摘要

通過比較不同表型和基於序列的生物形態方法對共受體使用的預測，建立合胞誘導(SI) HIV-1表型在垂直感染過程中對CCR5和CXCR4共受體使用的作用和變化。

研究了31株SI HIV-1分離株(12株來自急性期，19株來自慢性期)。僅依賴CXCR4 (X4)或同時依賴CXCR4和CCR5 (R5X4)的感染能力是通過對兩個細胞係統的再次感染來確定的:pha激活的PBMCs和GHOST共受體轉染細胞，必要時使用CXCR4受體阻阻劑。

在這兩種細胞係統中，共受體的使用差異顯著。在GHOST細胞上，95%的si分離株為雙向性(R5X4)。在PBMCs上，急性感染時獲得的菌株主要是R5X4(75%)，而70%的SI HIV-1慢性階段為X4。此外，采用4種基於V3環序列的算法對上述分離株進行R5或X4/R5X4變異(淨電荷、11/25規則、PSSM和gen2pheno)的分類。生物信息學算法僅將66%的SI分離株分類為X4。我們的研究表明，計算算法在預測si分離株的趨向性方麵是非常不準確的，特別是對於那些在初次感染時獲得的si分離株，因為其中一半被基於v3序列的表型預測算法錯誤地分類為R5變體。總之，SI變體共受體的使用可能會根據所使用的方法而有所不同。SI菌株在PBMCs上的向性測定可能更能反映病毒在體內的行為，因為我們使用的是天然病毒靶標。感染過程中的差異，如急性期雙r5x4回轉線的優勢和慢性感染中X4變異的流行，可能反映了兒童感染期間SI變異共受體使用的演變。我們還提供了強有力的證據表明，在使用CCR5阻滯劑之前，應仔細確定HIV-1的共受體使用情況，特別是在兒童感染中。

關鍵字

hiv - 1;Coreceptors;孩子們

簡介

HIV-1 CXCR4使用變體出現在近50%的慢性感染患者中[1,2]。在感染早期的HIV-1分離株中，約20%發現使用cxcr4的HIV-1毒株，已在成人和兒童中記錄在案[3-5]。研究表明，使用CXCR4的變異比僅使用CCR5共受體的病毒更具致病性，其出現與導致疾病進展的快速t細胞耗損有關[6-8]。在體外在表達CD4的MT-2細胞係中，X4/X4R5菌株誘導合胞體形成，而R5菌株不誘導合胞體形成⁺而不是CCR5受體[9]。因此，HIV-1的趨向性最初被分為SI(合胞誘導型)和NSI(非合胞誘導型)變異，分別等同於X4/X4R5和R5。雙向變異在共受體的使用上可能有不同的偏好，可進一步分為R5>X4 (CCR5偏好或雙- r) X4>R5 (CXCR4偏好或雙- x)和R5~X4[10-14]。

自CCR5小分子抑製劑作為抗逆轉錄病毒(ARV)藥物發展以來，對一種快速、可靠的向性測定方法的需求已變得至關重要。目前，Monogram Trofile生物檢測方法似乎已經達到了足夠的靈敏度和靈敏度，可以滿足臨床需要[15]。基於HIV-1 env序列的方法的預測準確性為71% - 91%[16-19]，並不能保證在治療中安全使用CCR5阻滯劑

在垂直傳播的早期階段，SI/CXCR4病毒的存在可能與兒童免疫發病機製特別相關，特別是在出生時，因為新生兒胸腺極其活躍，潛在的CXCR4靶細胞數量相對較高[12-14]。

HIV-1的趨同性主要由CCR5和CXCR4共受體結合決定，但SI變異的共受體使用隨感染時間的演變仍未得到解決[20,21]。

基於這些證據，我們的研究目的是調查SI變體在兒童感染的急性或慢性臨床階段的共受體使用是否不同，並評估一些最常用的基於v3環序列的生物信息學算法對HIV-1細胞取向的確定的準確性，以確保在將CCR5阻滯劑包括在ARV治療中時的安全治療處方。

方法

研究了人口

在阿根廷布宜諾斯艾利斯的“Garrahan兒科醫院”對39名HIV-1垂直感染兒童進行了隨訪，納入了這項研究。經機構倫理委員會同意，獲得其父母或法定監護人的知情同意。

根據HIV-1表型和取樣時的年齡對兒童進行分類:SI分離株來自12名急性/初級期(< 18個月)感染嬰兒和19名慢性感染兒童(>18個月)，而NSI分離株來自8名不同感染階段的患者作為對照。

從外周血單核細胞共培養中分離HIV-1

HIV-1是通過PBMC共培養分離出來的，正如之前艾滋病臨床試驗小組[22]所描述的那樣。簡單地說，用植物血凝素(PHA)(5µg/mL Difco Laboratories)預刺激HIV-1血清陰性獻血者的PBMCs 24 - 72小時，與患者的PBMCs以2 × 10的最終濃度共培養⁶細胞/毫升。每周用pha預刺激的HIV-1陰性PBMCs進行共培養，並在添加20%胎牛血清(FBS)、5 U/ml IL-2 (Sigma Aldrich)和10µg/ml慶大黴素(Gibco BRL Invitrogen)的RPMI 1640 (Gibco BRL, Invitrogen)培養基中保持28天。用商業檢測試劑盒(Vironostika HIV-1抗原，BioMérieux)每3天測定一次共培養上清的HIV-1 p24 Ag, p24+上清保存在-80°C下，以便進一步研究。

