表1:磷脂酶活性表現為假絲酵母隔離
磷脂酶活性Pz<1.00(陽性),Pz<0.7(較強毒性)
萊茵德•考爾*Ritu GoyalMegh S DhakadPreena Bhalla)理查德睡椅
Maulana Azad醫學院微生物學係和Lok Nayak聯合醫院,印度新德裏*通訊作者:Ravinder Kaur博士,醫學博士,Maulana Azad醫學院微生物學係主任教授,印度新德裏,電話:011-23235751(171);電子郵件:rkaur.mamc@gmail.com
目的:假絲酵母種,被認為是最致病的酵母之一,經常從免疫功能低下的患者分離。本研究的目的是測定蛋白酶,磷脂酶和粘附活性假絲酵母從艾滋病毒/艾滋病患者中分離出來的兩種菌種都有助於淺表和全身性念珠菌病的發病機製。
材料和方法:目前的調查涉及從不同的臨床來源回收的314個樣本的詳細研究,即;研究了艾滋病毒/艾滋病患者的痰、血液、尿液、口腔拭子和腦脊液樣本。識別假絲酵母采用胚芽管試驗、玉米粉瓊脂試驗、糖同化發酵試驗和Vitek-2酵母鑒定係統進行菌種鑒定。對所有分離株進行蛋白酶、磷脂酶測定和粘附試驗。
結果:分離出143株假絲酵母從314種不同的臨床來源中恢複了物種。白色念珠菌為優勢種(82.51%)C.tropicalis(6.29%),C.krusei(4.89%), C.parapsilosis(3.49%)和C.glabrata(2.79%)。100%C.parapsilosis>89%熱帶草>83.9%C.albicans>75%C.glabrata> 42.8%C.krusei顯示磷脂酶活性,而80%C.parapsilosis>77% tropicalis >75% glabrata >61.1%白色念珠菌>42.8%C.krusei蛋白酶活性為83.8%C.albicans> 80%C.parapsilosis> 77.7%C.tropicalis>75% C.glabrata >71.4%C.krusei表現出粘附性活動。
結論:目前的研究顯示孤立的C.albicans其次是HIV/AIDS患者不同臨床樣本中的熱帶C. picalis, C.krusei, C. parapsilosis和C.glabrata。總人數C.albicans產生蛋白酶、磷脂酶和誘導生物膜形成的數量均大於念珠菌屬非。白色的產生這些毒力因子。這一結果表明,生物膜的產生是重要的假絲酵母除了其他機製的物種建立感染。
生物膜;念珠菌病;艾滋病毒/艾滋病;磷脂酶;蛋白酶
在過去的二十年裏,由於獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)的流行、生命維持技術的改進和抗癌療法,真菌感染的病例急劇增加。與其他具有環境生態位的病原真菌不同,假絲酵母在60-80%的人類[1]的胃腸道和泌尿生殖道粘膜上發現的物種是共生生物。最常見的感染由假絲酵母種類包括粘膜感染,其次是侵入性感染。與念珠菌血症相關的危險因素包括中性粒細胞減少、癌症化療、抗菌藥物和長時間留置導管[2]。口咽念珠菌病(OPC)發生在一些患者人群中,隨著CD4+細胞計數的下降頻率增加,通常下降到低於200個細胞/mm的閾值3.[3]。
形態變化和菌絲形成能力在生物膜的形成中起著很大的作用。假絲酵母物種已經發展出一套有效的假定毒力因子和特定的策略來協助定植、入侵和致病。表達的毒力因子假絲酵母種類主要強調生物膜的形成、蛋白酶、磷脂酶等的產生,可能因感染的類型、感染的部位和階段以及宿主反應的性質而異。一旦產生接觸,酶通過破壞或降解細胞膜和細胞外蛋白質促進粘附,從而允許酵母進入宿主[4]。生物膜的產生還與相關生物的高水平抗微生物藥物耐藥性有關,這使得消滅生物變得困難。
本研究的主要目的是測定蛋白酶、磷脂酶和粘附活性假絲酵母從艾滋病毒/艾滋病患者中分離出來的兩種菌種都有助於淺表和全身性念珠菌病的發病機製。
