2C)。左圖顯示了含有或不含有47-57個氨基酸區域的蛋白質轉導域(PTD)或強核定位信號(NLS)的Tat缺失突變體的圖形表示，右圖顯示了每種突變體的細胞外觀。我們的研究結果表明，沒有PTD的Tat缺失突變體定位在轉染細胞的細胞質中，而所有帶有PTD的肽都可以在細胞核中檢測到。對每個Tat缺失突變體進行mtDNA損傷、核DNA損傷、SOD和ROS檢測，結果如圖2D所示。下麵的表格總結了所有樣本的數據。在魚藤酮處理或轉染全長Tat、Tat(1-67)、Tat(67-86)和Tat(47-86)的樣品中檢測到高水平的mtDNA損傷。 Less nuclear DNA damage was observed in cells expressing the same Tat deletion mutants, while SOD activity was negatively correlated with mtDNA damage, and more mtDNA damage was found in cells, less SOD was detected.
有趣的是，並不是所有引起mtDNA損傷增加的突變體都對SOD的抑製負責，因此Tat突變體(47-86)對SOD活性的影響較小，而引起mtDNA損傷，這表明不僅是PTD, Tat內部的其他區域也可能對SOD失活起重要作用。至於ROS，全長Tat和Tat(27-86)和Tat(47-86)對mtDNA損傷和ROS均有較強的影響，而Tat(27-86)令人驚訝的是沒有引起mtDNA損傷，但對ROS的積累有負麵影響。我們認為全長Tat對mtDNA損傷的激活、ROS積累和抑製SOD活性都很重要，而所有其他缺失突變體在這兩種事件中都有部分影響。
圖2 a - c:HIV-1 Tat和vpr誘導的人原代神經元細胞線粒體DNA損傷。皮質神經元轉染pECFP或pECFP- tat(一)或衝程體積(B)48小時。提取細胞總DNA。對線粒體(上條)和核β-珠蛋白片段(下條)進行QPCR。將mtDNA和核qPCR結果(在折疊變化中)與對照進行比較。數據代表使用三個樣本的兩個獨立實驗的平均值)。*表示感染和未感染樣本之間的差異有統計學意義(p<0.05)。C)用Tat缺失突變體轉染神經元細胞，以確定mtDNA損傷誘導中的Tat響應區。Tat結構域和刪除突變體的圖形表示(上麵板)。轉染細胞中每個Tat缺失突變體的細胞定位顯示在每個Tat突變體的右側。
圖2:D)在mtDNA損傷誘導試驗中研究Tat缺失變異，以及SOD和ROS活性。表彙總數據顯示在底部。
重組HIV-1 Tat肽或腺病毒Vpr誘導人原代神經元細胞線粒體DNA損傷
皮質神經元與重組全長Tat(101個氨基酸)或熱滅活Tat(圖3A)或腺病毒Vpr(圖3B)孵育48小時。分離總基因組DNA，對mtDNA(上條)和核β-珠蛋白片段(下條)進行qPCR。將mtDNA和核qPCR結果與對照進行比較。圖中顯示Tat處理誘導了較強的nDNA損傷，而mtDNA損傷較少。其次，與對照組(腺缺失處理的細胞)相比，用Vpr培養的細胞的線粒體和核DNA損傷都很高。我們的數據表明，無論是通過轉染，還是通過轉導，Tat導致神經元細胞中的mtDNA損傷。此前，我們證實超純Tat蛋白或短PTD-Tat(47-57個氨基酸)早在處理40分鍾後就進入神經元細胞或細胞核[37,38]。我們和其他研究組研究了Tat蛋白的特征和特性，以實現高效的轉導，並避免在運輸到細胞核之前發生降解或裂解[39-43]。
