摘要

作品簡介:新型植物DING蛋白(全長38kda p38SJ和27kda p27SJ)具有磷酸酶活性並調節HIV-1基因轉錄。之前，我們證明了DING通過去磷酸化和失活CTD RNA聚合酶II來調節HIV-1基因的轉錄，CTD RNA聚合酶II是HIV-1長末端重複序列(LTR)的主要延長因子。由於HIV-1的轉錄受多種病毒和細胞因子的控製，包括NF-κB的p65/p50亞基，我們推測除了RNA聚合酶II (RNAPII)的c端結構域(CTD)外，DING磷酸化酶也可以影響p65 NF-κB的磷酸化和活性，從而抑製HIV-1基因的轉錄，抑製HIV-1感染。

方法:在這裏，我們描述了DING蛋白對HIV-1感染和p65/p50 NF-κB磷酸化的抑製作用，使用pTet-on誘導係統，通過ELISA、northern-blot、western-blot、細胞分離和DING表達細胞的啟動子-報告子分析。

結果:通過p24 ELISA和northern blot檢測，HIV-1感染檢測結果顯示DING蛋白對HIV-1和HIV-LTR RNA表達有很強的抑製作用。western blot和細胞分離實驗結果表明，丁丁表達細胞中p65 NF-κB亞磷酸化形式的水平增加。p65/p50的核組分和胞質組分都受到DING磷酸酶的影響，但在DING存在時胞質中p65 NF-κB的積累更多，這表明活性NF-κB的後續激活和核輸入受到DING的影響。在表達ding的細胞中，p65核的主要部分被去磷酸化。啟動子-報告子實驗表明，丁丁介導的NF-κB p65去磷酸化和失調導致其與HIV-1 LTR結合的抑製，並導致p65介導的LTR轉錄激活的抑製。對受DING影響的LTR內區域的圖譜顯示，NF-κB和CTD RNA聚合酶II的結合位點都很重要，這些細胞因子的協同作用在DING作用下減弱。此外，對DING-p38SJ中影響LTR轉錄的區域進行測繪，發現磷酸結合域對這種抑製活性至關重要。

結論:我們演示了叮磷酸酶的影響hiv - 1感染,磷酸化p65 NF -κB,和轉錄HIV1 LTR。我們的研究表明,一個可能的機製丁可以控製hiv - 1表達的LTR可以通過調節異常轉錄因子NF -κB p65通過阻止其磷酸化和易位hiv - 1 LTR細胞核和綁定,一個動作,可能導致丁p38SJ作為抗病毒劑的效用。重要的是，丁醇在p65 NF-κB增加的情況下，不僅可以抑製HIV-1 LTR基因的轉錄，還可以抑製HIV-1感染。DING蛋白改善了已知的抗逆轉錄病毒藥物替諾福韋(TFV)和恩曲他濱(FTS)對HIV-1的抑製作用，因為在與這些藥物聯合使用時;當DNG與這些藥物聯合使用時，其對HIV-1的抑製明顯高於對照組或未使用丁丁的病例。因此，我們的數據支持使用神經保護蛋白作為新的治療性抗病毒藥物，通過幹擾NF-κB的功能抑製HIV-1 LTR轉錄。

關鍵字

丁;hiv - 1;答;p65;p50;NF -κB

簡介

DING蛋白(p27SJ和p38SJ)是植物磷酸酶，分離自貫葉連翹[1,2]。這些DING蛋白與神經保護[3,4]、細胞增殖[5,6]和抑製HIV-1[1,2,7]有關。DING p27SJ和p38SJ屬於DING家族蛋白，具有保守的DING n端區域。DING蛋白從動物、植物和原核生物中分離得到，部分蛋白具有磷酸酶或磷酸酶結合蛋白[8]的特征。真核生物DING蛋白在HIV-1 LTR轉錄中的作用已被深入研究[9-17]。最近研究發現，來自不同物種的DING蛋白具有相似的序列和結構同源性，並抑製HIV-1 LTR轉錄[18]。在之前的研究中，我們發現通過抑製絲裂原激活蛋白激酶Erk1/2的磷酸化，DING p27SJ可以抑製其底物Stat3的磷酸化[5,6]。研究表明，在人類HIV-1感染過程中，控製促炎基因表達的NF-κB被激活[19-22]。在PMA存在的情況下，HIV-1 Tat蛋白也可以通過阻斷NF-κB複合物[23]與抑製劑IκB-α阻滯劑的結合來激活NF-κB。此外，Tat蛋白可與白細胞介素-6 (IL-6) RNA結合，或與CAAT增強物結合蛋白β (C-EBPβ)轉錄因子相互作用，增加IL-6基因[24]的表達。 HIV Tat can interact with p65 NF-κB and increase its DNA-binding and transcriptional activity. Interaction of Tat with p65 and IκB-α can lead to NF-κB activation, and this mechanism can contribute to the dysregulation of the cellular response by HIV-1. The transcription of inflammatory response genes is regulated by NF-κB [25]. The NF-κB transcription factors include several proteins that contain Rel Homology Domain (RHD), such as RelA/p65, c-Rel, RelB, p50 and p52. RHD domain in 300-amino acid length is important for for homo- or hetero- dimerization, also for DNA-binding of NF-κB [26,27]. Dimerization is important for the transcriptional activity of NF-κB. Importantly, C-terminal transcriptional activation domains are present in p65 NF-κB [28]. When NF-κB associates with its inhibitors (IκB), this association affects its DNA-binding ability [29,30]. To activate NF-κB, IκB serine amino acids should be phosphorylated by the activated IκB Kinase (IKK). This causes the protein ubiquitination and degradation, and subsequent release and translocation of the functional NF-κB complex to the nucleus [31,32]. The most abundant NF-κB inhibitor is IκB-α [33-35]. I-κB is phosphorylated by IKK at serine residues, Ser32 and Ser36 [36,37]. The NF-κB activity can be further increased by PKA phosphorylation [38], or by PKCζ [39] and by IKKα [40]. NF-κB activation was shown in HIV-1-infected macrophages, monocytes, CD4 T lymphocytes and microglia [41]. Active NF-κB upregulates the expression of its responsive genes that include pro-inflammatory chemokines and cytokines [41]. Investigating the mechanisms of NF-κB or Tat inhibition could provide further insights into AIDS pathogenesis and treatment [42]. Viral HIV-1 Tat protein that interacts with the viral RNA and cellular factors can control viral replication [43-46]. To activate transcription, Tat usually binds to RNA stem-loop structures, including the HIV-1 transactivation-responsive element within the viral LTR. It alsointeracts with somecellular transcriptionfactors. Tat can be released from infected cells and bind to integrins to dysregulate the cell signaling [49], or to chemokine receptors [50,51]. Tat increases the p65 transcriptional activity and modulates other proteins that regulate NF-κB signaling. When Tat binds to IκB-α, it is translocated to the nucleus [52,53]. It is important to uncover mechanisms of the NF-κB suppression during HIV-1 infection, and to discover new agents that can efficiently inactivate NF-κB and HIV-1 transcription. Previously we demonstrated that DING p27SJ/p38SJ can suppress HIV-1 gene transcription through its interaction with HIV-1 Tat [1,7]. Further, we showed that DING p27SJ and p38SJ exhibit phosphatase activity [5]. Thus, here we investigated the possibility that DING proteins p27SJ and p38SJ can act通過p65 NFκB轉錄激活子的去磷酸化作用。在本研究中，我們報道了DING蛋白可以通過直接降低p65的亞磷酸化來抑製細胞內HIV-1感染和NF-κB複合體的激活，並下調LTR基因的轉錄活性。

