HIV和艾滋病- science Forschen

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研究文章
人組織纖溶酶原激活物信號肽對疫苗誘導T細胞的載體傳遞依賴效應

比阿特麗斯Ondondo1 #蘇丹Abdul-Jawad1 #Yaowaluck Roshorm2 #‡安妮·布裏奇曼2生田鬥真š漢克1 - 3 *

1牛津大學詹納研究所，舊路校園研究大樓，羅斯福路，牛津OX3 7DQ，英國
 2英國牛津大學約翰拉德克利夫學院威瑟爾分子醫學研究所人類免疫學組
 3.日本熊本大學國際醫學研究中心
 坦桑尼亞達累斯薩拉姆穆希比利衛生和聯合科學大學公共衛生和社會科學學院
 ‡現地址:泰國曼穀10150，孟古國王科技大學通武裏，48 Moo 8, Thakham, Bangkhuntien，泰國曼穀10150
 ＃平等的貢獻

*通訊作者:Tomáš漢克，牛津大學詹納研究所，羅斯福路老路校園研究大樓，牛津OX3 7DQ，英國，電話:+44 (0)1865 617630;傳真:+44 (0)1865 617608;電子郵件:tomas.hanke@ndm.ox.ac.uk

摘要

在動物模型中，人組織纖溶酶原激活物信號肽(tPA-SP)與多種蛋白質的連接增強了抗體和細胞免疫反應的誘導。在這裏，作為改善HIV-1疫苗免疫原性的持續努力的一部分，我們試圖確定添加優化的tPA-SP是否能改善由表達HIV-1蛋白質組高度保守區域的hivconv蛋白的疫苗誘導的T細胞的大小和功能。hiv疫苗由質粒DNA、非複製猿猴(黑猩猩)腺病毒ChAdV63和非複製痘病毒MVA作為載體。我們發現，tPA-SP的添加增加了所有測試疫苗的細胞內hiv蛋白水平。當肌肉注射給BALB/c小鼠時，觀察到在DNA模式下，疫苗誘導t細胞的頻率增加了2- 3.5倍，然而，當使用更有效的ChAdV63啟動物- mva刺激的異源方案時，沒有一致的顯著改善。我們的結果與之前的DNA研究一致，強調tPA-SP的免疫增強可能與免疫原、疫苗方式、免疫應答類型和物種特異性有關。因此，應針對每種疫苗策略分別評估tPA-SP對誘導所需免疫應答的影響。

關鍵字

HIV-1疫苗免疫原性，hiv - conv疫苗，人組織纖溶酶原激活物信號肽(tPA-SP)

簡介

提高疫苗的免疫原性和隨後的療效是一個持續的挑戰。為了成功誘導細胞介導的免疫反應，應有效地生成病原體源性多肽，並將其傳遞到MHC I類和ii類限製性通路[1,2]。由於MHC I類和II類之間肽負載在亞細胞定位上的差異，靶向免疫原到細胞質和進入ER可能會導致CD8的增強+和CD4+分別t細胞反應。此外，引導病原體來源的蛋白分泌可改善抗體誘導和交叉呈遞誘導T細胞[3,4]。因此，有意操縱免疫原在細胞內的轉運，以提高疫苗的性能是一個積極的研究領域。

組織纖溶酶原激活物信號肽(tPA-SP)是哺乳動物細胞中提高重組蛋白表達水平最常用的異源先導序列之一[5-12]。當與蛋白n端偶聯時，它將新生生長的氨基酸鏈導向ER和細胞分泌通路[5,13- 15]。此外，tPA-SP切割信號的修飾促進了其高效去除，並加速了載體新生多肽折疊成功能蛋白[16]。tPA-SP與疫苗免疫原的融合雖然不是對所有偶聯蛋白都有利[7,14]，但增強了抗體[5,9,15,17]和細胞介導的[9,11,18]反應的誘導，延長了免疫記憶[5,15]，並在模型感染中對病原體提供了保護[5,8,9,15,19]。