圖3:重組HIV-1 Tat肽或腺病毒VPR誘導人原代神經元細胞線粒體DNA損傷。用重組Tat或熱滅活Tat孵育皮質神經元(一)和adenoviral衝程體積(B)48小時。提取細胞總DNA，對線粒體(上條)和核β-珠蛋白片段(下條)進行QPCR。將mtDNA和核qPCR結果(在折疊變化中)與對照進行比較。數據代表兩個獨立實驗的平均值(每個樣本重複三次)。分析圖顯示，與對照相比，Tat誘導核DNA損傷，而線粒體DNA損傷明顯較低，但與對照組(腺缺失處理細胞)相比，VPR培養細胞的線粒體和核DNA損傷都更高。
孵育試驗中Tat和魚藤酮劑量的滴定
用幾種濃度的Tat (0.5 ~ 50 ng/mL)處理神經元細胞，以找出在人原代神經元細胞中引起mtDNA損傷或抑製SOD活性的最低和最佳Tat濃度(圖4A)。魚藤酮也誘導mtDNA損傷，作為陽性對照，導致mtDNA損傷(圖4B)。皮質神經元與不同濃度的魚藤酮(20 ~ 500 nM)孵育，如指定的。提取全基因組DNA，對線粒體和核基因產物進行qPCR。我們發現，盡管較低濃度的Tat也會導致mtDNA損傷，但對mtDNA損傷有強烈影響的Tat的最佳濃度為50 ng/mL，在孵育研究中為3.6 nM。
圖4:與Tat肽或魚藤酮滴定劑量，mtDNA損傷和SOD活性。Tat 101 FL肽濃度從0.5到50 ng或0.036到3.6 nM增加可誘導人原代神經元細胞線粒體DNA損傷(一)或通過指定的不同濃度的魚藤酮(20至500 nM)作為陽性對照(B)．皮質神經元與不同濃度的Tat和魚藤酮孵育，分離細胞總DNA，對線粒體和核片段進行QPCR。圖中顯示了mtDNA損傷、SOD活性在A區，以及mtDNA損傷和核DNA損傷在B區。
用Tat和魚藤酮滴定孵育時間和回收率測定
用50 ng/mL (3.6 nM) Tat在不同孵育時間(0 ~ 48小時)處理神經元細胞，以找出Tat對人原代神經元細胞mtDNA或核DNA造成損傷的最佳時間(圖5A)，或抑製SOD活性(圖5B)。Tat孵育16小時被證明是檢測到mtDNA最初強烈損傷的時間點。Tat孵育6小時是檢測SOD活性初始下降的時間品脫。20 nM魚藤酮孵育2、16或48小時也可誘導mtDNA損傷(圖5C)。皮質神經元與魚藤酮(20 nM)在不同的孵育時間孵育，如指定的。提取總基因組DNA，對線粒體基因產物進行qPCR(上圖)。由於魚藤酮培養48小時是mtDNA損傷最強的最佳時間點(圖5C，頂部麵板，欄2)，我們接下來進行恢複試驗，通過去除含有魚藤酮的培養基，並在新鮮培養基中培養細胞24和48小時。該試驗將使我們能夠測量魚藤酮治療後48小時內發生的線粒體DNA損傷是否可以修複，如果可以，線粒體DNA恢複需要多長時間或多長時間(圖5C，底部)。mtDNA損傷測量數據表明，在新鮮培養基中孵育24小時後，mtDNA的相對擴增量從0.6增加到0.7，這表明在魚藤酮孵育48小時後，用新鮮培養基替換含有魚藤酮的培養基24小時後，mtDNA損傷仍然可以修複。此外，在接下來的24小時(共48小時)後，mtDNA損傷仍在修複，相對擴增達到0.75，而之前為0.6，或0.7。
圖5:用Tat肽或魚藤酮滴定孵育時間，並測定回收率。Tat肽在不同孵育時間(A、B)或魚藤酮(C)誘導的人原代神經元細胞線粒體DNA損傷
一)皮層神經元與Tat在不同的孵育時間(0到48小時)孵育，如指定的。提取細胞總DNA，對線粒體和核基因進行QPCR。mtDNA和nDNA損傷的結果顯示在右邊的麵板中。
B)Tat處理相同時間點(0 ~ 48小時)神經元中SOD活性。
C)魚藤酮處理細胞在0 ~ 48小時不同時間點引起的神經元mtDNA損傷(上圖)。魚藤酮引起mtDNA損傷的恢複測定在魚藤酮去除24至48小時(處理24小時後用新鮮培養基更換)後進行，如圖所示。
HIV-1 Tat異常調節人類神經元線粒體能量代謝