材料和方法

HIV-1感染外周血單個核細胞

從Ficoll-Hypaque分離後的粗皮中製備純化的PBMC，並在用植物血球凝集素(PHA)處理後，保持在含10% (v/v)人重組IL-2 (20iu /ml)胎牛血清(FBS)的改良RPMI培養基中;5μg / ml;PBMC被HIV-1 JRFL株感染48小時。每10克加入50克含p24的病毒原液⁶細胞。細胞與病毒液一起在37°C的少量無血清培養基中孵育2小時。細胞用PBS衝洗兩次，然後加入新鮮培養基。在感染細胞之前，用DING表達質粒轉染細胞或用50或250 ng的DING p38SJ處理細胞。每3天收集裂解液2 μl。同時，對照組未感染的細胞或在65°C加熱滅活HIV-1 10分鍾感染的細胞，製備6天的陽性HIV-1感染。收集細胞和上清，用ELISA、MTT和毒性試驗進行分析，如下所示。如上所述，用嗜單核/嗜巨噬細胞SF162 HIV-1株感染PBMC細胞，裂解物用於p24 ELISA(感染效率約為200 ng/ml p24)。

U97先轉染丁p38sj表達質粒，轉染24h後轉染SF-162 HIV-1株，感染5d後分析T細胞感染後第7天進行分析。單核細胞而且U1細胞被SF-162(約300 pg/ml和15,000 pg相應的p24)感染。

用抗逆轉錄病毒藥物治療人胎兒小膠質細胞

將小膠質細胞置於60 mm(20萬細胞)培養皿中，轉染DING p38SJ、DING p27SJ或pCDNA6對照質粒。轉染48小時後，細胞被HIV-1 SF162株(0.25 pg的p24/細胞)感染4小時。添加更多的培養基進行過夜培養。第二天，用PBS衝洗細胞3次，加入新鮮培養基，分別用10 μM的替諾福韋(TFV)和恩曲他濱(FTC)抗病毒藥物單獨或聯合孵育細胞。56小時後，重複處理，然後收集上清並添加新鮮培養基，根據製造商的方案(先進生物科學實驗室，Rockville, MD)進行p24 ELISA檢測。

p24 ELISA

約1 × 10⁶PBMC感染HIV-1 JF-RL或SF-162株。感染後6 - 7天，收集上清液，用p24 ELISA檢測試劑盒(先進生物科學實驗室，Rockville, MD)分析是否存在HIV-1 p24。在450nm比色法測定樣品中Gag-p24的濃度。在三個重複中檢測HIV1 p24的濃度。根據HIV1 p24標準曲線計算數據並歸一化樣本稀釋。數值用圖表表示(平均值±標準差，n=9)。每次感染至少重複3次，每個樣本重複3次。

細胞培養

采用多西環素處理下表達丁p27SJ的U-87 MG誘導細胞係進行western blot研究。轉染效率高的U-87 MG膠質母細胞瘤星形細胞瘤細胞購自美國類型培養收集公司(ATCC, Manassas, VA)。細胞在含10%胎牛血清(Life Technologies, Inc.)、100單位/ml青黴素和10 μg/ml鏈黴素的DMEM中37°C培養。U-87 MG的DING-p27SJ誘導細胞係是基於pTetOn係統(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)創建的，正如我們之前所描述的[1]。1 mg/ml多西環素(Dox)處理細胞48 h誘導DING-p27SJ表達。

質粒

HIV-LTR(-476/+66)通過PCR擴增並連接成HindIII-KpnIpGL3載體站點(Promega公司，麥迪遜，WI)[1]。CFP-tat質粒通過插入aBamHI-EcoRI tat片段從CMV-tat進入BglII-EcoRIpECFP-C1質粒[1]。我們通過DNA測序驗證了質粒的序列。寡核苷酸由Oligos等(Wilsonville OR)製作。

全長丁丁p38SJ cDNA的克隆

采用RT-PCR和從已知的DING p27SJ序列設計的正向引物和從假單胞菌DING基因設計的反向引物克隆出了DING p38SJ。結合2個片段(1-788和788-1179)，構建全長cDNA，編碼38 kDa DING p38SJ(364個氨基酸，GenBank #: AAW57408.2)。將DING p38SJ cDNA克隆到pcDNA6表達載體(Invitrogen)[2]中。