MT-2細胞上合胞誘導HIV-1分離株的測定

按照Japour等人[9]所描述的方法進行SI測定。96孔板，5 × 10加1000 pg p24(共培養上清)⁴MT-2細胞/孔的RPMI 1640添加10%胎牛血清和10µg/ml慶大黴素。SI原病毒分離株和cxcr4 -熱帶LAI實驗室適應株(NIH AIDS參比和試劑計劃)作為陽性對照，未添加病毒和有NSI分離株的井作為陰性對照。每個上清液分別進行四份檢測。每3天用光學顯微鏡觀察MT-2細胞合胞體形成情況，共28天。如Albert和Fenyo[23]所述，從沒有合胞體的培養物中收集的細胞進一步使用嵌套PCR分析HIV-1原病毒DNA，以確認或排除感染。此外，為了保證病毒接種物的傳染性，在2 × 10的孔中加入相同的病毒接種物進行平行對照試驗⁵來自HIV- 1血清陰性供體的pha刺激PBMC。測定所有孔的上清中p24 Ag的含量。當病毒接種物感染PBMCs，但在MT-2細胞中不能誘導合胞體形成且缺少HIV-1前病毒DNA時，該病毒分離物被歸類為NSI。一旦HIV-1的向性被確定，包含SI變體的MT-2上清保存在-80°C。由於CXCR4而不是CCR5在MT-2細胞表麵[24]上表達，因此隻能從MT-2感染的細胞上清中獲得HIV-1 X4和/或R5X4菌株。進一步的研究在兩個細胞係統(PBMCs和HIV-1共受體轉染的GHOST細胞係)上對X4和R5X4進行了表征和區分。

輔助受體在GHOST細胞上的使用測定

在表達CD4/CCR5、CD4/CXCR4或僅表達CD4受體的GHOST細胞上進一步分析SI HIV-1變異體共受體的使用情況。病毒感染如Vodrös和Fenyo在2001年[25]所述。GHOST細胞係(由Dr. H. Salomon, INBIRS提供)在含有10%胎牛血清和抗生素的DMEM培養基(Hyclone, Byodinamics)中保存。500年tcid₅₀用於感染1.5 × 10⁵細胞。采用熒光顯微鏡和上清p24 Ag測定評價感染情況。在所有病例中，R5-tropic (HIV-1_落下帷幕)和X4-tropic (HIV-1型)_賴/PBMC)實驗室適應菌株作為共受體使用的對照。通過添加特異性CXCR4抑製劑AMD3100(10µg/ml)來確認CXCR4的使用。根據對GHOST細胞的感染性，將病毒分離株分為:R5，僅感染GHOST-CCR5細胞;雙R(R5>X4)對CCR5表達細胞的感染性高於對CXCR4表達細胞的感染性;R5X4(雙R5~X4)對GHOST-CCR5和GHOST-CXCR4細胞係具有相似的感染性，雙X(X4>R5)對CXCR4表達細胞的感染性高於對CCR5表達細胞的感染性;或X4僅感染CHOST-CXCR4細胞的分離株。

在外周血單個核細胞上測試SI變體的共受體使用

SI HIV-1亞型分為X4和R5X4亞型，也可通過感染PHA激活的PBMCs實現，無論CXCR4是否堵塞。將三名HIV-1陰性獻血者的PBMC與AMD-3100在4℃下孵育2小時，然後用500 TCID感染₅₀SI的變體。為了測試阻滯劑的效率，還用R5 (Bal)和X4 (LAI)菌株挑戰處理過的細胞。此外，從原代細胞共培養中分離的nsi菌株作為r5陽性對照進行了檢測。感染後7天和14天，檢測培養上清中p24 Ag含量。如果在amd -3100處理的pbmc中檢測不到p24，則SI菌株被認為是X4變體。相反，如果病毒可以恢複，SI病毒分離物被認為是R5X4變異。每個SI變異都進行了三次重複試驗，並在沒有AMD-3100的情況下評估分離株的感染能力。

HIV-1基因型的V3序列分析和病毒向性測定

使用PureLink從50 μ L不同細胞係統的無細胞病毒上清液中提取RNA^TM病毒RNA/DNA迷你試劑盒(Invitrogen公司^TM(美國卡爾斯班德)診斷係統)。用RT-PCR得到的cDNA作為模板，在巢式PCR中得到一個跨越V3到V5區域的片段envDelwart[26]描述的基因。使用DYEnamic ET終止循環測序試劑盒(Amersham Bioscience, England)和ABI PRISM 310自動測序儀對PCR擴增子進行純化和直接測序。與洛斯阿拉莫斯數據庫中的子類型參考序列對齊(可在URL: www獲得)。hiv-web.lan .gov)使用Clustal X[27]生成，並使用BioEdit版本5.0.9[28]編輯，以進行目視檢查和手動校正