為了研究Tat對mtDNA損傷和SOD活性是否影響線粒體功能，我們使用線粒體能量代謝陣列和qRT-PCR研究了線粒體生物能學。該序列包括84個基因，代表所有5個線粒體複合體(I到V)(圖6A，右麵板)。用瓊脂糖凝膠電泳對qRT-PCR產物進行可視化，凝膠圖像見右圖。雖然在Tat處理的細胞中，代表所有複合體的幾個基因被上調或下調，但我們尤其感興趣的是ATP5A1基因，該基因的表達在Tat存在時被強烈抑製(圖6A，方框中)。為了進一步證實ATP基因表達的變化，我們使用ATP-熒光素酶法在Tat處理的神經元中進行ATP測定(圖6B)。在Tat或魚藤酮處理的細胞中，ATP水平均顯著下降(欄3和欄4)。由於mtDNA損傷的積累和ros誘導的mtDNA損傷與8-oxoguanineDNAglycosylase-1(OGG1)是一種可以修複8-oxoG DNA損傷的酶，我們還通過qRT-PCR分析了tat處理的神經元細胞(左圖)或tat轉染的細胞(右圖)中OGG1基因的表達(圖6C)。我們的數據表明Tat可抑製OGG1基因表達(70%或60% a)，從而幹擾mtDNA損傷修複機製。
圖6:Tat對人神經元線粒體能量代謝的影響。
一)利用線粒體能量代謝陣列對參與線粒體生物能學的基因進行qRT-PCR分析。下麵的表格顯示了代表所有五個複合體(I到V)的基因。
B)為了證實ATP基因表達的變化，對Tat處理的神經元進行ATP測定。用Tat、熱滅活Tat (h.i.)或魚藤酮處理人初級神經元48小時。將線粒體顆粒在RIPA緩衝液中裂解，然後用ATP-熒光素酶法分析裂解物的ATP水平。Tat和魚藤酮處理的細胞中ATP水平均顯著降低。星號表示處理和未處理樣本之間的差異有統計學意義(p<0.05)。數據為平均值±標準差(n=6);*-p=0.05， **-p= 0.01， ***-p=0.001。
C)用Tat處理神經元細胞(左圖)或用Tat表達質粒轉染細胞(右圖)會抑製mtDNA損傷修複8-oxoguanine DNA糖基化酶-1 (OGG1)的基因表達，OGG1是一種可以修複8-oxoG DNA損傷的酶。我們的數據表明Tat可抑製OGG1基因表達(70%或60% a)，從而幹擾mtDNA損傷修複機製。
Tat增加了人類神經元中凋亡蛋白的水平
為了研究Tat誘導的mtDNA損傷和線粒體生物能學是否影響神經元細胞線粒體的凋亡事件，我們對Tat處理的神經元細胞裂解液中的凋亡蛋白、pten誘導激酶1 (PINK1)和丙酮酸激酶M2 (PKM2)蛋白進行了q-western blot檢測(圖7)。細胞質和核部分顯示，Tat處理的神經元細胞線粒體部分中PINK1水平增加(圖7A, lane 2)，提示在神經元細胞中存在Tat時，線粒體損傷增加。包括Bax和Bad在內的一些凋亡蛋白在線粒體部分也顯示增加(圖7B)。相反，其他兩種蛋白，外膜VDAC和細胞色素C在線粒體部分減少(圖7B, lane 3)，而Tat處理細胞的細胞質部分細胞色素C明顯增加(圖7B, panel 4, lane 6)。除了線粒體DNA損傷和凋亡蛋白的激活，Tat處理導致神經元細胞損傷和細胞丟失(圖7C)。
圖7:Tat可增加凋亡蛋白的水平，並調節線粒體蛋白的細胞定位失調。
一)定量western blot檢測Tat處理神經元細胞裂解液中的PINK1和PKM蛋白。PINK1和PKM位於受損線粒體膜的較高水平。細胞分離使用線粒體分離試劑盒分離線粒體、細胞質和核組分。COX IV作為線粒體片段對照;Grb2和Tubulin作為細胞質組分純度和負載對照，Lamin a作為核組分對照。
B)轉染神經元中Tat的表達激活凋亡的Bax和Bad，抑製線粒體部分外膜VDAC，導致凋亡的細胞色素C從線粒體轉位到細胞質。
C)有或沒有Tat的神經元細胞圖像。
我們的數據表明，Tat在線粒體DNA損傷、線粒體能量代謝變化和神經元凋亡中具有重要作用。這是首次觀察到HIV-Tat誘導人類神經元線粒體DNA損傷。
討論和結論