轉染

根據製造商的建議，Lipofectamine 2000用於瞬時轉染實驗，使用U-87 MG細胞。簡而言之，2 × 10⁵用0.5 μg hiv - ltr -熒光素酶報告質粒轉染60 mm平板細胞，加或不加1 μg DING-p38SJ及其缺失突變體CFP-Tat或pECFP-p65。實驗用啟動子、pCMV或pECFP-C1質粒進行控製，以平衡每個樣品中的DNA量。轉染後36小時收集細胞提取物，轉染後36小時收集細胞提取物，用於熒光素酶測定。樣品在三份中被測定。

RNA製備

RNA從U-87 MG細胞或原代小膠質細胞中分離，轉染DING p27SJ並感染HIV-1，使用RNAqueous®總RNA分離試劑盒(Ambion, Austin, TX, USA)。用1 μg RNA與逆轉錄酶(Roche Molecular Biochemicals, IN)生成cDNA。cDNA進行28次PCR擴增TaqDNA聚合酶。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行DNA凝膠電泳。

rt - pcr

在RT-PCR檢測中，一步RT-PCR係統(SuperScript III with PlatinumTaq， Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。為了擴增p65 cDNA，采用p65基因特異性引物和三步循環:1)55°C預變性30分鍾;2) PCR擴增40次，時長15秒，94℃變性，60℃退火30秒，68℃延伸1分鍾;3)最後在68°C下伸展5分鍾。PCR產物0.8 kb和0.2 kb DNA在1.5%瓊脂糖凝膠中進行DNA凝膠電泳。

北部汙點分析

從原代小膠質細胞中分離10µg的總RNA，在1.2%瓊脂糖凝膠和0.4%甲醛，1 × morpholinepropan磺酸(Mops)上進行電泳分析。如前所述，RNA被轉移到Hybond-N尼龍膜(Amersham, Piscataway, NJ)[7,54]。為了檢測HIV-1 LTR和DING p27SJ rna，將膜與[32P]標記的LTR DNA探針或DING p27SJ探針雜交(800 bp)。為了檢測GAPDH RNA，用pcr擴增和[32P]標記的GAPDH RNA(一種用作內部控製片段的管家基因)探測過濾器。使用隨機引物DNA標記試劑盒(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)製備放射性標記DNA探針。使用MicroSpin™G-50色譜柱(Amersham)去除未結合的放射性核苷酸。管家基因GAPDH作為內控基因。

細胞治療和轉染

如前所述，對於轉染試驗，2 × 10⁵細胞在6 ×孔板中培養24小時。然後，為了刺激p65 NF-κB，細胞在FBS無培養基中保存2小時，然後PMA (10 nM)處理2小時。

蛋白質提取物的製備

用冷PBS洗滌細胞並在裂解緩衝液(Sigma)中培養，製備細胞裂解液。4℃離心5分鍾後，去除細胞碎片，50微克蛋白裂解物與Laemmli樣品緩衝液在95℃加熱10分鍾，然後用10% SDS-PAGE分離。

核和細胞質提取

使用NE-PER試劑盒(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)進行細胞分離實驗，分離細胞核和細胞質蛋白部分。細胞裂解在NE‐PER裂解緩衝液中添加蛋白酶抑製劑雞尾酒(Halt;皮爾斯生物技術)。蛋白濃度采用Bradford法(Bio-Rad)測定，10 μg核蛋白裂解物和20 μg細胞質蛋白裂解物采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAAG)電泳(SDS-PAGE)(4%-20%梯度凝膠;Bio-Rad)。

免疫印跡分析

蛋白質樣品以40 mamp轉移到負載的硝化纖維素膜上。詳細的程序在前麵[1]中有描述。為了可視化蛋白質，使用了增強型化學發光檢測係統ECL+ (GE Healthcare, Piscataway NJ)。圖1-4所示的Grb2水平和圖5所示的Grb2和Lamin A作為凝膠加載控製。

抗體

抗ding p27SJ和抗p38sj(兔多克隆抗體)由Lampire生物實驗室公司(Pipersville, PA)生產和購買。抗p65 (F-6)、Grb2和Lamin A抗體來自Santa Cruz生物技術公司(Santa Cruz, CA)。CFP-Tat(活色)抗體來自BD Biosciences Clontech。使用Living Colors單克隆抗體(BD Biosciences Clontech)確認yfp融合蛋白的表達。抗yc-tag單克隆抗體從Invitrogen公司獲得。

熒光素酶報告實驗

在不表達Tat、p65 NF-κB質粒或不表達質粒的情況下，轉染U-87 MG誘導細胞，然後與多西環素孵育24小時，獲得DING p27SJ的表達。根據製造商的建議，使用Dual-GloTM熒光素酶測定係統(Promega)對每種反應進行等量的熒光素酶活性測定。所有報告物測定對每個樣品至少重複3次。相對熒光素酶單位轉換為折疊活性，並以圖形表示。發光記錄在特納設計發光計TD-20/20 (Promega)上。數據分析采用Excel軟件。

Methylthiazoletetrazolium (MTT)測定

對於MTT細胞增殖試驗，我們使用了小膠質細胞和MTT試劑盒(Roche, Basel, Switzerland)。細胞在96孔板上複製三份，分成三組，密度為15,000個細胞/孔。細胞轉染DING p27SJ。轉染24 h後，孔中加入10 μl MTT (5 mg/ml)(終濃度0.5 mg/ml)，靜置4 h，加入100 μl增溶液停止反應。具有活性線粒體的活細胞將四唑環裂解成可見的深藍色福馬讚反應產物，在570 nm和650 nm的參考波長下，用分光光度法在微板閱讀器中定量。每個樣本的相對細胞活力(對照的%)被確定為轉染細胞的平均吸光度與未轉染或轉染空載體細胞的平均吸光度之比。