200名有症狀的、確診為人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性的成年患者,男女皆有,懷疑患有一種假絲酵母感染被作為新德裏Maulana Azad醫學院的研究人群。采集口咽拭子、痰液、血液、尿液、腦脊液、糞便等涉及器官係統的相關臨床標本,進行直接鏡檢、真菌培養和血清學檢查。采用生化方法對酵母分離株進行鑒定和形態鑒定。
前瞻性觀察研究。
從Maulana Azad醫學院和相關醫院(Lok Nayak, GB Pant醫院,Guru Nanak眼科中心,Chacha Nehru Bal Chikitsalaya)機構倫理委員會獲得倫理批準,印度新德裏-110002。
根據製造商的說明,使用熒光激活細胞分選器BD FACS計數係統(Becton Dickinson)進行流式細胞術,對參與研究的每個患者進行CD4計數,評估免疫狀態。
識別假絲酵母根據標準推薦程序[6-8]和Vitek-2酵母鑒定係統(bioMerieux, Marcy Etoile,法國)進行了芽管試驗、玉米粉瓊脂試驗、糖同化和酵母氮基瓊脂發酵試驗(Difco, Becton Dickinson,印度)。
由蛋白酶測定、磷脂酶估計和粘附測定組成的毒力活性對所有分離株測定如下:
蛋白酶試驗:假絲酵母以牛血清白蛋白培養基(葡萄糖2%,KH2阿寶40.1%, MgSO40.05%,瓊脂2%,冷卻至50°C後與1%牛血清白蛋白溶液混合)。蛋白酶活性評分為:無可見暈圈時為-級,可見蛋白酶水解局限於菌落周圍1-2 mm時為+級,距離菌落[9]邊緣2 mm以上時為++級。
磷脂酶估計:通過在蛋黃瓊脂上培養分離株,並采用稍微改進的Samaranayake et al.[10]方法測定沉澱帶的大小,篩選分離株的細胞外磷脂酶活性。磷脂酶活性(Pz值)由菌落直徑與降水帶總直徑的比值決定。這個比例被稱為Pz(磷脂酶帶)。如果Pz小於1,則產生磷脂酶。Pz小於0.7表明菌株[10]毒性更強。
依從性分析:用分光光度法測定分離物的粘附活性。分光光度計讀數在405nm用微量滴度板法進行。每個分離物的粘附活性評分為負(% T集團;<5), 1+ (% t集團;5 ~ 20), 2+(% T集團;20 ~ 35), 3+ (% T集團;35 - 50),或4+ (% T集團;> = 50)[4]。
統計分析:采用SPSS軟件(version 21.0;SPSS s.l.,馬德裏,西班牙)。統計分析前采用Shaipro Wilk檢驗檢驗數據是否正態。分類變量分析使用卡方檢驗或適當的費雪精確檢驗。所有統計檢驗均認為p<0.05為顯著性差異。所有統計顯著性檢驗均為雙尾檢驗。
對200名有艾滋病症狀的患者進行了研究。5例患者為兩性(2.5%)。已婚男性111人(56.9%)、女性53人(27.1%),未婚男性25人(12.8%)、女性6人(3%)。1 55例(79%)患者年齡在21-40歲,26-40歲最多。本研究中M: F比值為2.3:1。
CD4計數範圍為16-1033個細胞/µl。93例(46.5%)患者CD4計數<200細胞/µl, 40例(20%)患者CD4計數<100細胞/µl, 20例(10%)患者CD4計數<50細胞/µl,這是嚴重免疫抑製的主要人群。
在我們的研究人群中,最常見的主訴是口腔白斑(82%),體重減輕(79%),發燒(67%)和食欲不振(53%)。99.5%的患者有一次以上的抱怨。
143假絲酵母分離株經C.albicans(82.51%)是最常見的品種,其次是c . tropicalis(6.29%),C.krusei(4.89%),C.parapsilosis(3.49%),C.glabrata(2.79%)。
118例(82.5%)中檢測到磷脂酶活性。假絲酵母隔離。83.8%C.albicans表現出磷脂酶活性,與76%相比假絲酵母nonalbicans物種。100%C.parapsilosis> 89%C.tropicalis> 83.9%C.albicans>75%毛縷草>42.8%C.krusei顯示磷脂酶活性。++磷脂酶活性在60%時最高C.parapsilosis其次是50%C.glabrata, 48.3%的C.albicans和44.4%C.tropicalis而14.2%C.krusei表1所示。