我們正在開發一種針對HIV-1的候選疫苗，主要針對CD8+t細胞對HIV-1蛋白[20]高度保守區域的反應。這些在大多數HIV-1變體中都有，它們的突變通常與複製成本相關[21-24]，但在自然感染中通常包含亞顯性表位。根據臨床前研究[20,25-34]，提供hiv -1陰性和陽性的歐洲和非洲成人免疫原的疫苗已進入8項臨床試驗，在大多數免疫原方案中，誘導保守的區域特異性T細胞頻率達到中位數峰值，在每百萬循環PBMCs中3- 550個細胞之間[35-38]。在這些研究中，編碼hiv免疫原的基因由質粒DNA、非複製猿猴(黑猩猩)腺病毒ChAdV-63和非複製痘痘病毒修飾的痘苗病毒安卡拉(MVA)載體，沒有前導肽。由於保護人類免受HIV-1感染所需的有效T細胞的頻率尚不清楚[39,40]，我們持續的目標是提高疫苗的性能。在本研究中，為了了解未來的發展，我們研究了tPA-SP與hiv免疫原的粘附是否有利於hiv疫苗誘導t細胞。

材料和方法
研製和製備疫苗

前麵已經介紹了hiv - conv[20]和thivconv[25]疫苗的設計、構建和製備。用於免疫，質粒DNA在大腸杆菌DH5α中產生，使用EndoFree質粒Giga kit (Qiagen)分離，保存在-20°C直到使用。重組ChAdV-63疫苗在HEK 293細胞懸浮培養中培養，層析純化，滴度，-80°C保存待用。重組MVA疫苗在原代雞胚成纖維細胞中培養，經兩次CsCl緩衝離心純化，滴滴並在-80°C保存直到使用。

Immunofluorescent染色

用2.5µg的pSG2轉染6孔板上HEK 293T細胞。tHIVconsv或pSG2。hivconv質粒DNA使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)根據製造商的規格。對於感染，HEK 293T細胞在37°C, 5% CO的無血清DMEM培養基中，以表達hivconv或thvconv蛋白的重組MVA或ChAdV63感染，感染倍數(MOI)分別為5和102為2小時。然後用PBS洗滌細胞，在完全的DMEM培養基(10% FCS和1%青黴素/鏈黴素)中孵育24小時，用冰冷PBS洗滌，並在含4%甲醛(Sigma)的10%中性緩衝福爾馬林溶液冰上固定10分鍾。固定細胞在室溫下孵育20分鍾，PBS洗滌和0.2% Triton (TX-100)滲透5分鍾，再次洗滌，用1%牛血清白蛋白(BSA)在PBS阻隔30分鍾，抗pk (Abcam)，抗鈣聯蛋白(BD Bioscience)和抗cd63單抗(BD Bioscience)單抗。將細胞洗3倍15分鍾，用Vectashield DAPI核染色安裝介質(Vector Laboratories)將細胞安裝在顯微鏡載玻片上，然後在熒光顯微鏡(Leica DMI 3000B)上進行檢查。

脈衝追蹤分析

dna轉染細胞的代謝標記[35S]蛋氨酸以前被描述為[41]。簡單地說，HEK 293T細胞瞬時轉染如上所述的DNA。18小時後，用不含蛋氨酸的最低必要培養基取代生長培養基30分鍾，然後加入含有75 μ Ci (2.7 MBq)的新鮮培養基[35S]蛋氨酸毫升－1．經過15分鍾標記期後，將細胞進一步在含有未標記蛋氨酸的培養基中孵育多次，並在含有Nonidet P-40、100 mM碘乙酰胺和蛋白酶抑製劑的裂解緩衝液中裂解。

免疫沉澱反應和sds - page

細胞裂解物通過免疫沉澱和SDS-PAGE進行分析，如前所述[41]。簡單地說，細胞裂解物與抗pk標簽單克隆抗體(Abcam)和蛋白A - Sepharose在4℃下進行免疫沉澱。將細胞製成球團，洗滌球團，重新懸浮在SDS樣品緩衝液中，在95°C下加熱5分鍾，然後在10%丙烯酰胺還原型凝膠上SDS- page。