的CellTiter-Glo^™發光細胞活力測定

這種檢測需要ATP，一種熒光素酶反應的輔助因子，作為代謝活性細胞的指標。由於熒光素酶反應需要ATP，產生的發光與ATP的存在量成正比，ATP是細胞代謝活性的一個指標。為了進行檢測，加入與細胞被電鍍的培養基等量的CellTiter-Glo™試劑(Promega, Madison, WI, USA)。經過2分鍾的混合和10分鍾的孵育後，使用標有特納設計發光計TD-20/20 (Promega)的板測量發射的發光。數據分析采用Excel軟件。

統計分析

使用SPSS (IBM公司，2017年發布)，IBM SPSS Statistics for Windows, 25.0版本進行統計分析。阿蒙克，紐約州)、EXCEL和ImageJ。使用學生t檢驗和Bonferroni校正對相關的多次比較進行平均值比較。統計學意義為p<0.05。數據導出至Microsoft EXCEL進行進一步統計分析。

p值的計算基於對每個對照組中每個樣本的三個重複值(歸一化到內部控製)的Student’s t檢驗，以及3個重複實驗中的2-3個試驗組的比較。所使用的p值計算是基於參數、未配對、雙樣本等方差、雙尾分布的一種科學文獻中廣泛接受的方法。每次兩兩比較中的兩組都必須包含至少3個樣本，以便軟件計算該比較的p值。

結果

本研究旨在揭示丁丁p27SJ和丁丁p38SJ通過去磷酸化和失活p65、強迫p65轉位到細胞質、抑製p65與HIV-1 LTR結合等途徑抑製HIV-1的機製。

丁p27SJ和丁p38SJ抑製HIV-1感染

為了研究DING蛋白是否抑製HIV-1在幾種人類細胞類型中的複製，我們使用PBMC、U937(少數仍表達許多單核細胞樣特征的人類細胞係之一)、原代小膠質細胞、t細胞、單核細胞和U1促單核細胞細胞對兩種HIV-1毒株JR-FL和uf -162的感染進行了綜合感染測定(圖1)。在感染HIV-1之前，U937和t細胞首先被全長的DING p38SJ轉染。在感染後第5天或第7天，丁丁在U937和t細胞中強烈抑製HIV-1感染，HIV-p24水平證實了這一點(圖1A)。當使用生物相關濃度與DING p38SJ一起培養時，我們發現在單核細胞和單核細胞前(U1)細胞中對HIV-1複製有類似的抑製作用。用50 ng/ml的DING蛋白處理細胞會對U1產生高達50%的抑製，而用200 ng/ml處理細胞會對U1產生高達80%的抑製，對單核細胞產生高達50%的抑製，如圖1B所示。在用兩種濃度的DING蛋白處理的PBMC中，也觀察到DING p38SJ抑製HIV-1(圖1C)。兩個獨立重複實驗的結果顯示在圖1C的底部。DING p27SJ也能抑製小膠質細胞中的HIV-1 SF-162株(圖1D)。與僅轉染空質粒的細胞相比，表達DING的感染原代小膠質細胞中的HIV-LTR RNA表達受到抑製，通過北方印跡試驗(圖1D，左圖)和密度測定法(右上圖)顯示，LTR的抑製達到70%。

圖1:丁醇抑製HIV-1的感染和複製。
ELISA法測定丁p38SJ和丁p27SJ對U937和t細胞(A)、單核細胞和U1細胞(B)以及PBMC (C)中HIV-1的抑製作用。在兩個獨立的實驗中，用嗜單核/嗜巨噬細胞SF162 HIV-1菌株感染PBMC細胞，測量三倍的HIV-1 p24濃度，從HIV-1 p24標準曲線插值，並對樣品稀釋進行校正。數值用圖表表示(平均值±標準差，n=3)

圖1:丁醇抑製HIV-1的感染和複製。
(D)丁丁對小膠質細胞HIV-1感染的抑製作用。丁p27SJ抑製人類胎兒小膠質細胞中的HIV-1 SF-162，通過北方印跡分析(左圖)顯示。用丁p27SJ質粒轉染原代人小膠質細胞，然後感染HIV-1 SF162株。5天後，從HIV-1感染細胞中製備總RNA，並使用來自HIV-1基因組、DING p27SJ和家務GAPDH(左圖)的DNA探針進行northern blot分析。在變性甲醛-瓊脂糖凝膠上分離總RNA，並與標記的LTR、DING p27SJ和GAPDH探針雜交。RNA製備的完整性顯示在底部的麵板上。18S和28S rna在凝膠中的位置被標明。通過密度法分析條帶(右上圖)，顯示LTR抑製高達70%。DING p27SJ對p65 NF-κB基因轉錄和延伸的影響(右下圖)。在CMV啟動子控製下，攜帶p65基因與yfp基因融合的質粒的示意圖，用於轉錄延伸研究，如上圖所示。RT-PCR延伸檢測所用引物的位置指定為兩個擴增子的位置。 Inhibitory effect of DING on p65 and YFP transcription/elongation was studied in RT-PCR assays for two amplicons. The image of the ethidium bromide-stained gel was inverted using Adobe Photoshop for clarity of presentation. The longer is transcript (compare lane 3 with lane 1) and the further is a primer from transcription initiation start, the stronger is inhibitory effect of DING on elongation of the transcript (compare lanes 4 and 3, with 2 and 1). Bottom panel demonstrates a graphical representation of the elongation assay as bars (bottom panel). Level of yfp-p65 RNA expression and integrity and accuracy of RNA loading was examined by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining of RNA gel for RNA samples from cells without (lanes 1 to 4) or with DING (lanes 5 to 8), transfected with p65 and Tat in various combinations. The image of the gel was inverted using Adobe Photoshop for clarity of presentation.