99例(69.23%)檢測到蛋白酶活性。假絲酵母隔離。69.4%C.albicans相比之下產生的蛋白酶為68%假絲酵母nonalbicans.80%C.parapsilosis>77%熱帶草>75%C.glabrata> 61.1%C.albicans> 57.4%C.krusei表現出蛋白酶活性。蛋白酶活性(++)最高,為55.5%C.tropicalis, 29.6%的C.albicans, 25%的C.glabrataand14.2%C.krusei而(+)活性則占80%C.parapsilosis結果如表2所示。
平板試驗顯示粘附活性為82.6%假絲酵母從病人身上分離出來的。9.1%的分離株具有1+粘附活性,28.7%、14.7%、30.1%的分離株分別具有2+、3+、4+粘附活性。4+依從性活動見於C.albicans(32%),C.krusei(28.5%),C.glabrata(25%),C.parapsilosis(20%)和C.tropicalis(11%)。
83.8%的白色念珠菌產生生物膜,而76%Nonalbicans物種。83.8%C.albicans> 80%c . parapsilosis> 77.7%C.tropicalis>75% C.glabrata >71.4%c . krusei表現出粘附性活動。最大粘附活性(4+)為32%白念珠菌, 28.5%的c . krusei, 25%的c . glabrata, 20%的c . parapsilosis和11%c . tropicalis如表3所示。
生物膜,蛋白酶和磷脂酶的生產假絲酵母臨床標本分離種見表4。所有c . parapsilosis(100%)顯示磷脂酶活性c . tropicalis(89%),白念珠菌(83.9%),c . glabrata(75%)和c . krusei(42.7%),c . parapsilosis(80%)和c . tropicalis(77.5%)是最高的蛋白酶生產者,其次是c . glabrata(75%),白念珠菌(69.4%)和c . krusei(42.7%)。而依從性活動表現為白念珠菌(83.9%)和c . parapsilosis(80%)其次是c . tropicalis(77.7%)C.krusei(71.4%)。
表1:磷脂酶活性表現為假絲酵母隔離
磷脂酶活性Pz<1.00(陽性),Pz<0.7(較強毒性)
表2:所顯示的蛋白酶活性假絲酵母分離物(-)時不存在可見暈,(+)時可見蛋白水解局限於菌落周圍1-2 mm,(++)時蛋白水解區>距菌落邊緣2 mm
表3:堅持活動表現為假絲酵母隔離
4 +;強正,3+和2+;中度正,1+和(0);弱正或弱負。
表4:生物膜產生的不同假絲酵母物種
在口腔拭子中:C.albicans磷脂酶、蛋白酶和粘附活性分別為75%、61%、73%,熱帶苜蓿的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性分別為3.5%C.glabrata顯示1.8%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性C.parapsilosis磷脂酶、蛋白酶和粘附活性分別為3.5%、2.65%、2.65%C.krusei磷脂酶、蛋白酶和粘附活性分別為0.88%、0.88%、1.8%。
在痰樣本中C.albicans顯示出56%的磷脂酶、蛋白酶和61的粘附活性C.tropicalis磷脂酶、蛋白酶和粘附活性分別為8.7%。C.glabrata其中蛋白酶和粘附活性為4.35%C.parapsilosis中卻表現出4.35%的蛋白酶和粘附活性C.krusei磷脂酶陽性率僅為4.35%。
在尿液樣品中,熱帶甘草具有50%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性C.krusei磷脂酶、蛋白酶和粘附活性分別為50%。然而,在血液培養樣本中C.albicans磷脂酶和粘附活性分別為25%、50%。C.tropicalis顯示出25%的磷脂酶活性C.krusei磷脂酶、蛋白酶和粘附活性分別為25%。隻在糞便樣本中C.krusei產生100%的蛋白酶和粘附活性。圖1表示的磷脂酶,蛋白酶和生物膜假絲酵母物種。