小鼠，免疫和脾細胞的製備

實驗采用5 ~ 6周齡雌性BALB/c小鼠組。所有疫苗接種均在全身麻醉下肌肉注射，注射DNA 100µg, 106重組MVA的斑塊形成單位(PFU)和3 × 108感染單位(IU)重組ChAdV63。在犧牲當天，收集脾髒，用5 ml注射器橡膠柱塞通過尼龍細胞過濾器(BD Falcon)單獨按壓各器官，分離細胞。用RBC Lysing Buffer hybrid - max (Sigma)去除紅細胞後，洗滌脾細胞，並在R10(添加10% FCS、青黴素/鏈黴素和β-硫醇的RPMI 1640)中重新懸浮，用於ELISPOT、細胞內細胞因子染色(ICS)試驗和其他程序。

道德聲明

所有動物程序和護理都嚴格遵守1986年《動物(科學程序)法案》下的英國內政部指導方針。該方案得到了當地研究倫理委員會(牛津大學臨床醫學)的批準。實驗是根據項目許可證編號進行的。30/2833由TH與嚴格執行替換，減少和細化(3Rs)原則。

肽和肽池

通過質譜分析(Ana Spec, San Jose, CA, USA)，所有肽的純度至少為80%，在DMSO (Sigma-Aldrich)中溶解，得到10 mg/ml的原液，並在-80°C保存。199個hiv - conv衍生肽(15/11)被分成6個池，每組32 - 35個單獨的肽用於ICS和ELISPOT分析。多肽的最終濃度為1.5µg/ml。

有關酶聯免疫斑點試驗幹擾素-γ

根據製造商的說明，使用小鼠IFN-γ ELISPOT試劑盒(Mabtech)進行ELISPOT試驗。使用生物素偶聯的二級抗ifn -γ單抗(R4-6A2，大鼠IgG1)、堿性磷酸酶和顯色底物(Bio-Rad)連續觀察斑點，並使用AID ELISpot閱讀器係統(Autoimmun diagnostics)進行計數。IFN-γ產生細胞的無肽頻率低於40 SFU/106脾細胞和從肽刺激培養的脾細胞中減除。

細胞內細胞因子染色(ICS)

100萬個細胞在37°C, 5% CO條件下被肽或肽池刺激2在加入GolgiStop (BD bioscience)之前。如果需要，在刺激開始時添加CD107a-FITC抗體。孵育5小時後，用FACS緩衝液(PBS, 1% FCS, 0.01%疊氮酰胺)清洗細胞，用抗cd16 /32抗體(eBioscience)在4°C阻塞20分鍾，然後用抗cd8和抗cd4單抗(eBioscience)染色。然後使用Cytofix/ cytooperm kit (BD Biosciences)對細胞進行洗滌和滲透，並對細胞內細胞因子進行染色:抗tnf -α、抗ifn -γ和抗il -2 mAb (eBioscience)。細胞用Cell Fix (BD Biosciences)衝洗固定，用LSRII (BD)流式細胞儀采集，用Flowjo (Tree Star)和SPICE軟件分析。

體外殺試驗

根據製造商的規格，用800 nM或32 nM的CFSE分別標記相同數量的P815細胞。用800 nM CFSE標記的P815細胞與多肽脈衝2小時，並洗滌多次。按照上述方法製備免疫小鼠的脾細胞，與cfseled標記的P815靶細胞按效靶比(E:T) 10:1或5:1混合，在37°C下孵育一夜。這些細胞被清洗，用活/死標記進行染色，並用流式細胞術進行分析。細胞毒性計算公式如下:%比裂解=100 ×(未脈衝對照細胞數-肽數-脈衝細胞數)/未脈衝對照細胞數。

統計分析

使用Graph Pad Prism版本5進行統計分析。假設t細胞響應在分布上是非高斯的，因此結果以中位數(範圍)表示。采用Kruskal-Wallis檢驗進行多次比較。采用雙尾Mann-Whitney U檢驗對具有相同體外刺激的組進行比較。P值<0.05被認為是顯著的。