為了評估對HIV向性的預測，基於HIV-1- v3 -loop序列測試了四種不同的生物信息學方法:

淨收費規則:V3環的淨電荷≥+5對應CXCR4共受體的使用，而淨電荷<+5對應CCR5共受體的使用[29]。

11/25規則:在V3環的第11和/或25號密碼子上帶有正電荷氨基酸的序列被歸類為使用cxcr4的變體。

位置特定評分矩陣:PSSM使用背景遺傳變異作為基線比較，以方便比較序列片段的殘基和已知具有所需屬性的一組對齊序列的殘基。PSSMX4/R5是用X4和R5數據訓練的PSSM, PSSMSI/NSI是用SI和NSI應變訓練的PSSM。數據可從以下網站獲取:http://indra.mullins.microbiol。washington.edu/webpssm/[30]。

Geno2Phen:基於統計學習的一種方法叫做支持向量機(SVM)。對於本研究，默認假陽性率(FPR)為0.1，以產生約90%的特異性(http://www.geno2pheno.org)。該算法的最新版本還開發了包括臨床數據(CD4%，序列歧義數，宿主CCR5Δ32雜合性，插入/刪除的存在)作為輸入變量[31]。但由於該模型是基於成人人群的數據，因此不適用於兒童人群，主要原因是CD4+ T細胞數量的差異。

統計分析

為了比較V3環網電荷和PSSM對X4和R5X4變量獲得的值，我們使用Wilcoxon-Mann-Whitney秩和檢驗(StatXact 3.0)。所有病例均采用雙側檢驗，顯著性水平為0.05。

結果

根據兒童感染的階段確定SI HIV-1分離株共受體使用的表型

為了研究SI HIV-1變異體在不同臨床感染階段的共受體使用是否不同，對一組攜帶SI HIV-1變異體的垂直感染兒童進行了評估。MT-2上清液(SI病毒庫)在兩個不同的細胞係統上被進一步分類為X4或R5X4。31株SI分離株在PBMCs上進行了測試，其中24株也在GHOST細胞麵板上進行了評估，如方法中所述。

pbmc上的共受體使用:在存在或不存在CXCR4阻斷劑AMD-3100的情況下，通過感染PBMCs來評估31種SI變體的共受體使用情況。其中隻有14株(48%)為雙嗜性，其餘17株(52%)僅使用X4共受體(表1)。通過這種培養方法，感染早期的SI變異似乎主要為R5X4變異，而從慢性感染患者分離的SI變異大部分僅使用CXCR4共受體(p<0.01)(表2)。

共受體在轉染的GHOST細胞係上的使用:在上一節中描述的31個si分離株中的24個也在GHOST細胞上進行了測試。其中8例來自急性感染期的嬰兒，16例來自慢性感染期的兒童。另外，8株來自不同感染階段的NSI病毒分離株作為R5對照。如表1和表3所示，近80%(19/24)的SI菌株不明顯地使用CCR5或CXCR4受體，且在感染早期與感染晚期無差異分布:分別為75%和82%(表3)。因此，在GHOST細胞係上評估的SI變體主要表現為雙R5X4性(表1)。值得注意的是，在兩個測試的細胞係統中，SI變體的共受體使用存在明顯差異，特別是在感染早期獲得的SI分離株。

在其餘5株分離株中，3株(#371、#064和#584)被分類為X4。值得注意的是，當在GHOST轉染細胞上測試時，後三例病例的最初PBMC共培養上清攜帶混合的R5和X4變體。令人驚訝的是，剩下的兩個SI分離株(#526和#184)在GHOST轉染的細胞上僅表現為R5變體，盡管它們之前是在隻攜帶CXCR4共受體的感染MT-2細胞上選擇的。因此，測試的後兩個SI變體被認為是R5X4雙向性的。這些觀察結果支持了R5X4雙熱帶變異在使用CXCR4作為共受體時比使用CCR5效率低的觀點。此外，MT-2細胞檢測似乎比GHOST-CXCR4轉染細胞更有效地檢測低水平的SI菌株或對CXCR4親和力較低的變異[32,33]。

SI病毒傳染性的半定量分析(相對於HIV-1)_賴/ PBMC)。我們觀察到，雙嗜性病毒是一個異質群體，具有不同的共受體親和力(表1和表3)，這也取決於感染階段。根據Huang等人2007年提出的分類，[10]在急性期隻有一個(# 604)雙R或R5X4外殼和一個(# 075)雙X或R5X4其餘4株雙熱帶分離株均感染兩細胞係(R5=X4)。另一方麵，在慢性階段，13株對偶分離株中有4株表現出對CXCR4共受體的偏好，被認為是對偶X (R5X4)。