所有的假絲酵母sp .表現出毒力活性。但各指標差異無統計學意義,僅磷脂酶活性受影響C.krusei顯示有統計學意義的值(p = 0.01).圖2顯示了CD4計數與不同級別的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性的相關性假絲酵母種蟲害隔離。CD4計數與粘附活性呈正相關,與磷脂酶、蛋白酶活性呈負相關假絲酵母種蟲害隔離。
的致病性假絲酵母分離株是由菌株的特性、宿主的免疫狀況和感染部位的局部條件共同決定的。的致病性C.albicans是一個複雜的過程,涉及到宿主的不同階段、定殖、粘附、對組織的侵襲和對細胞的損傷、細胞壁的組成以及毒素和蛋白水解酶的產生[11,12]。
假絲酵母是一種無性,二倍體,二態真菌,存在於人類和他們的環境中。假絲酵母生物體是共生體,作為病原體,中斷正常宿主防禦是必要的。一般危險因素假絲酵母感染包括免疫功能低下狀態、糖尿病和醫源性因素,如使用抗生素、留置裝置、靜脈用藥和高營養液體。念珠菌病已成為一種令人擔憂的機會性疾病,在越來越多的免疫功能低下、老年、接受長期抗菌和積極的癌症化療或接受侵入性手術和器官移植的患者中出現。
圖1:磷脂酶、蛋白酶和生物膜所產生假絲酵母物種
圖2:A)磷脂酶與CD4計數的相關性;B)蛋白酶與CD4計數的相關性;C)粘附與CD4計數的相關性。
白色念珠菌的磷脂酶和天冬氨酸蛋白酶被認為是重要的毒力因子[13],這些酶的缺失或表達降低可能表明其毒力較弱假絲酵母物種,當與假絲酵母這些酶表達較高的物種[14,15]。
天冬氨酸蛋白酶是由病原菌分泌的假絲酵母在體內在感染。蛋白酶在感染過程中發揮著許多特殊的功能,包括消化分子以獲取營養物質,消化或扭曲宿主細胞膜以促進粘附和組織入侵,消化宿主免疫係統的細胞和分子以避免或抵抗宿主的抗菌攻擊。來自香港的Gokce G et al.[16]和Wu et al.[4]早前報道過C.albicans已知來自HIV感染患者的分離物的蛋白水解性(100%)明顯高於來自HIV陰性個體的分離物(56%)。
在我們的研究中,蛋白酶的生產能力C.albicans(69.4%)幾乎與假絲酵母nonalbicans(68%)不像2011年土耳其的一項研究[17]報道的那樣C.albicans(89.7%)產生更多的蛋白酶假絲酵母non-albicans物種(25.8%),而來自南印度的工人在2011年[18]報告的蛋白酶生產能力為假絲酵母nonalbicans(50.45%)低於C.albicans(67.34%)。然而,2012年意大利[19]的一項研究報告稱48%C.albicans有沒有蛋白酶活性的時候假絲酵母nonalbicans不產生蛋白酶。
在我們的研究中80%C.parapsilosis> 77%C.tropicalis>75%C.glabrata> 61.1%C.albicans> 57.4%C.krusei表現出蛋白酶活性。蛋白酶活性(++)最高,為55.5%C.tropicalis, 29.6%的C.albicans, 25%的C.glabrata和14.2%C.krusei而80%C.parapsilosis顯示(+)活動。口腔拭子中白色球菌占61%,熱帶球菌占3.5%,2.65%C.parapsilosis, 1.8%的C.glabrata, 0.88%的C.krusei表現出蛋白酶活性。在痰分離物中也觀察到類似的蛋白酶活性,為56%C.albicans, 8.7%的C.tropicalis,白毛草和C.parapsilosis.而在尿液中各分離50%C.tropicalis而且C.krusei表現出更多的蛋白酶活性。在血液培養樣本中C.krusei蛋白酶活性為25%。在糞便樣本中全部C.krusei(100%)顯示蛋白酶活性。
