摘要

核糖體分析(RP)是一種在特定時間對核糖體所占據的mRNA區域進行測序的技術。這項新發明的技術對於我們對生物密碼子使用偏差現象的更深入的理解已經得到了很好的評價。除了常用的基因表達信息，如微陣列和RNA測序，RP還可以提供編碼序列中核糖體速度的信息。這項技術已經幫助科學家們識別了許多非規範的翻譯起始位點，暫停了編碼序列中的事件，並停止了在翻譯水平上有助於基因表達的密碼子通讀。在這篇綜述中，RP方法，結果和軟件包可用的數據分析進行了討論。

關鍵字

RNA序列;核糖體;編碼;RP方法

簡介

分子生物學的中心信條是，DNA中包含的遺傳信息被轉錄到信使RNA (mRNA)，信使RNA被翻譯成多肽鏈，折疊成功能蛋白[1]。與細胞內的DNA不同，轉錄組根據細胞的需要而變化。因此，通過分析整個轉錄本來研究基因表達可以為了解細胞內基因的時空調控提供重要的見解。微陣列和RNA測序(RNA-seq)是兩種廣泛用於分析全基因組轉錄本豐度的技術。值得注意的是，基因表達的調控既發生在轉錄水平，也發生在轉錄/翻譯後水平。後者不能通過上述兩種方法來確定。因此，為了區分mRNA分子的哪個區域參與了主動翻譯，最近發展了一種新的技術，稱為核糖體分析(RP)。RP被定義為核糖體在翻譯過程中在特定時間占據的mRNA上的核苷酸的基因組範圍的映射。通常，多聚體分析被用來區分參與主動翻譯的mRNA分子和非翻譯的mRNA分子。但是多聚體譜分析無法回答以下幾個問題:(a)在翻譯過程中核糖體的速度在mRNA上是一致的還是在不同的mRNA分子之間一致的? (b)核糖體的速度與基因表達之間是否有聯係? (c) mRNA的結構如何影響翻譯過程中核糖體的速度? And (d) how ribosome speed during translation is influenced by the initiation and termination codons? However, the RP technique can address the abovementioned queries in a genome wide context. In table 1 the advantages of RP technique over Microarray, polysome profiling and RNA sequencing have been mentioned in brief.

微陣列	RNA-seq	多核糖體剖析	RP
用預合成探針分析已知基因	整個轉錄組分析	它可以通過觀察多聚體來檢測積極參與翻譯的mRNA	分析翻譯轉錄組
基於核酸雜交和熒光分析mRNA表達	通過下一代測序分析mRNA表達	RNA-seq翻譯mRNA的鑒定和表達譜分析	通過下一代測序鑒定和定量與核糖體結合的mRNA區域
鑒定新轉錄本是不可能的	能否識別新的轉錄本、替代剪接和snp	能否識別新的轉錄本和替代剪接snp	能識別新的轉錄本，snp嗎
提供轉錄水平信息	提供轉錄水平信息	提供轉錄後信息，但無法破譯核糖體沿mRNA分子的位置	提供核糖體沿mRNA分子的轉錄後信息和位置信息

表1:RP技術相對於其他目前使用的技術，如微陣列，RNA-seq，多聚體分析的獨特優勢

RP方法

RP是一種可以解碼翻譯調控的精細水平的方法，在這種翻譯調控中，同一個轉錄組可以產生不同的翻譯轉錄組。由Ingolia等人介紹的[2]，使用高通量深度測序技術對核糖體保護的mRNA片段進行測序是一種強大的技術，被稱為“核糖體腳印”(核糖體腳印)。在RP實驗中，細胞最初用翻譯抑製劑(如環己酰亞胺)處理核糖體，以此作為捕獲給定條件下翻譯狀態快照的基礎。然後，將固定細胞裂解，用非特異性核酸酶(如RNase或微球菌核酸酶(MNase))消化，以降解未受保護的mRNA片段，留下約28-30個核苷酸大小的完整核糖體片段。對衍生的小片段進行深度測序處理，得到核糖體腳印。RP是一種高度敏感的技術，通過分析mRNA分子的核糖體足跡密度，甚至可以以特定位置的方式檢測罕見的翻譯信息。將這些腳印映射到全基因組核糖體占用剖麵，最終在核苷酸水平上解碼核糖體的位置。該技術除了起源較近外，還被廣泛接受並應用於各種生物在各種生理條件下的核糖體腳印圖譜[3]。最近已經報道了Ingolia等人對原始協議[2]的一些優化[4- 7]。到目前為止，隻有Illumina公司(加利福尼亞州，美國)提供了品牌名為TruSeqRibo Profile的商用試劑盒，用於哺乳動物和酵母係統的RP。這項技術的難點之一是避免rRNA的汙染。 Effective control of rRNA fragments in RP experiments is essential, because the background noise due rRNA fragments can reduce the efficiency of detecting the signals from mRNA. Therefore the commercially available kit like Ribo-Zero rRNA depletion kit (Epicenter) is generally used for removal of rRNA contaminating fragments in RP experiments. Recently, double strand specific nuclease was used for rRNA depletion in different species [8].