結果
DNA轉染後，tPA-SP與hivconv融合增加了蛋白表達，但沒有半衰期

長達806個氨基酸的hivconv免疫原序列被公布為[20]。tPA的22P/ a突變信號序列(MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSAR)[16]的DNA序列被連接到hivconv開放閱讀框(ORF)的5 '端以表達thvconv(圖1A)。特別是22P/ a突變的tPA-SP在進入ER易位過程中會被信號肽酶有效地共翻譯去除[25,42]。對於DNA疫苗模式，我們首先使用顯微鏡來評估瞬時轉染HEK 293t細胞中hivconv蛋白的亞細胞定位，或更準確地說，它的c端Pk標記[43]，並相對於鈣接蛋白(ER伴侶蛋白)和CD63(晚期核內體/溶酶體標記物)進行評估。免疫熒光分析顯示，與表達未修飾的hivconv的細胞相比，轉染thivconv的細胞染色更亮，並提示通過tPASP增強了Pk標簽與鈣接蛋白ER的共定位，但未到達晚期內體/溶酶體間室(圖1B)。流式細胞術分析發現，轉染pSG2後，HEK 293T細胞Pk標記陽性的頻率更高。相對於pSG2。結果表明，tpa - sp修飾的hivconv的表達水平較高(圖1C)。未降解的hivconv蛋白的細胞內半衰期與pSG2相似。HIVconsv pSG2。在脈衝追逐實驗中，後者的蛋白水平在0、0.5和1小時略有增加(圖1D)。總的來說，這些數據表明，在DNA傳遞之後，將tPA-SP添加到轉染HEK 293T細胞的ER中，允許更高的hivconv蛋白積累。

圖1:pSG2中hiv免疫原的表達。HIVconsv pSG2。tHIVconsv DNA疫苗。(A) hivconv和tpa - sp融合的thvconv免疫原示意圖。t細胞表位H和mAb Pk標簽連接到hivconv的c端，促進臨床前發育[20]。保守區域上方的字母表示分支，使用了一致的分支，下麵的柱狀圖描述了P1-P6肽池覆蓋的免疫原區域。(B) hivconv蛋白的亞細胞定位(Pk標簽)。用pSG2轉染HEK 293T細胞。HIVconsv pSG2。tHIVconsv dna疫苗。兩天後，細胞與Pk標記(上紅色，下綠色)、ER標記(綠色)calnexinas和晚期內體/溶酶體標記(紅色)CD63孵育，以表征hivconv免疫原的亞細胞定位。 DAPI was used to visualize the nuclei (blue). Cells were photographed using laser scanning confocal microscopy.Bar, 20 µm. (C) Two days after DNA transfection, HEK 293T cells were lifted from the plates and incubated with FITC-conjugated anti-Pk mAb to detect HIVconsv expression. Percentages of HIVconsvexpressing cells (left) and their MFI (right) were determined using flow cytometry (see Figure 3 for a representative gating). Data are shown as mean ± SEM (n=3). (D) Analysis of the HIVconsv protein half-life in HEK 293T cells transfected with either pSG2.HIVconsv or pSG2. tHIVconsv DNA vaccines. After metabolic labeling with [35S]蛋氨酸，細胞在放射自顯影顯示時間以上用冷蛋氨酸追趕細胞，細胞裂解物用抗pk單抗免疫沉澱，10% SDS-PAGE和放射自顯影分析。