基於Env-V3環序列的共受體使用預測

我們進一步評估了R5、X4和雙R5X4變異病毒向性預測的生物信息算法的準確性，這些變異使用PBMC試驗進行分類，並被認為是病毒向性的參考(表4)。從MT-2細胞上清中獲得的24個SI變異和之前在兩個細胞係統上測試的5個NSI病毒分離物被分析和比較。V3循環的直接序列如表4所示。使用的生物信息算法包括:V3-loop淨電荷、“11/25規則”、PSSM和基因2pheno(表4)。

V3環淨電荷的計算方法是用帶負電荷的氨基酸[D和E]的數量減去帶正電荷的氨基酸[K和R][29]的數量。X4和R5X4變異之和的SI病毒的平均±SD淨電荷為6.62±1.28，顯著高於NSI變異序列的5.2±0.45 (p= 0.019)。而X4變異株(6.8±1.32)與R5X4雙向變異株(6.33±1.5)的淨電荷比較差異不顯著。盡管SI變異有隨著感染時間增加淨電荷的趨勢，但它們在統計學上沒有差異。

“11/25規則”將攜帶帶正電荷的氨基酸、賴氨酸(K)或精氨酸(R)在V3環的11和/或25位的病毒分類為cxcr4使用。如表4所示，雖然所研究的所有病毒分離株都被選為SI變異株(n=24)，但隻有16株含有11或25位的堿性氨基酸。在初次感染時，8個SI變異中隻有3個(37%)攜帶11或25號氨基酸(#075，#507和#051)，兩個位置都沒有。在16株來自感染晚期的SI分離物中，有13株在11/25位含有堿性氨基酸，其中3株(#034、#037和#064)同時存在。其餘三種SI病毒在11/25的任何位置都不攜帶堿性氨基酸，與作為對照分析的五種NSI分離株相似。這些結果表明，11/25規則對早期感染的SI分離株的大量(基於群體的)序列預測CXCR4使用的敏感性較低，而對感染晚期的SI分離株的敏感性為81%，相對可靠。另一方麵，X4和R5X4之間11/25位基本氨基酸的頻率沒有差異。

基於生物信息學的基因型預測因子，如PSSM (PSSM)_X4-R5或PSSM_SI-NSI)和gen2pheno (G2P)[30,31]在同一組SI樣品上進行了測試。在24個SI中envPSSM和G2P分別為17和20倍X4(表4)。這兩種算法在預測HIV-1原發感染分離株的病毒趨向性方麵均不充分(PSSM為50%，G2P為62%，n=8)。在慢性階段，這些算法與SI表型的一致性分別為81%和93%。正如預期的那樣，在不同的PSSM矩陣PSSM之間沒有觀察到差異_X4-R5或PSSM_SI-NSI．因此，使用11/25規則、PSSM和g2p算法得到的結果在預測SI株感染後期HIV-1共受體使用方麵是相似的，而且相對有效，但不足以預測早期的病毒趨向性。所有env利用PSSM和G2P算法將NSI分離株的序列分類為R5。

同時評價了X4和Dual X4R5基因型的差異。HIV-1 X4變異的PSSM得分顯著高於雙r5x4變異的PSSM得分，中位數為-1.55 (IQR為-5.98 ~ -0.13)，中位數為- 6210 (IQR為-8.325 ~ -4.415)，p值為0.0253。因此，PSSM評分可能有助於預測SI變異為R5X4或X4的概率。相反，基因- pheno模型不能預測這兩個SI變體之間的差異。

表1:SI HIV-1分離株在不同細胞係統上共受體使用的表型測定。

a GHOST: GHOST- ccr5和GHOST- cxcr4細胞的感染性水平;(+/-)偶然，(+)低，(++)中等和(+++)高根據黃等。2007[10]。R5X4:雙R (R5>X4)組包括對表達CCR5的細胞感染性高於表達CXCR4的病毒株。R5X4:雙(R5=X4)組定義為對GHOST- ccr5和GHOST- CXCR4兩種細胞係具有相似的感染性的病毒分離株。R5X4: Dual X (X4>R5)組包括對表達CXCR4細胞的感染性高於表達CCR5細胞的病毒分離株。b PBMCs:(+) p24-Ag陽性。*使用特定的CXCR4抑製劑AMD3100 (10ug/ml)對病毒感染的抑製證實了CXCR4的使用。ND:不確定

表5總結了基於的四種基因型算法的靈敏度EnvSI HIV-1 V3循環。淨電荷、11/25規則、PSSM和gengen2pheno算法不適合預測兒童原發性感染SI HIV-1分離株的共受體使用情況。在慢性感染階段觀察到培養和鑒定X4或雙熱帶變異的基因型方法之間的最高一致性。

感染階段	N	R5X4	X4
急性感染	12 (100%)	9 (75%)	3 (25%)
慢性感染	19 (100%)	5 (26%)	14 (74%)