圖1:丁丁能抑製HIV-1的感染和複製。
(E)細胞活力測定顯示轉染CMV-p27SJ或對照空載體pCDNA6的原代培養小膠質細胞中p27SJ的細胞增殖/毒性。48小時後，收集細胞，采用細胞活力GLO法(上)和MTT法(下)進行測定。結果表明，通過GLO和MTT法檢測，DING p27SJ的表達對原代培養的小膠質細胞的活力沒有太大影響。數據來自三個獨立的實驗，包含三個樣本。誤差條表示SD。(F)轉染DING p38SJ或載體pCDNA-C1的人胎兒小膠質細胞HIV-1 p24 ELISA檢測試劑盒。轉染48小時後，細胞感染HIV-1 SF162株(0.25 pg的p24/細胞)4小時，然後加入培養基孵育一夜，然後分別用10 mM的替諾福韋(TFV)和恩曲他濱(FTC)抗病毒藥物單獨或聯合治療。56 h後重複治療，進行p24 ELISA檢測。在丁p38SJ存在的情況下，HIV-1 p24水平(bar 1)從116 pg/ml下降到39.11 pg/ml (bar 2)，而兩種藥物處理的細胞p24水平下降到30.66 pg/ml (bar 3)。丁和兩種藥物處理的細胞導致p24水平從30.66 pg/ml顯著下降到16.51 pg/ml (bar 4)，表明聯合使用藥物可以有效抑製HIV-1。數據從3個獨立實驗中收集，每個樣本有3個重複。 Error bars are for SD.

因此，DING可以抑製HIV-1的複製和LTR基因的表達/轉錄。為了證明丁醇是否能抑製LTR激活因子p65-NF-κB的表達，我們進行了轉錄延伸試驗。

丁p27SJ對p65基因轉錄和延伸的影響。

采用RT-PCR方法研究丁丁對p65 NF-κB轉錄/延伸的抑製作用(圖1D，右下)。在CMV啟動子控製下，攜帶p65基因與yfp基因融合的質粒用於轉錄延伸研究的示意圖如圖所示。詳述了延伸試驗中使用的引物。凝膠中條帶的定量分析表明，DING p27SJ的抑製作用與反向引物的位置相關，如最近的引物(p65-1)有輕微的抑製作用(12%)，而更遠的引物(p65-2)有較強的抑製作用(75%)。圖表上顯示了數字。我們懷疑DING p27SJ也可以抑製YFP-p65的轉錄伸長。伸長試驗的結果表明,時間越長是成績單(比較巷3巷1)和進一步從轉錄起始開始底漆,是丁在伸長的抑製作用越強的成績單(比較車道4和3,2和1),完整性和準確性RNA的RNA加載了凝膠的細胞的RNA樣本(道5 - 8)或沒有丁(通道1到4)轉染p65和乙在各種組合。重要的是，DING蛋白對細胞沒有任何毒性作用，細胞活力GLO和MTT測定(圖1E)證明了這一點，這表明它有潛力開發成為一種安全的抑製HIV-1的治療藥物。進一步，我們比較了DING與泰諾福韋(TFV)和恩曲他濱(FTC)兩種已知抗病毒藥物對HIV-1的抑製作用，發現當與DING蛋白聯合使用時，這兩種藥物都能更有效地抑製HIV-1複製(圖1F)。在丁p38sj存在的情況下，HIV-1 p24水平從116 pg/ml (bar 1)下降到39.11 pg/ml (bar 2)，而兩種藥物治療的細胞p24水平下降到30.66 pg/ml (bar 3)。丁和兩種藥物治療的細胞導致p24水平從30.66 pg/ml顯著下降到16.51 pg/ml (bar 4)，表明聯合使用藥物可以有效抑製HIV-1。 Data were collected from 3 independent experiments with triplicates for each sample. Error bars are for SD.

接下來，我們研究了DING磷酸酶是否可以抑製p65 NF-κB轉錄因子的轉錄後修飾和磷酸化。

DING p27SJ抑製p65磷酸化。

為了研究p65 NF-κB的磷酸化是否受丁p27SJ的磷酸酶活性的影響，我們使用了在多西環素處理下表達丁的誘導細胞係——丁p27SJ誘導細胞。首先用p65和Tat表達質粒單獨或聯合轉染細胞。用多西環素或不加多西環素處理細胞誘導DING p27SJ表達，收集細胞裂解液進行western blot分析。在dox誘導的p27SJ細胞係中，研究了在Tat存在或不存在的情況下，DING蛋白對內源性或外源性p65 NF-κB功能的作用。如圖2A所示，DING蛋白的共表達影響外源性p65 NF-κB蛋白的表達水平(對比圖1A lane 3和lane 7)。DING介導的p65 NF-κB表達阻斷可以通過HIV-1 Tat蛋白的共表達緩解(圖2A, lanes 4和8)，而內源性p65 NF-κB的表達不受DING或Tat蛋白的影響(圖2A, lanes 5和6)。內源性和外源性p65 NF-κ b蛋白的磷酸化在DING存在時被阻斷，而Tat的存在無法挽救(圖2A, Lanes 5-8)。western blot檢測結果采用密度法確認(圖2B)， western blot檢測p65在細胞中的表達，使用多克隆抗p65抗體(圖2C, lane 2)， Grb2蛋白(圖2C，底部麵板)作為凝膠加載對照。波段的密度顯示在每個麵板的底部。實驗重複2次，每次計算3次。誤差圖顯示本實驗的SD結果清楚地表明，DING蛋白阻斷p65 NF-κB的磷酸化，使其生物活性降低。