磷脂酶的分泌C.albicans首先由Costa等人發現。[20]。C.albicans是唯一的假絲酵母已知能分泌磷脂酶的物種[10,21]。細胞外磷脂酶被認為通過溶解宿主細胞或改變其表麵特征來促進粘附和滲透,從而促進毒性。磷脂酶可增強宿主細胞膜的粘附並引起細胞膜的裂解。術語磷脂酶是指在甘油磷脂中具有水解一個或多個酯連接的能力的異構組酶。由於磷脂酶以膜磷脂為目標並消化這些成分,導致細胞裂解;[23]直接破壞和裂解宿主細胞被認為是促進微生物毒力的主要機製。在我們的研究中83.8%C.albicans產磷脂酶活性比較為76%假絲酵母nonalbicans.來自Mohandas V等[18]的工人也有46.93%C.albicans產磷脂酶42%以上假絲酵母nonalbicans證明C.albicans具有更高的細胞外磷脂酶活性。我們的研究結果也證實了2007年土耳其的Ibrahim et al.[22]和Gokce G[16]報道的磷脂酶產量為60.3%C.albicans相比於所有的負麵影響假絲酵母非白色的菌株。
根據Samaranayake et al.[10],磷脂酶的產生由白色念珠菌體外培養隨著高濃度的蔗糖和半乳糖而減少,在高濃度的葡萄糖中它被完全抑製。在臨床方麵,提高膳食糖的口服濃度可以抑製磷脂酶的形成,從而降低這種酵母的致病潛力。
在我們的研究中,100%棘球蚴>89%熱帶球菌>83.9%白色球菌>75%C.glabrata> 42.8%C.krusei顯示磷脂酶活性。++磷脂酶活性以60%最高(Pz <0.7)C.parapsilosis, 50%的C.glabrata, 48.3%的C.albicans和44.4%C.tropicalis相比之下,低的百分比C.krusei(14.2%)。以前的研究報告磷脂酶活性在30%至100%假絲酵母L分離自不同的患者群體和不同的部位[4,24]。Price et al.[24]報道稱,比例可能取決於站點;例如,磷脂酶活性已被發現在55%和30%假絲酵母分別從血液和尿液中分離到的物種,而在我們的血液培養和尿液樣本中,分別為75%和100%假絲酵母物種產生磷脂酶。在我們的患者中,84.7%的口服患者出現磷脂酶活性假絲酵母1998年來自孟買的Kothavede和panthaki[25]從口腔拭子中顯示出67.1%的磷脂酶活性,而來自斯裏蘭卡的一項研究[10]報告從口腔分離株中產生79%的磷脂酶。Ribeiro等人[26]對239例口腔和陰道進行了研究C.albicans從HIV陽性患者的菌株中發現,在定量上磷脂酶活性明顯高於HIV陰性個體。
兩份出版物都有記錄,[14]C.albicans呼吸道感染分離株產生的磷脂酶量高於血液分離株,而在我們的研究中,血液分離株產生的磷脂酶量高於呼吸道分離株,但由於我們的研究中血液分離株數量相對較少,因此不能得出明確的結論。這些數據表明,隔離部位C.albicans此外,患者的病情也可能是反映磷脂酶活性的重要因素。在我們的研究中,尿液樣品中磷脂酶的產量(100%)高於其他臨床樣品
生物膜和耐藥性的發展是一個複雜的多因素現象,仍有待充分闡明和理解。不同的機製可能是造成內阻的原因假絲酵母生物膜。其中包括:(i)生物膜內的高密度細胞;(ii)生物膜基質的影響;(iii)生長率下降和營養限製;(iv)抗性基因的表達,特別是那些編碼外排泵的基因;和(v)“持久”細胞[27]的存在。生物膜是微生物的集合,周圍環繞著它們分泌的黏液。生物膜被認為促進了感染的持續性。我們研究了生物膜假絲酵母OPC患者中HIV感染者的分離率為83.5%C.albicans和76%假絲酵母nonalbicans生產的生物膜。來自意大利的Sara Asticcioli在2007年報告了一個類似的發現假絲酵母nonalbicans產生的生物膜明顯少於致病的生物膜C.albicans與末端器官損傷率增加和比其他物種更高的歸因死亡率相關,相反,來自土耳其的Gokce G等人在2007年報道了11.8%的白色念藻和41.93%的白色念藻假絲酵母non-albicans菌株生物膜呈陽性。