tpa - sp修飾的hivconv改善了DNA疫苗誘導t細胞的能力

為了研究tPA-SP對t細胞免疫原性的影響，對BALB/c小鼠分別接種1、2、3劑量重組DNA (D、DD、DDD方案)和誘導CD8+T細胞用細胞內IFN-γ染色分析，最初使用H-2d免疫顯性肽H (RGPGRAFVTI;環境殘基311-320)[44]被添加到hivconv[20]的c端進行臨床前發育(圖1A)。pSG2免疫。thivconv DNA誘導h特異性CD8的頻率提高2- 3.5倍+T細胞相對於無領導的pSG2。艾滋病毒疫苗，達到統計學顯著性D (P=0.01)和DD (P=0.02)方案(圖2A)。在單獨的免疫中，我們評估了誘導T細胞的廣度和特異性。小鼠接受DDD方案和每一個pSG2。tHIVconsv pSG2。在IFN-γ ELISPOT試驗[45]中，通過對跨越整個hivconv蛋白的32-35個重疊15-mer多肽的6個池P1-P6進行應答，枚舉了hivconv組細胞。pSG2對P2、P4和P6池的反應範圍為448-1055和128-415個SFU /106個脾細胞。tHIVconsv pSG2。分別為hiv病毒疫苗，經修飾的thivconv誘導的頻率顯著更高(圖2B)。thvconv誘導了75個SFU/106個P1特異性脾細胞，而未誘導hivconv。對ICS中產生IFN-γ、TNF-α和IL-2並產生脫顆粒(CD107a)的h特異性T細胞進行分析，發現兩個群體中均具有多功能性，整體tpa -sp增強免疫原性與IFN-γ ELISPOT試驗結果一致(圖2C)。在單獨的DDD疫苗接種中，這次使用的是pSG2。HIVconsv pSG2。tHIVconsv and pSG2.HIVconsv+pSG2. HIVconsv (half-doses), immune splenocytes were tested against all 199 individual peptides across HIVconsv, reasoning that different subcellular localization of the HIVconsv protein may lead to differential epitope processing and presentation, and using the unmodified and tPA-SPcoupled immunogens together may benefit the overall breadth of response. Thus, the strongest responses among clusters of adjacent overlapping 15-mers were detected to peptides 15, 42, 112 and 197 (containing the H epitope). There was a hint of differential processing with HIVconsv inducing stronger responses to peptide 112 compared to 42, while the tHIVconsv immunogen elicited higher frequencies of T cells to peptide 42 relative to 112, while mixed HIVconsv+tHIVconsv delivery induced equal peptide 42 and 112 frequencies. However, Kruskal-Wallis test did not find the three sets of T-cell frequencies induced by different immunogens and their combination significantly different (Pd = 0.19)(圖2)。

圖2:tPA-SP增強了hivconv質粒DNA傳遞的免疫原性。(A) BALB/c小鼠分別用pSG2免疫。hivconv(深色)或pSG2。7周間隔1次(D)、2次(DD)或3次(DDD)，最後一次免疫後2周獻祭。CD8+使用最佳H-2在ICS試驗中評估T細胞誘導d在一項單獨的實驗中，小鼠接受3次使用pSG2的DNA免疫(DDD)。hivconv(深色)或pSG2。tHIVconsv(光)疫苗。在IFN-γ ELISPOT試驗中列舉了他們的hiv - conv特異性T細胞，使用6個肽池P1-P6的15-mer多肽，由橫跨整個hiv - conv蛋白的11個氨基酸重疊(圖1A)。(C)用多色流式細胞術分析免疫脾細胞，在表位h的重新刺激下產生IFN-γ、TNF-α、IL-2和脫顆粒(CD107a)，左側顯示由表達hivconv(深色)和thivconv(淺色)的疫苗誘導的h特異性T細胞的百分比，右側顯示T細胞的多功能。參見圖4E了解代表性的門控策略。(A-C)中的數據為減去無肽背景後的中位數(四分位範圍)(n=5)。同樣的在體外用雙尾Mann-Whitney U檢驗比較了H-或池特異性T細胞的hivconv和thivconv誘導的頻率，星號表示P< 0.05。(D) BALB/c組小鼠分別接受3個劑量的pSG2。pSG2 HIVconsv(上)。pSG2. hivconv +pSG2混合劑量為中劑量或半劑量。上圖所示的thvconv(下)及其聚集的hivconv特異性脾細胞對st199個15-mers肽(僅顯示孔中有斑點的肽)進行了枚舉(n=3)。虛線表示積極響應的任意閾值(背景上方至少50 SFU/106)。采用Kruskal-Wallis試驗比較未修飾和tpa - sp偶聯免疫原及其組合誘導的三組t細胞頻率(P= 0.19)。