表2:在外周血單個核細胞上檢測SI HIV-1變異體的共受體使用

R5X4:當感染後PBMC有上清p24+時，無論CXCR4阻滯劑AMD-3100是否存在，SI變異被認為是雙向性的。

X4:當存在CXCR4阻滯劑AMD-3100的感染後PBMC上清中p24無法檢測到，但在沒有阻滯劑的情況下可檢測到時，SI變體被認為是X4菌株。

為了排除細胞培養中可能的病毒選擇，我們進一步比較了從不同來源恢複的SI HIV-1種群。我們分析了8例SI HIV-1株患者的原代培養上清液(SN-PBMC)和MT-2培養上清液(SN-MT-2)中的病毒V3環序列。在4例(#051、#371、#504和#584)中，V3循環序列也直接從感染的GHOST細胞係上清中獲得。如表6所示，所有來自MT-2細胞上清液和原代PBMC共培養的SI V3環序列都是相同的，包括4例中3例來自轉染的GHOST細胞係上清液。從感染的GHOST-CXCR4細胞中獲得的不一致序列(#051)顯示第7 (N/T)和第13 (Q/R)位氨基酸殘基發生變化，導致淨電荷增加，與來自同一患者的PBMC、MT-2和GHOST-CCR5細胞上清的其他序列相比。除最後一例外，在通過不同類型細胞的連續傳代中，在V3環上未檢測到顯著的氨基酸序列變化。

階段的 感染	總計	R5		R5X4		X4
	n		R5X4	R5X4	R5X4
急性 感染	8	1	1	4	1	1
（％）	One hundred.	12.5		75		12.5
慢性 感染	16	1	-	9	4	2
（％）	One hundred.	6		82		12

表3:基於表達CCR5和cxcr4的GHOST細胞傳染性的SI HIV-1分離株的分類

R5:當病毒隻分離感染的GHOST-CCR5細胞時。R5X4:雙R (R5>X4)組包括感染兩種細胞類型的病毒分離株，但對GHOST-CCR5細胞的感染性高於GHOST-CXCR4。R5X4:雙(R5=X4)組定義為對GHOST-CCR5和GHOST-CXCR4細胞株具有相似的感染性的病毒分離株。R5X4:雙X (X4>R5)組包括對表達CXCR4的GHOST細胞比對GHOST- CCR5具有更高的感染性的病毒分離株。X4:SI病毒分離出僅感染GHOST-CXCR4細胞的病毒。

討論

SI HIV-1變異可分為X4或X4R5，這取決於用於評估病毒趨向性的細胞係統。在GHOST細胞係SI HIV-1中，兒童感染一直以R5X4雙向性為主。然而，當對PBMCs進行評估時，急性感染的SI分離株主要是R5X4雙向性，而慢性感染的SI分離株主要是X4型。在PBMCs中觀察到的SI共受體在不同感染時間的使用差異可能反映了從雙r5x4到X4的病毒嗜性進化，支持了X4/SI變體可能是從NSI菌株而不是少數傳播人群進化而來的觀點。

本研究中比較的所有方法在確定慢性感染患者分離株的HIV向性(以MT-2感染為金標準方法)方麵都是可靠的，盡管生物信息學算法在預測急性感染HIV變異的向性方麵的敏感性非常低(37-62%)。本研究還表明，在感染的MT-2細胞上選擇SI HIV-1變異，然後進一步評估共受體的使用情況，可能會區分混合R5/X4和雙向R5X4變異，這些信息無法從基因型計算算法獲得。

我們觀察到，在GHOST轉染細胞株中表現為R5X4雙向株的SI HIV-1變異株中，33%的原發性感染分離株和77%的慢性感染分離株在PBMCs上測試時僅為X4變異株。雖然PBMC表達表麵CCR5分子，但在GHOST細胞上具有雙向性的一些SI變體似乎無法感染PBMCs在體外CXCR4阻滯劑的存在。與Yi等人[20]一致的是，R5X4雙熱帶菌株無法感染CCR5+淋巴細胞，這增加了與CCR5相互作用效率低於R5菌株的可能性。與我們的發現相反，Toma等人[11]發現在細胞係和PBMC檢測中雙熱帶HIV-1病毒CCR5共受體的使用普遍一致。我們的結果與Toma等人的結果之間的差異可能是由於所使用的細胞係統的差異。然而，正如我們的研究結果所表明的，Toma等人[11]得出結論，雙病毒在使用CXCR4和CCR5進行感染的能力上存在很大差異。

由於淋巴細胞和巨噬細胞是HIV-1的主要靶細胞，我們有理由認為SI的變異具有明顯的趨向性在活的有機體內可能比在GHOST細胞中更接近於在pbmc中獲得的。

先前Glushakova等人[34]已經描述了R5X4病毒共受體使用的異質性，而Huang等人[33]通過對HIV-1的分子分析進一步證實了這一點env[33]。然而，在GHOST細胞中觀察到的伴受體依賴性感染能力的差異不能在pbmc上複製。根據我們的研究，在兩個細胞係統中所獲得的共受體使用信息可能是互補的，因為SI HIV-1變體被GHOST細胞分類為R5或R5X4，在PBMC係統中表現為R5X4而雙熱帶變異被認為是R5X4或X4在GHOST細胞上，表現為X4PBMCs。因此，SI變異體的共受體向性可能隨著感染時間的推移而發生進化變化R5或R5X4,R5X4,R5X4來X4證實了Glushakova等人在1999年[34]表達的概念，並認為R5X4病毒代表了從R5到X4的連續進化階段。盡管該方法耗時，但之前從感染的MT-2細胞中選擇的SI變異可以證明SI上清液是由R5和X4變異的混合種群組成的，還是實際上是R5X4雙熱帶菌株。在後一種變異中，使用GHOST細胞係統的評估提供了有關共受體使用效率的信息，這可能對進一步實施抗逆轉錄病毒共受體阻滯劑治療有用。