RP使我們洞察到翻譯的不同層次

核糖體結合在mRNA的核糖體結合位點(RBS)和第一個氨基酸的結合標誌著翻譯啟動的開始。啟動核糖體機製繼續轉譯，直到到達停止密碼子，即延伸，最後由釋放因子釋放的新生多肽終止轉譯。現在，很明顯，RP在三個不同的水平上提供了關於平移動力學的新信息，即起始、延伸和終止，下麵將對此進行討論。

翻譯起始位點的定位

在RP技術出現之前，確定基因中開放閱讀框(ORF)的翻譯起始位點或起始位點(TIS)在mRNA上的定位並不容易。測量或繪製翻譯起始位點。為了定位翻譯起始位點，使用三角杉木酯堿和乳咪多黴素藥物阻斷核糖體啟動翻譯，否則可以通過嘌呤黴素和環己酰亞胺阻斷治療[9]實現翻譯的提前終止。全局翻譯啟動測序(GTI-seq)使用E位點抑製劑藥物環己酰亞胺(CHX)和乳咪多黴素(LTM)，通過分析哺乳動物細胞[10]中的核糖體腳印，識別轉錄組中的noble TIS。由於GTI-seq無法量化TIS, Gao等人[11]采用了一種稱為定量翻譯起始測序(QTI-seq)的新技術，該技術使用LTM冷凍起始核糖體，然後用嘌呤黴素(PMY)處理耗盡延長核糖體來量化和繪製TIS。從最近針對TIS的RP實驗中，我們可以清楚地看到，翻譯啟動的機製比我們之前認為的要複雜得多。RP實驗記錄了在5ʹUTR位點非aug啟動或啟動的數量急劇增加[12-14]，這些非aug轉譯啟動大多出現在短上遊orf (uORF)中。短的uORF存在於基因的上遊區域，由於其體積很小，在翻譯過程中無法產生功能蛋白產物，而是通過抑製下遊蛋白質編碼基因或主要ORF[15]的翻譯發揮調節作用。非上遊調節ORF (nORF)在主ORF內部有啟動信號，也有RP實驗記錄。對核糖體足跡數據的分析顯示，長穿插非編碼RNA (lincRNA)[16]的功能不活躍的新orf的翻譯。 In bacteria, Tetracycline mediated inhibition of ribosomes by blocking ribosomes at initiation sites effectively maps several new TIS using RP [17].

延伸過程中的核糖體動力學

通過RP技術，繪製出平移延伸過程中核糖體的占位區域。因此，與核糖體停留時間較短的mRNA區域相比，核糖體停留時間較長的mRNA區域在核糖體譜中表現得更多。前者表示轉譯速度較慢的區域(也稱為核糖體暫停位點)，這可能是由於非最佳密碼子的出現，或由於mRNA二級結構，或由於反Shine-Dalgarno序列，或由於新生肽與核糖體的相互作用，含有脯氨酸等氨基酸的延伸，而後一個區域則是由於mRNA或生長多肽上存在最佳密碼子或不存在上述阻礙因素而導致翻譯速度較快的區域。核糖體暫停對共翻譯蛋白折疊[20]很重要。

生物體中同義密碼子使用的差異被稱為密碼子使用偏差(CUB)[21]。通過比較基因組內高表達基因和低表達基因的同義密碼子使用情況，科學家預測在翻譯[22]過程中，某些同義密碼子的解碼速度比其他同義密碼子快。最近RP[23-25]的實驗證明了同義密碼子之間在翻譯速度方麵的差異。用密碼子操縱的熒光素酶mRNA片段進行實驗Neurosporacrassa並得出密碼子使用與翻譯動力學之間存在相關性，即最優密碼子增加了翻譯伸長速度，而非最優密碼子降低了翻譯伸長速度(圖2)。非最優密碼子誘導的核糖體暫停可導致衍生蛋白的共翻譯折疊，這是維持蛋白質[26]正確結構和功能的重要機製。在早期的研究中，密碼子優化N.crassa生物鍾基因頻率(frq)的研究發現，對無序區域進行優化可以得到結構不同且無功能的蛋白產物[25,27]。

圖1:RP方法的示意圖表示
核糖體譜分析的步驟如下:(i)從細胞中分離核糖體結合mRNA;(ii) RNase消化，這樣核糖體結合的RNA仍然被保護，酶可達的RNA區域被消化;(iii)分離核糖體結合RNA和合成cDNA，然後用適配器連接和下一代測序。

圖2:兩個mRNA分子的蛋白質合成和核糖體軌跡示意圖，即具有所有最佳密碼子的mRNA1和同時具有最佳和非最佳密碼子的mRNA2，用黑線劃分。兩種情況下，上半部分顯示合成蛋白的翻譯核糖體，下半部分顯示核糖體足跡密度。在mRNA1中，整個mRNA的最佳密碼子的存在誘導快速翻譯。在mRNA2中，由於某些密碼子的同義突變導致核糖體暫停和共翻譯折疊。導致mRNA中非最優密碼子的同義突變在同源tRNA分子的這些位置顯示出更多的核糖體腳印和核糖體停頓。