帶有和不帶有病毒載體表達的tPASP的hiv病毒表達的不同模式

我們的t細胞免疫原交付臨床策略的核心包括猿猴腺病毒啟動體和MVA促進體。因此，將編碼hivconv和thivconv免疫原的基因工程到這兩個載體中，並將疫苗命名為ChAdV63。HIVconsv ChAdV63。tHIVconsv MVA。HIVconsv MVA.tHIVconsv。與DNA疫苗類似，Pk標簽的表達通過使用Pk特異性單抗的免疫熒光法確認。當使用病毒載體時，tPA-SP疫苗在細胞質囊泡結構中熒光的積累更為明顯(圖3A)。流式細胞術顯示，tPA-SP對重組ChAdV63和mva感染細胞中hivconv表達的影響不同。而感染MVA的細胞數量較高。hivconv比mvathivconv表達Pk標簽，MFI略高，這些參數倒置，有利於thvconv傳遞重組ChAdV63感染(圖3B)。對這兩種病毒進行了多個時間點和感染的多重性測試，並選擇感染後24小時作為表達水平和由於細胞病變效應導致的細胞粘附鬆動之間的最佳折衷方案(未顯示)。 Thus at least at this time point, the effect of tPA-SP addition on the HIVconsv expression differed for the poxvirus and adenovirus vectors.

圖3:MVA和ChAdV-63疫苗中無或有tPA-SP的hivconv表達(A)在感染痘病毒-(MOI 5)或腺病毒-(MOI 10)載體疫苗24小時的HEK 293T細胞中，用fitc結合的抗pk標記單克隆抗體(綠色)和共聚焦顯微鏡觀察未修飾和tPA-SP表達的hivconv的亞細胞定位。DAPI定位細胞核(藍色)。酒吧,20µm。(B)感染後1天，取出HEK 293T細胞，與fitc結合的抗pk單抗孵育，使用圖示門控(左)，用流式細胞術測定hiv - convv表達細胞及其MFI的百分比(右)。數據表示為平均值±SEM (n=3)。

tPA-SP對ChAdV63-MVA方案誘導t細胞的弱負作用(CM)

為了評估tPA-SP對通過ChAdV63-MVA方案誘導hiv - conv特異性T細胞的影響，將ChAdV63和MVA疫苗依次免疫BALB/c小鼠組(圖4A)，疫苗編碼為hiv - conv或thivconv免疫原。使用hivconv肽池P1-P6的IFN-γ ELISPOT檢測發現添加tPASP後t細胞頻率下降不到2倍。隻有P2池的響應幅度顯著降低(P<0.01)和P5 (P< 0.03)(圖4 b)。肽刺激的t細胞頻率總體上呈相似趨勢，其中對肽42 (P=0.007)和112 (P< 0.001)(圖4)。對於三個最具免疫優勢的多肽42、112和H，例體外進行殺傷試驗以確定tPA-SP是否改善CD8+t細胞對肽脈衝靶細胞的裂解活性。雖然檢測到效靶比為10:1的強裂解，中位殺傷在44%到77%之間，但統計上僅檢測到肽H的強殺傷，這有利於未修飾的hivconv免疫原(圖4D)。接下來，我們評估了在CM方案中向hivconv免疫原中添加tPA-SP是否會通過CD8影響IFN-γ、TNF-α和IL-2的表達+T細胞。而在肽112特異性CD8中檢測到約2倍的顯著下降+tPA-SP附著後，T細胞產生IFN-γ、TNF-α和IL-2，肽H隻在產生IL-2方麵有顯著差異，肽42在任何功能上都沒有發現差異(圖4E)。因此，對於CM方案，添加到hivconv中的tPA-SP會弱降低t細胞對某些表位的誘導。

圖4:在ChAdV-MVA (CM)方案中，添加tPA-SP對hiv免疫原性有微弱的負麵影響。(A)免疫接種時間表。(B) BALB/c小鼠分別接種表達未修飾(深色)或tpa - sp -連接(淺色)hivconv免疫原的重組ChAdV63和MVA疫苗。tPA-SP對hiv免疫原性的影響通過IFN-γ ELISPOT試驗評估，使用6個肽池P1-P6 (B)和選擇的單個刺激性15-mer肽和肽H (C) (n=5+5;彙集了2個實驗)。(D)評估相同的脾細胞以效靶比10:1 (n=5)裂解兩種最具免疫優勢的15-mer和H肽脈衝的P815靶細胞的能力。免疫CD8 (E)+使用多色流式細胞術分析T細胞，在肽42、112和H的重新刺激下產生IFN-γ、TNF-α、IL-2和脫顆粒(CD107a) (n=5)。對於所有圖表，數據在減去背景作為中位數(四分位範圍)後顯示。使用雙尾Mann-Whitney U試驗比較同一池/肽再刺激檢測到的hivconv和thivconv誘導的t細胞頻率。星號表示P< 0.05。