目前針對病毒共受體的抗逆轉錄病毒藥物的可用性突出表明，在給藥前需要快速和高精度地檢測HIV-1變體的共受體傾向。Trofile測定[33]的方法envV3環基因序列[29-31]目前已被美國疾病控製與預防中心(CDC)批準用於HIV-1 X4或R5X4變體的篩選。由於用病毒存貯物測試的MT-2細胞試驗與Trofile試驗[33]有98%的一致性，我們在MT-2細胞上所做的研究可以被認為幾乎與Trofile試驗一樣準確。病毒向性預測的敏感性因所使用的預測方法的不同而有很大差異。通過基於V3循環的生物信息學方法env基因序列是最簡單和最快的，但預測準確率很低，在71 - 91%之間[16,17,35]。我們使用四種最常用的生物信息學算法對SI變異的V3環進行了研究，發現在急性和慢性感染階段分離的SI變異的結果存在顯著差異。雖然觀察到使用兒童感染慢性階段序列的表型和基因型方法之間具有可接受的一致性，但生物信息學算法未能預測從急性感染患者中分離出的X4變異，這表明可能獲得的突變隨著感染時間的推移而改善CXCR4的使用。另一方麵，四種算法的準確率存在顯著差異。當SI和cxcr4的變異來自慢性階段時，G2P的一致性最高，接近94%，而在早期原發性感染分離株上使用G2P時，則下降到63%。PSSM和11/25規則幾乎相似，在慢性感染階段SI變異的敏感性為81%，在急性感染階段分別降低到50%和38%。SI變異的淨電荷靈敏度最低。因此，表型預測的生物信息學算法不適用於預測兒童感染，特別是急性垂直感染中HIV-1共受體的使用。由於這些算法是基於從成人感染個體分離株中獲得的序列開發的，因此在非垂直獲得性感染的情況下，它們可能會有更好的結果，盡管這需要得到證實。這也與確定HIV-1 X4和R5X4雙嗜菌株是否在感染期間進化並改變其共受體親和力和共受體使用能力有關。 If it is the case, there would be implications for CCR5-blocker therapy administration. In addition, as some determinants for CXCR4 usage that reside outside the V3 loop may play an important evolutionary role as HIV-1 variants evolve from R5 to X4-tropic, the inclusion of information of the entireenv基因區域可能改善基於序列的生物信息學方法對基因型共受體使用的預測[10,36]。

表4:SI HIV-1分離株病毒向性表型和基因型測定的比較

感染階段n	淨電荷(%)	11/25 (%)	PSSM (%)	G2F (%)
急性感染8	62年,5	37	50	62年,5
慢性感染16	87年,5	81	81	94

表5:4種基於V3基因型的算法對兒童感染不同階段獲得的SI HIV-1變異的敏感性比較所有檢測的SI分離株(n=24)均來自MT-2細胞上清。

不同的HIV-1亞型使用CCR5或CXCR4共受體的能力不同。在M型病毒中，與其他亞型相比，亞型D和CRF01_AE顯示使用cxcr4的變體的患病率更高[10,37]，盡管這一發現仍有爭議[35]。在我們的人群中，BF重組株幾乎占循環株[38]的85%。Delgado等人[39]最近證明了GHOST-cell-culture表型分析與基於env在被研究的一小群F亞型HIV毒株中序列非常低。需要進一步的研究來評估V3環序列的亞型特異性差異是否會影響HIV的向性。

HIV-1的生物多樣性和病毒隨感染時間的進化是HIV-1免疫發病的兩個關鍵因素。需要注意的是，共感受器的使用在體外不一定能預測病毒途徑在活的有機體內這一事實可能會導致某些抗逆轉錄病毒藥物作為CCR5阻滯劑的錯誤使用。SI HIV-1表型共受體使用隨感染時間的差異，以及根據使用方法預測HIV-1共受體使用的差異，需要進一步和更深入的研究，以確保作為抗逆轉錄病毒治療的安全有效的共受體阻滯劑的實施。

表6:SI HIV-1突變體原代培養上清(SN-PBMC)、MT-2培養上清(SN-MT-2)和GHOST培養上清(SN-GX4和SN-GR5) V3環氨基酸序列比較

致謝

作者感謝María del Cármen Galvez夫人提供的出色技術援助。該研究由CONICET通過PIP 6057-2004和anccyt通過PICT/BID 25830-2004支持。