來自英國的Hawser和Douglas[28]在白血病患者中也報道了傍apsilosis和c .C.glabrata產生生物膜的可能性明顯低於更具致病性C.albicans.在我們的研究中,83.8%C.albicans>77.7%C.tropicalis>75%C.glabrata> 71.4%C.krusei表現出粘附性活動。最大粘附活性(4+)為32%C.albicans, 28.5%的C.krusei, 25%的C.glabrata, 20%的棘孢杆菌,11%的熱帶棘孢杆菌。在口服分離株中:73%C.albicans, 3.5%的C.tropicalis, 2.65%的C.parapsilosis,各1.8%C.glabrata而且C.krusei而2013年浦那馬哈拉施特拉邦的一項關於艾滋病毒/艾滋病患者的研究[29]報告了59.6%C.albicans分離株和73.9%假絲酵母non-albicans口腔生物膜呈陽性。
痰樣本中也有61%C.albicans, 8.7%的C.tropicalis,各4.35%C.glabrata而且C.parapsilosis表現出粘附性活動。而在尿液樣本中,各占50%C.tropicalis在血培養樣品中,白色念珠菌占50%,克魯氏球菌占25%C.krusei在我們的研究中表現出粘附活性,而2012年印度卡納塔克邦的一項關於新生兒血流感染的研究報告了43.75%的glabrata, 37.5%的熱帶梭菌和6.25%的克魯塞梭菌粘附[17]。100%C.krusei從我們研究中產生的糞便顯示粘附活性
增強的生物膜可能是疾病延長和不良結果的獨立危險因素。本研究中生物膜的產生更多地與物種有關假絲酵母而不是感染部位。生物膜是一種特殊的特征假絲酵母與粘附性差異無關,但與生長緩慢有關。假絲酵母生物膜可能有助於淺表和全身性念珠菌病的發病機製,因為它們對抗真菌藥物具有眾所周知的耐藥性。在本研究中,我們使用含有高葡萄糖(8%)的SDB培養基,用於誘導生物膜的形成C.parapsilosis一些研究報道了分離株[30-32]。然而,其他研究表明,模擬TPN溶液中發現的高糖條件不會促進生物膜的產生C.albicans隔離。
在我們的研究中,所有的毒力標記都與其致病潛力有很好的相關性假絲酵母不同疾病實體的病因分離。本研究顯示的優勢假絲酵母parapsilosis而且白色念珠菌在不同的毒力活動中,假絲酵母parapsilosis最大磷脂酶產量與C.tropicalisC.albicans,C.glabrata而且C.krusei同時,C.parapsilosis伴隨著C.tropicalis蛋白酶產量最高的是C.glabrata、白色念珠菌和C.krusei.然而,最大的依從性活動出現在C.albicans緊隨其後的是C.parapsilosis.總人數假絲酵母白菌產生的蛋白酶、磷脂酶和生物膜的數量要多得多念珠菌非白色念珠菌產生這些毒力因子。生物膜的產生被認為是一個重要的部分白色念珠菌菌株的毒力活動,而非白色念珠菌似乎也具有其他機製來建立感染。然而,根據患者年齡和感染部位對菌株進行分組時,生物膜的產生沒有顯著差異。
所涉及的致病機製不同假絲酵母物種需要通過更多樣化的研究來更好地理解,這將允許更好地理解這些機會主義寄生蟲與其宿主的關係。此外,確定不同抗真菌藥物對生物膜設置的有效性,對於指導治療決策具有重要的臨床意義,這些治療決策可能會影響患有這些難以治療的感染的患者的結果假絲酵母物種的形成不是由單一因素決定的,而是由多種因素共同決定的,如蛋白酶、磷脂酶、生物膜的產生。
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文章類型:研究文章
引用:Kaur R, Goyal R, Dhakad MS, Bhalla P, Diwan R (2015) HIV/ AIDS患者毒力因子:蛋白酶、磷脂酶和生物膜的研究。J HIV艾滋病1(2):http://dx.doi。org/10.16966/2380 - 5536.110
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