圖2:DING p27SJ對p65磷酸化的抑製作用。
(一)Western blot分析表達丁p27SJ的細胞提取物，分別由多西環素(Dox+，通道5-8)和不表達丁p27SJ (Dox-，通道1-4)誘導。為了檢測表達Tat和/或DING p27SJ的細胞中p65的磷酸化情況，將外源Tat或p65 NF-κB表達質粒轉染或不轉染DING p27SJ誘導細胞。細胞提取物使用過磷酸化或總p65 NF-κB抗體(圖1-3)、Tat和DING p27SJ抗體(圖4)進行western blot。不同暴露時間的印跡圖像顯示(圖2-3)。Grb2 in用作加載控件。
(B)通過密度測定法分析了外源性和內源性過磷酸化和過磷酸化p65的水平，並顯示在%中。誤差條表示三個讀數的SD。實驗重複2次。
(C)Western blot分析經Dox處理或未處理的細胞提取物，以誘導DING p27SJ。用相關多克隆抗體進行western-blot檢測，證實p27SJ細胞內源性p65 NF-κB和DING蛋白的表達。Grb2作為加載控件。圖上的誤差條顯示了三次讀數的SD。

在DING p27SJ存在下NF-κB p50去磷酸化

圖1的印跡用抗p50抗體重新印跡。表達DING蛋白的提取物的Western-blot分析數據顯示，DING對NF-κB異二聚體中的p65夥伴p50具有類似的抑製作用(圖3，排5-8，上圖)。箭頭表示p50的亞磷酸化形式。我們發現，在表達DING的細胞中，p50和p65的磷酸化抑製模式相似，而在表達DING p27SJ的細胞中，p50的磷酸化程度更低。

圖3:丁p27SJ對NF-κB p50去磷酸化的影響。
表達DING p27SJ的提取物的western blot分析顯示，NFκB異二聚體中p50、p65夥伴的去磷酸化模式類似(列5-8，上圖)。Grb2用作加載控件(底部麵板)。雙箭頭(上麵板)顯示p50高度磷酸化和低磷酸化。底圖顯示了亞磷酸化p50的密度測定。誤差條表示三個讀數的SD。

丁丁對NF-κB複合體的失活與I-κB無關

NF-κB二聚體的p50/p65亞基在與I-κBα蛋白的複合物中在細胞質中分離，細胞激活後，p50/p65 NF-κB從複合物中分離。為了確定p65 NF-κB磷酸化的降低是否可能受其與I-κBα的關聯的影響，我們對暴露於多西環素和Tat共表達的丁p27SJ細胞進行了p50/p65 NF-κB表達和磷酸化的western blot分析。western blot結果顯示，在表達外源性或內源性p65 NF-κB或Tat的細胞中，Iκ b蛋白的表達水平是相同的，且與DING蛋白的表達無關(圖4)。這些數據表明，在表達DING的細胞中，p65/p50 NF-κB的去磷酸化和失活不依賴於I-κBα，而磷酸化NF-κB蛋白水平的降低與DING蛋白的表達呈正相關(圖4，通道4和8，上圖)。盡管-κ b α在p65 NF-κ b存在的情況下表達水平較高(圖4,3,4,7,8通道)，但它被DING穩定，並逆轉了Tat相關的I-κ b α抑製(圖4,2,6通道)。此外，Iκ b去磷酸化的額外帶隻在轉染Tat和p65的表達DING的細胞中檢測到，而在Dox-細胞中沒有看到去磷酸化的Iκ b(圖4,4,7,8通道)。

圖4:DING p27SJ對NF-κB複合體的去磷酸化與I-κB無關。
Western blot檢測表明，丁醇表達細胞中p65/p50 NF-κB的去磷酸化和失活與i κ b α無關，與NF-κB水平的劇烈變化有關(2^nd和3^{理查德·道金斯}I-κBα表達不受I-κBα表達的影響(第4和第8通道，頂部麵板)。NF-κB p65的變化與DING的表達相關。雖然I-κBα在p65的存在下表達水平較高(3,4,7,8通道)，但在DING的作用下表達更穩定，並逆轉了與tat相關的I-κBα抑製(2,6通道)。第二組顯示了p65(外源性YFP-p65或內源性p65)和Tat水平。第三個麵板顯示了用作加載控製的Grb2水平。箭頭指向高磷酸化和低磷酸化的p65。下圖顯示了強力黴素治療後p27SJ的誘導作用。誤差條表示3次讀數的SD。

丁丁幹擾NF-κB核運輸

隨後，我們觀察了在多西環素處理或未處理的DING-p27SJ細胞中p50/p65 NF-κB二聚體的區隔化。激活DING蛋白表達後，將細胞分成核室和胞質室並進行western blot分析。細胞分離實驗表明，DING-p27SJ的存在影響了p65/p50 NF-κB從細胞質到細胞核的易位。我們觀察到，在表達DING p27sj的細胞中，p50 NF-κB蛋白(圖5A, 1 - 4通道與5 - 8通道相比)和p65 NF-κB蛋白(3和4通道與7和8通道相比)的細胞質積累遠遠高於核積累。不表達DING蛋白的細胞(Dox-細胞)的胞質和細胞核部分顯示p65 NF-κ b蛋白的Tat獨立核易位，這表明在表達DING的細胞中，HIV-1可能與DING的功能相矛盾(圖5A, lanes 9-16)。去磷酸化的p65在表達DING p27sj的細胞細胞核中被檢測到更密集(對比圖中第7和8巷與第15和16巷)。p65 NF-κB抑製劑I-κBα在DING p27sj陽性細胞的細胞質中積累較多(對比3,4巷和11,12巷)。有趣的是，結果顯示I-κBα核的存在誘導NF-κB從[55]核轉移到細胞質。I-κB通過將NF-kappa B以非活性形式保留在細胞質中，從而嚴格調控其轉錄活性。我們的數據表明，在表達DING的細胞中，I-κB的核形態可導致p65失活並向細胞質易位，並可能在DING對NF-κB的影響中起次要作用。