參考文獻

1. Tersmette M, de Goede RE, Al BJ, Winkel IN, Gruters RA，等(1988)人類免疫缺陷病毒分離株的不同合胞誘導能力:在獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)和艾滋病相關複合體患者中頻繁檢測到合胞誘導分離株。病毒學報62:2026-2032。［Ref。］
2. Poveda E, Briz V, Quiñones-Mateu M, Soriano V (2006) HIV向性:診斷工具及其對疾病進展和進入抑製劑治療的影響。艾滋病20:1359 - 1367。［Ref。］
3. Brumme ZL, Goodrich J, Mayer HB, Brumme CJ, Henrick BM等(2005)HIV-1在抗逆轉錄病毒初用藥人群中的分子和臨床流行病學研究。中國傳染病雜誌19(4):469 -474。［Ref。］
4. de Mendoza C, Rodriguez C, García F, Eiros JM, Ruíz L, et al.(2007)最近感染HIV-1的患者中X4熱帶病毒的流行及與耐藥性傳播缺乏關聯。抗菌化學雜誌59:698-704。［Ref。］
5. Crudeli CM, Aulicino PC, Rocco CA, Bologna R, Mangano A，等(2012)垂直感染兒童HIV-1 SI/ cxcr4病毒早期檢測的相關性。艾滋病Res Hum逆轉錄病毒28:685- 692。［Ref。］
6. Koot M, Keet IP, Vos AH, de Goede RE, Roos MT，等(1993)HIV-1合胞細胞誘導表型對CD4+細胞耗損率和發展為艾滋病的預後價值。醫學實習118:681-688。［Ref。］
7. Richman D, Bozzette SA(1994)人類免疫缺陷病毒合胞誘導表型對疾病進展的影響。傳染病雜誌169:968-974。［Ref。］
8. Kopka J, Batalla M, Mangano A, Mecikovsky D, Bologna R，等(2002)病毒表型與兒童HIV-1原發性感染早期艾滋病結局的相關性。兒科Res 52: 475-480。［Ref。］
9. Japour AJ, fisussa, Arduino JM, Mayers DL, Reichelderfer PS，等(1994)臨床人類免疫缺陷病毒1型分離株合胞誘導表型的標準化微量滴度測定。中華微生物學雜誌32:2291-2294。［Ref。］
10. 黃偉，Eshleman SH, Toma J, Fransen S, Stawiski E，等(2007)人類免疫缺陷病毒1型亞型D的共受體趨向性:CXCR4趨向性的高流行率和病毒群體的異質性組成。病毒學報:7885-7893。［Ref。］
11. Toma J, Whitcomb JM, Petropoulos CJ, Huang W(2010)雙熱帶HIV 1型分離株在使用CCR5和CXCR4共受體方麵差異顯著。艾滋病24:2181 - 2186。［Ref。］
12. Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, Gage EA, Massey JM，等(1998)HIV感染治療期間胸腺功能隨年齡的變化。自然396:690 - 695。［Ref。］
13. 高頓G, Scobie J, Rosenzweig M (1997) HIV-1與胸腺。艾滋病11:403 - 414。［Ref。］
14. Correa R, Munoz-Fernandez MA(2001)病毒表型影響hiv -1感染兒童胸腺新T細胞的產生。艾滋病15:1959 - 1963。［Ref。］
15. Wilkin TJ, Goetz MB, Leduc R, Skowron G, Su Z，等。(2011)用增強敏感性的表型試驗重新分析hiv -1感染成人的共受體向性。臨床感染報告52:925- 928。[Ref。］
16. Low AJ, Dong W, Chan D, Sing T, Swanstrom R，等(2007)目前的V3基因分型算法不足以預測臨床分離株中X4共受體的使用。艾滋病21:17-24。［Ref。］
17. Garrido C, Roulet V, Chueca N, Poveda E, Aguilera A，等(2008)評價8種不同的生物信息學工具預測不同人類免疫缺陷病毒1型亞型的病毒趨向性。中華微生物學雜誌46:887-891。［Ref。］
18. Recordon-Pinson P, Soulié C, Flandre P, Descamps D, Lazrek M，等。(2010)HIV-1共受體使用的基因型預測與表型測定的比較及其與馬拉威roc病毒學應答的相關性:ANRS基因向性研究。抗菌藥物化學試劑54:3335-3340。［Ref。］
19. Trabaud MA, Icard V, Scholtes C, Perpoint T, Koffi J，等(2012)通過不同基因型算法和表型分析預測HIV-1共受體使用的不一致性:與一致性預測相關的中間特征。中國醫學病毒學雜誌84:402-413。［Ref。］
20. Yi Y, Shaheen F, Collman RG(2005) 1型人類免疫缺陷病毒R5X4分離株優先使用CXCR4感染原發性淋巴細胞。中國生物技術學報(英文版)［Ref。］
21. 古迪諾MM，科爾曼RG (2006) HIV-1共受體偏好不同於靶細胞傾向:定義病毒表型的雙參數命名法。白細胞生物學雜誌80:965-972 [Ref。］