tPA-SP對dna - nadna - chadv63 - mva方案誘導t細胞的最小影響(DDDCM)

接下來，tPA-SP對t細胞免疫原性的影響通過重組載體ChAdV63和MVA(方案DDDCM;圖5 a)。在重組ChAdV63後，使用加速的3周DNA管理間隔和標準的6周間隔，在接受thvconv和接受hivconv的小鼠之間，沒有觀察到6個肽池中的任何一個肽(圖5B)和單獨測試的肽(圖5C)， IFN-γ ELISPOT測定的t細胞頻率有顯著差異。大幅升值體外從接受thivconv的小鼠分離的脾細胞對肽脈衝P815靶細胞的殺傷作用僅檢測到肽H (Pd = 0.029)(圖5)。最後，通過IFN-γ ELISPOT試驗和最近定義的最佳肽LVGPTPVNI (15-mer肽42)和(YYDPSKDLI (15-mer肽112)[31]對DDD、CM和DDDCM方案進行直接比較。雖然thivconv > hivconv的DDD和DDDCM方案誘導特異性T細胞頻率的總體趨勢以及thivconv的倒置趨勢和thivconv < hivconv的倒置趨勢在CM方案中是明顯的，但隻有少數比較達到統計學意義，中位數差異小於2倍(圖5E)。

圖5:在DNA-DNA-DNA-ChAdV-MVA (DDDCM)方案中，缺乏tPA-SP對hivconv誘導t細胞的一致作用。(A)免疫接種時間表。(B) BALB/c小鼠組接受DDDCM方案提供的hivconv(深色)或thivconv(淺色)免疫原，通過IFN-γ ELISPOT試驗評估hivconv特異性T細胞的頻率，使用6個肽池P1-P6 (B)，以及單個響應的15-mer肽和肽H (c) (n=4)。(D)用兩種最具免疫優勢的15-mer多肽和肽H以效靶比10:1 (n=5)檢測脾細胞裂解P815靶細胞的能力。(E)小鼠接受DDD、CM或DDDCM方案中的一種，並使用最佳長度肽在IFN-γ ELISPOT試驗中評估三種最具免疫原性表位特異性T細胞的誘導頻率(n =3)。對於所有圖表，數據在減去背景作為中位數(四分位範圍)後顯示。使用雙尾MannWhitney U試驗比較同一池/肽再刺激檢測到的hivconv和thivconv誘導的t細胞頻率。星號表示P< 0.05。

討論和結論

自構建[20]以來，我們已經報道了保守區hiv疫苗在小鼠、非人靈長類動物和I/IIa期人類臨床研究中表現出的高t細胞免疫原性，在這些臨床研究中，與其他廣泛定向、多功能CD8的研究相比，它們的接種誘導了高頻率+t細胞反應(30-36 20、25、28日,38)。盡管如此，我們仍在繼續尋找能夠進一步改善疫苗性能的策略，以最大限度地提高對人類的療效。在這裏，我們評估了通過添加tPA-SP來引導hivconv新生多肽進入ER和分泌通路對小鼠t細胞免疫原性的影響。對於所有三種試驗疫苗pSG2。ChAdV63 tHIVconsv DNA。tHIVconsv和MVA。在ivconv中，我們檢測到轉染/感染的人類細胞中增加了hivconv蛋白水平，並在囊泡細胞質結構中增加了其積累。而這種修飾使pSG2誘導的T細胞的頻率增加了2- 3.5倍。在使用chadv63 . hivconv - mva進行更有效的傳遞時，ivconv DNA失去了這種優勢。hivconv異體原輔方案。未在免疫小鼠中檢測到hiv - conv特異性抗體的誘導(未顯示)。