接下來，我們研究了除丁p27SJ外，全長丁p38SJ是否對p65從細胞質到細胞核的轉位有類似的幹擾作用，以及PMA刺激NF-κB時是否會看到這種影響。

圖5:丁醇幹擾NF-κB的轉運。
(一)DING 27SJ可破壞p65 NF-κB向細胞核的轉位。通過細胞分離和western-blot檢測，證實了DING p27SJ對p65/p50由細胞質向細胞核易位的影響。板1和2顯示細胞質多核p65積累丁(阿黴素+)細胞(通道1到4與5 - 8)。麵板5顯示了類似的強烈的細胞質的本地化p50(通道1到4與5 - 8)。p65 overexpressing細胞(車道3和4和7和8)和乙overexpressing細胞(麵板3,通道2和4與車道6和8)在丁p27SJ-expressing細胞(1 - 8車道)。在Dox-細胞中，這種作用並不強烈(9-16通道)。去磷酸化的p65在表達DING p27sj的細胞細胞核中被檢測到更密集(對比圖中第7和8巷與第15和16巷)。圖4顯示p65抑製劑IκBα在DING p27sj陽性細胞的細胞質中積累較多(與第3、4通道和第11、12通道相比)，盡管在細胞核中也有發現。圖6展示了細胞質Grb2(巷1-4和9-12)和核Lamin A(巷5-8和13-16)組分的加載控製。
(B)丁p38SJ對pma誘導的NF-κB p65活化及其轉位入核的影響。Western blot檢測采用轉染全長DING p38SJ和PMA誘導的細胞的細胞質和核裂解物。在表達DING p38sj的細胞中，p65的細胞質積累增加(3和4通道與1和2通道相比)。在缺乏DING蛋白的細胞細胞核中發現更多pma誘導的p65。誤差條代表3個不同讀數的SD。

丁p38SJ對pma誘導的NFκB p65活化及其向核轉位的影響

轉染了DING p38SJ和PMA誘導的細胞的細胞質和核裂解液的細胞分離實驗顯示，在表達DING p38SJ的細胞中，p65在細胞質中更多地積累(圖5B，第3和4通道與第1和2通道相比)。PMAinduced p65在僅轉染空載體的對照細胞細胞核中檢測到更密集(圖5B，比較6巷和8巷，上圖)。因此，當PMA誘導p65轉位到細胞核時，DING蛋白逆轉了PMA對p65的作用，結果更多的p65滯留在細胞質中。

DING p38SJ同時需要NF-κB和RPII來抑製LTR

我們使用含有C/EBPβ(-118/-104)、NF-κB、RNA Pol II和TAR結合域的LTR缺失突變體，進行啟動子-報告子熒光素酶檢測，以確定HIV-LTR基因中的ding響應區。使用熒光素酶報告質粒和表達DING p38SJ的細胞研究了DING p38SJ磷酸酶對HIV-1 LTR及其缺失突變體的轉錄活性的影響(圖6A)。在本實驗中，缺少Tat結合位點(TAR區+22/+54)和RPII(+23)的LTR缺失突變體(-117/+3)的轉錄活性僅被抑製40倍，但仍包含NF-κB p65(-104/-80)，而NF-κB缺失突變體(-84/+66缺失突變體)的啟動子活性被強烈抑製1000倍。部分NF-κ b(-94/+66)的缺失抑製了LTR活性6倍(列1)。在DING p38SJ存在的情況下，每個包含NF-κ b結合位點的病例都有大約300倍和200倍的抑製(列3，生1-3)。對於部分缺乏NF-κ b位點(-94/+66)或完全缺乏NF-κ b位點(-82/+66)的LTR突變體，DING p38SJ的抑製作用分別為20-和6倍(列3，生4-5)。當RPII和TAR區域都被刪除，但NFκB仍然存在(-117/+3)，DING p38SJ對LTR的抑製作用約為5倍(列2，原6)。我們得出結論，DING p38SJ抑製了HIV-1 LTR的轉錄活性，其中包含細胞轉錄激活因子p65 NF-κB和RPII的結合位點，以及病毒HIV-1 Tat結合位點(TAR)。由此可見，DING p38SJ對HIV-1 LTR轉錄有很強的抑製作用。

圖6:(A) DING同時需要NF-κB和RPII來抑製LTR。
丁醇通過NF-κB(-103/-80)、RPII結合域和TAR區域抑製LTR的轉錄，在啟動子/報告子測試中觀察到轉錄。HIV-1 LTR缺失突變體被用於轉錄檢測，NF-κB(-103/-80)、C/EBPβ(-118/-104)、RPII(+23)和TAR(+22/+54)區域。在U-87MG細胞中使用HIV-1 LTR-熒光素酶報告基因構建，檢測DING p38SJ對HIV-1 LTR啟動子活性的影響。上圖展示了HIV-1 LTR結構及其序列中病毒和細胞轉錄因子的重要結合域的示意圖:LTR缺失突變體(-117/+3)既缺乏Tat結合位點(TAR)也缺乏RPII，但仍包括NF-κB p65 (-104/-80)， NF-κB缺失突變體(-84/+66)，部分缺乏NF-κB位點(-94/+66)或完全缺乏NF-κB位點(-82/+66)。底部顯示的是丁丁對熒光素酶檢測中HIV-LTR缺失突變體的影響。LTR轉錄的抑製表現為褶皺。每一列的數字歸一化為第一列頂部原始的對照(1倍，或100%)，即在沒有DING p38SJ的情況下，全長HIV-LTR基因。對LTR突變體的折疊抑製見第1列，其中SD(第2列)。DING對LTR的抑製見第3列，其中SD(第4列)。p值見第5列。
(B)DING p38SJ的n端區域含有磷酸結合域，對抑製p65相關的LTR轉錄激活很重要。DING p38SJ缺失突變體示意圖(上)。通過啟動子/報告子試驗研究了DING p38SJ對NF-κB相關LTR激活的影響，使用了各種DING p38SJ缺失突變體(下)。LTR轉錄的抑製表現為褶皺。每一列的數字歸一化為對照(1倍，或100%)。錯誤條表示SD。實驗重複3次，取3個重複樣品。