22. Hollinger FB, Bremer JW, Myers LE, Gold JW, Mc Quay L(1992)敏感的人類免疫缺陷病毒共培養程序的標準化和艾滋病臨床試驗小組多中心質量保證方案的建立。中華臨床微生物學雜誌30:1787-1794。［Ref。］
23. Albert J, Fenyo EM(1990)用嵌套引物聚合酶鏈反應在臨床標本中檢測1型人類免疫缺陷病毒的簡單、敏感和特異性。中華微生物學雜誌28:1560-1564。［Ref。］
24. Moore JP, Kitchen SG, Pugach P, Zack JA (2004) CCR5和CXCR4共受體——了解人類免疫缺陷病毒1型感染的傳播和發病機製的關鍵。艾滋病Res Hum逆轉錄病毒20:111-126。[Ref。］
25. Vödrös D, Fenyö EM(2001)用GHOST(3)細胞試驗定量評價HIV和SIV共受體的使用。方法Mol Biol 304: 333—342。［Ref。］
26. Delwart EL, Herring B, Rodrigo AG, Mullins JI(1995)使用異質雙工遷移試驗對人類免疫缺陷病毒進行遺傳分型。PCR方法應用4:S202-S216。［Ref。］
27. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997) CLUSTAL_X窗口界麵:由質量分析工具輔助的多序列對齊的靈活策略。核酸Res 25: 4876-4882。［Ref。］
28. BioEdit: Windows 95/98/NT上的一個用戶友好的生物序列比對編輯器和分析程序。核酸信號素41:95-98。［Ref。］
29. Fouchier RA, Groenink M, Kootstra NA, Tersmette M, Huisman HG，等(1992)人類免疫缺陷病毒1gp120型分子第三變量域的表型相關序列變異。病毒學報(英文版):3183-3187。［Ref。］
30. Jensen MA, Li FS, van ' t Wout AB, Nickle DC, Shriner D，等(2003)通過HIV 1型env V3環序列的基序分析改進共受體使用預測和R5到X4過渡的基因型監測。中國病毒學報(英文版):13376-13388。［Ref。］
31. Lengauer T, Sander O, Sierra S, Thielen A, Kaiser R (2007) HIV共受體使用的生物信息學預測。生物技術25:1407 -1410。［Ref。］
32. Lee B, Sharron M, Montaner LJ, Weissman D, Doms RW(1999)淋巴細胞亞群、樹突狀細胞和差異條件單核細胞衍生巨噬細胞上CD4、CCR5和CXCR4水平的量化。PNAS 96: 5215 - 5220。［Ref。］
33. Coakley E, Reeves JD, Huang W, Mangas-Ruiz M, Maurer I，等(2009)通過Trofile和MT-2測定臨床樣本中人類免疫缺陷病毒1型向性特征的比較。抗微生物劑化學試劑53:4686-4693。［Ref。］
34. Glushakova S, Yi Y, Grivel JC, Singh A, school D，等(1999)雙嗜性HIV- 1在體外人淋巴組織中的優先共受體利用和細胞病變。J clinin投資104:R7-R11。［Ref。］
35. 黃偉，Toma J, Fransen S, Stawiski E, Reeves JD，等(2008)人類免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp41跨膜亞基的氨基酸取代可影響共受體向性。J病毒學報82:5584-5593。［Ref。］
36. Pastore C, Nedellec R, Ramos A, Pontow S, Ratner L，等(2006)人類免疫缺陷病毒1型共受體切換:V1/V2適應度獲得突變補償V3適應度喪失突變。病毒學報80:750-758。［Ref。］
37. Frange P, Chaix ML, Raymond S, Galimand J, Deveau C等。(2010)原發性非b亞型HIV-1感染患者中使用cxcr4病毒的發生率較低。中華臨床微生物學雜誌48:3487-3491。［Ref。］
38. Aulicino PC, Bello G, Guimaraes ML, Ruchansky D, Rocco C，等(2011)對阿根廷垂直感染兒童HIV-1 BF1重組菌株進行縱向分析，發現CRF12_BF pol基因馬賽克模式減少，BF獨特重組形式高度多樣化。感染基因變種11:349-357。［Ref。］
39. Delgado E, Fernández-García A, Vega Y, Cuevas T, Pinilla M，等。(2012)評價基因型向性預測試驗與不同亞型HIV-1原株體外共受體使用的比較。J抗菌化學雜誌67:25-31。［Ref。］

在此下載臨時PDF

條信息

文章類型:研究文章

引用:Crudeli CM, Corró G, Rocco CA, Beltramone N, Marino SA，等(2015)兒童感染過程中合胞誘導- HIV-1分離物的共受體使用取決於靶細胞和進化。J HIV艾滋病卷1.1:http://dx.doi.org/10.16966/2380-5536.102

版權:©2015 cruudeli CM等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2015年3月13日,

接受日期:2015年4月27日,

發表日期:2015年5月01。