我們的結果與已發表的研究結果完全一致。融合tPA-SP的免疫原蛋白表達和分泌增加，同時免疫反應增強，在某些情況下，保護效果增強[7-11,14,15,19,46-48]。所有這些積極的報告幾乎都有兩個共同點:它們使用質粒DNA載體的疫苗，並在小鼠模型中觀察到疫苗性能的改善，Casimiro等人[49]除外，他們也在獼猴中觀察到添加tPA-SP的好處。因此，疫苗接種的益處是否會轉移到人類身上仍是未知數。質粒DNA與病毒載體不同的免疫原性在前麵已經被注意到，因此用DNA和痘病毒免疫導致長期表位層次[29]的差異。此外，其他一些研究未能發現tPA-SP在誘導免疫反應方麵的優勢[14,46,50]。因此，tPA-SP添加的效果是免疫原特異性的，需要針對每個特定的免疫原、載體方式、方案和誘導的免疫反應類型進行測試和確認。

雖然tPA-SP是一種廣泛用於DNA疫苗的信號肽，但其他細胞伴侶正在研究中，以提高疫苗的性能。因此，最近有報道稱，MHC Ii類相關不變鏈(Ii)與各種免疫原融合可以增強CD8+t細胞的反應[]51號~ 53號。這種增強表現在腺病毒載體的疫苗上，可以從小鼠轉化為非人靈長類動物，提供不變鏈偶聯丙型肝炎病毒衍生免疫原的疫苗目前正在進行人體試驗。在DNA質粒載體疫苗中包含溶酶體相關膜蛋白-1 (LAMP-1)的溶酶體靶向序列被證明可以將免疫原從蛋白酶體- mhc I類重定向到溶酶體II類通路，並在一些動物模型中顯著增強疫苗的免疫原性[15,54,55]。因此，亞細胞靶向策略仍然是提高疫苗效率的一個高度活躍的研究領域。

總的來說，這項研究表明，將tPA-SP連接到hivconv免疫原增加了其細胞內表達，但隻有當thvconv通過“裸”DNA傳遞時，疫苗的性能才會受益。對於已經有效的ChAdV63-和mva介導的傳遞，tPA-SP的添加並沒有進一步增加t細胞誘導，高於未修飾的hivconv。然而，將新生的hivconv蛋白靶向入ER/分泌通路可能會降低疫苗生產細胞的毒性，進而在生產過程中產生高疫苗產量，盡管後者仍有待證實。雖然我們的結論與已發表的其他dna載體疫苗的觀察結果一致，但這裏的主要新鮮之處在於對三種疫苗載體係統的綜合比較，並建立了我們獨特的t細胞免疫原的tPA-SP效應。總的來說，這項研究和其他研究的現有證據表明，在沒有確認特定免疫原、表達方式、期望免疫反應類型和預期物種的情況下，不能假設tPA-SP增強疫苗的免疫原性。

確認

這項工作是由英國醫學研究理事會(MRC G1001757至T.H.)和英國國際發展部(DFID)根據MRC/DFID協約協議共同資助的。S.A.-J。由沙特阿拉伯王國高等教育部阿卜杜拉國王獎學金資助。B.O.的部分資金來自國際艾滋病疫苗倡議(IAVI)，她的資金是在美國國際開發署(美援署)和其他捐助者的支持下獲得的。國際疫苗倡議捐助方的完整名單可在http://www.iavi.org獲得。T.H.是詹納研究所調查員。我們也感謝國際艾滋病倡議提供的艾滋病毒肽。

作者沒有競爭利益。

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文章類型:研究文章

引用:Ondondo B, Abdul-Jawad S, Roshorm Y, Bridgeman A, Hanke T(2016)人組織纖溶酶原激活物信號肽對疫苗誘導T細胞的載體傳遞依賴效應。J HIV艾滋病2(4):doi: http://dx.doi。org/10.16966/2380 - 5536.130

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出版的曆史:

  • 收到日期:2016年7月12日

  • 接受日期:2016年8月29日

  • 發表日期:2016年9月01日