在這項研究中，我們展示了HIV-1和HIV-1蛋白對初級人類神經元培養中mtDNA損傷的影響，這在皮質神經元和PBMC中都可見到。我們的神經元係統為研究HIV-1或HIV-1蛋白影響的線粒體DNA損傷提供了一個理想的模型，具有進一步翻譯研究的潛力。首先，我們證明了使用從感染hiv的PBMC細胞中收集的條件培養基可以導致人類神經元的mtDNA損傷。條件培養基含有HIV-1蛋白和其他活性分子，包括對神經元細胞有毒性作用的促炎細胞因子和趨化因子。因此，包括Tat和Vpr在內的這些分泌蛋白可被轉導到神經元細胞中，並對mtDNA損傷和神經元凋亡產生影響。
到目前為止，關於HIV-1感染過程中神經元mtDNA的知識還不多。一些研究表明Tat對線粒體生物能學有影響，盡管尚未在人類神經元中證實線粒體DNA損傷。最近有報道稱HIV-1或Tat對PBMC線粒體dna水平和線粒體功能的影響[22,44]。Tat對心肌細胞[23]線粒體生物能學的影響被證實。此外，Tat對Jurkat細胞[22]線粒體基因和DNA的影響也顯示出來。其他研究則討論了Tat通過線粒體ROS生成[10]對人外周血b淋巴細胞DNA損傷的影響。結果表明，Tat可誘導人肝髒和心髒[24]線粒體膜通透。因此，未證明Tat或HIV-1感染對人類神經元mtDNA損傷有直接影響。我們的目的是研究Tat對人類神經元線粒體DNA損傷的影響，這是神經hiv和AIDS神經退行性變和神經並發症的潛在事件之一。凋亡和線粒體蛋白的研究，包括PINK1和PKM2，對確認線粒體損傷也很重要。 PINK1, a mitochondrial kinase that protects cells from stress-induced mitochondrial dysfunction, is known to be translocated to the damaged mitochondria in the complex with Parkin, and accumulated at higher levels at the membranes of mitochondria during injury [4,11,45] while mitochondrial PKM2 can regulate oxidative stress-induced apoptosis [46]. Further studies were necessary to investigate neuronal mtDNA damage during infection, to uncover the role of HIV and HIV-1 proteins, Tat or Vpr on mtDNA damage and mitochondrial bioenergetics. To answer this question, we used human primary neuronal culture model and human PBMC to study mtDNA damage during HIV-1 infection, or caused by HIV Tat and Vpr proteins.
因此，我們證明了人類神經元線粒體DNA損傷的新發現。在我們未來的研究中，研究Tat是否能直接損傷mtDNA也很重要在體外，而其他線粒體蛋白不會幹擾HIV-Tat蛋白活性。這些研究共同為HIV-1感染造成的神經功能缺損的治療方法的設計鋪平了道路。
的利益衝突
作者聲明沒有競爭的經濟利益。
確認
我們要感謝哈利利博士的支持和富有洞察力的討論。這項工作得到了NIH對Shohreh Amini博士的資助，以及賓夕法尼亞州國務院對Nune Darbinian博士的資助(項目10:420491-04400-02)。