終止翻譯和停止密碼子透讀

停止密碼子包含任何給定蛋白質合成事件的終止信號。但在某些情況下，這些停止密碼子並不會終止蛋白質合成，因此，部分或整個3ʹ非翻譯區域也會被翻譯產生具有擴展c端區域的蛋白質變體。已知在某些病毒中會發生停止密碼子透讀[28,29]。RP技術有助於破譯酵母中許多新的停止密碼子解讀事件，果蠅和哺乳動物[30-32]。的3個ʹ末端的轉錄本的核糖體腳印中報道了核糖體幀移位導致的停止密碼子通讀黑腹果蠅[31]。停止密碼子的通讀賦予後續蛋白產物改變的功能和定位，因此在物種進化中也起著重要的作用。

腳印中A、P位點的測定

核糖體腳印長度一般約為28個核苷酸，但有些腳印不是標準長度。由於印跡長度的異質性[33-35]，很難設計一種方法或軟件來預測印跡內受體(a)和肽基(P)位點的位置。先前，通過將腳印的5 '端與轉錄本的起始位點或腳印的中心核苷酸對齊確定的位點，被認為是一個[9]位點。Martens等人最近的一項研究確定了核糖體腳印中A和P位點的位置，基於特定氨基酸(如絲氨酸、組氨酸、脯氨酸等)上的暫停位點。在這項研究中，在真核生物和原核生物的腳印中發現了A和P位點的不同位置。在酵母中P和A位點在5 '端下遊4和5個密碼子，而在大腸杆菌中在3 '端上遊5和4個密碼子。從上述研究可以看出，在某些密碼子上的暫停傾向可以提示核糖體腳印內的A和P位點。

細胞器核糖體譜分析

細胞器如線粒體和葉綠體的基因表達也是生物體生存的不可或缺的部分。這些細胞器有自己的蛋白質合成機製，與真核生物相比更類似於原核生物。由於細胞器核糖體與細胞質核糖體不同，傳統的核糖體譜分析可能會跳過細胞器核糖體保護片段。Rooijers等人[37]成功優化了線粒體RP協議，以分析野生型和引發疾病的線粒體轉譯。線粒體RP還用於了解酵母線粒體生物發生[38]的動力學。同樣，在玉米葉綠體分化的不同階段，利用核糖體剖析[39]進行葉綠體RP。隨著實驗程序和生物信息學分析技術的改進，RP技術對理解線粒體和葉綠體的翻譯動力學非常有用。

RP數據分析軟件包

RP被分子生物學家認為是一種很有前途的研究翻譯調控的技術。RNA-seq平台產生的RP數據包含大量的短讀數據，對其進行分析仍然是生物學家麵臨的艱巨任務。隨著RP技術的日益普及，一些軟件包和管道被開發出來，用於對RP實驗產生的數據進行定量和定性分析[41-44]。雖然這些管道最小化了由於非常短的讀取而產生的許多固有問題，但來自不同5 '和3 ' UTR區域的相似轉錄本的腳印不能以100%的置信度映射。Ribo錐度是最近開發的一種利用三聯體周期性簡單有效地預測蛋白質編碼ORF的管道。Ribo Tools是一個來自Galaxy的開源質量監控工具箱，用於通過精確確定密碼子占用配置文件、翻譯模糊性和RP數據[42]中的停止密碼子讀取來最小化不確定性。表2中還提到了用於分析RP數據的其他幾個管道。

軟件包	腳本	可用性	發布下	參考
RiboTaper	R	軟件/ RiboTaper_126 / https://ohlerlab.mdc-berlin.de/	Github	Calviello et al. [3]
riboseqR	R	http://bioconductor.org/packages/release/bioc/ html / riboSeqR.html	Bioconductor	Chung等人[8]
RiboTools	Python 2.7	https://testtoolshed.g2.bx.psu.edu/view/ rlegendre / ribo_tools	星係	勒讓德等人[42]
PROTEOFORMER	Pearl5	http://www。biobix.be / proteoformer	星係	Crappe et al. [41]
GWIPS-viz		http://gwips.ucc.ie/	UCSC基因組瀏覽器	米歇爾等人[9]

表格2：可用於RP數據分析的軟件包和管道

結論

RP采用RNAseq技術來理解與翻譯起始、延伸和終止相關的複雜性或動力學。使用RNA seq與RP並行的轉錄組測序是了解特定條件下特定生物體的轉錄和翻譯動態的首選方法。在不久的將來，我們將進一步了解不同生物的核糖體對密碼子和反密碼子相互作用的差異。商業上可用的工具箱具有更簡單的工作流程和自動化的分析管道，這肯定會幫助科學家描繪不同的生物體，並將增強我們對翻譯動力學的理解。

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文章類型:評論文章

引用:Agarwala N, Ray SK(2016)核糖體譜分析:對編碼序列上翻譯核糖體的動力學的洞察:綜述文章。Int J Mol基因et Gene Ther 2(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2471-4968.107

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出版的曆史:

收到日期:2016年9月30日

接受日期:10月25日

發表日期:10月31日