我們的結果表明，DING通過啟動子報告試驗中觀察到的NF-κB、RPII結合位點和TAR區域抑製LTR轉錄(圖6A)。

DING p38SJ中含有磷酸結合域的n端區域對於抑製p65相關的LTR轉錄激活非常重要

在表達p38SJ缺失突變體的細胞中，通過啟動子/報告子試驗研究了DING p38SJ及其缺失突變體對NF-κB和LTR激活的影響(圖6B)。全長度DING p38SJ和DING缺失突變體的示意圖如圖6B所示(上麵板)。數字(折疊激活)如圖6B所示。使用DING缺失突變體的啟動子-報告子分析結果表明，DING p38SJ的n端區域包含磷酸結合域，對抑製p65相關的LTR轉錄激活很重要。

討論和結論

丁丁抑製HIV-1和p65 NF-κB磷酸化是控製HIV-1感染和HIVLTR轉錄激活的一個重要事件。2006年首次克隆出丁p27sj, 2011年又克隆出丁p38sj全長貫葉連翹(基因庫:AAW57408.1)[1, 2]。DING p27SJ蛋白是DING家族蛋白中的一員，具有4個保守的n端DING序列。DING蛋白也含有磷酸結合域，有些與堿性磷酸酶有關。DING蛋白在人類疾病中起著非常重要的作用，包括病毒感染[8]。

我們在這裏展示了DING p27SJ和DING p38SJ對NF-κB p65亞基(內源性和外源性表達)的抑製作用。其機製似乎是NF-κB的去磷酸化和核-細胞質易位的參與。重要的是，p65輔助因子p50也被DING去磷酸化。這一結果與之前發表的數據一致，表明外源性人變丁丁蛋白[56]處理過的1G5細胞細胞核中p65-和p50-NF-κ b磷酸化形式的缺失。本研究提供了更多的信息，表明DING p27SJ失活NF-κB複合體的機製與I-κB無關。我們的數據顯示，NF-κB水平的急劇變化不受I-κBα表達的影響，但與DING蛋白的存在有關。有趣的是，我們發現I-κBα也在細胞核中，這一結果與之前Laín de Lera T等發表的數據一致，他們證明了I-κBα在人外周血T淋巴細胞[57]的細胞核中表達。目前的模型解釋了I-κBα的抑製能力是通過保留Rel/NF-κB蛋白在細胞質中介導的。

此外，I-κBα也存在於細胞核中，且I-κBα核組分比胞質I-κBα[57]更穩定。核I-κBα不能抑製NF-κB與DNA的結合。此外，我們還發現I-κB以活性形式存在於靜息和pma0激活的人PBL細胞核中，並不能抑製NF-κB與DNA[57]的結合。進一步研究表明，核中I-κBα的存在可導致NF-κB從核轉移到細胞質[55]。I-κBα以非活性的形式定位於細胞質中，可以調節NF-κB的轉錄活性，但如果在細胞核中表達，則會破壞NF-κB/DNA結合，甚至NF-κB轉位回細胞質。因此，抑製NF-kappa B/DNA結合和I-κBα的核輸出是控製NF-κB依賴性基因表達的重要機製之一。

其中一種可能的抑製NF-κB p65亞基的機製可能是通過丁醇幹擾NF-κB核運輸介導的，因為在表達丁醇的細胞中，更多的p65和p50 NF-κB形式積累在細胞質中，而I-κBα則在細胞核中發現。此外，DING蛋白影響pma誘導的NF-κB p65的活化及其向細胞核的轉位。再次，在表達ding的細胞中觀察到更多的p65細胞質積累。我們認為ding介導的p65/p50 NF-κB核易位的紊亂可以解釋HIV-1 LTR激活抑製的現象，因為在細胞核中該蛋白數量不足，無法啟動HIV-LTR基因轉錄。有趣的是，延伸試驗的結果表明，轉錄本越長，引物距離轉錄起始開始越遠，DING對p65轉錄本延伸的抑製作用越強。我們發現，DING需要NF-κB和RPII結合域來抑製LTR。有趣的是，DING的n端區域包含一個磷酸結合域，對抑製p65相關的LTR轉錄激活很重要。綜上所述，DING蛋白具有磷酸酶活性，可抑製p65 NF-κB的磷酸化及其核易位和活化，並具有較強的抑製HIV-1複製的作用。最近發表的數據表明，NF-κB因子在SARSCOV-2、MERS和SARS-COV-1等其他病毒的發病機製中發揮著重要作用[58,59]。因此，使用DING蛋白作為治療手段不僅可以抑製HIV-1，還可以抑製其他病毒，如SARS-COV-2，這是一種很有前途的工具。 In the absence of current specific treatments for COVID-19, the DING based therapeutic strategies can be developed to treat these diseases as an alternative to the vaccine prevention to end the epidemic.

確認

我們要感謝Shriners醫院兒科研究中心和神經科學部門的成員，Loriann Mullen博士，Aureen Baksh博士的支持和富有洞察力的討論。我們感謝天普大學神經科學係Kamel Khalili博士對啟動研究的支持。我們還要感謝Yuri Popov博士(亞美尼亞埃裏溫國立大學生物係)為我們實驗室分離p38SJ蛋白提供了起始材料，以及Mikael Elias博士(明尼蘇達大學生物技術研究所生物化學、分子生物學和生物物理係)提供了寶貴建議。這項工作得到了NIH對Shohreh Amini博士的資助，以及賓夕法尼亞州國務院對Nune Darbinian博士的資助(項目10:420491-04400-02)。

的利益衝突

作者聲明沒有競爭的經濟利益。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Darbinian N, Darbinyan A, Merabova N, Gomberg R, Chabriere E，等(2020)DING蛋白通過抑製NF-κB p65的磷酸化抑製HIV-1基因的轉錄。J HIV艾滋病6(1):dx.doi.org/10.16966/2380-5536.175

版權:©2020 Darbinian N，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2020年7月31日

接受日期:2020年8月28日

發表日期:2020年8月31日,