摘要

本研究旨在了解一個編碼家蠶角質層蛋白的基因CPR95在家蠶變態發育中的調控機製。CPR95的發育特征與E74A相似。20E脈衝處理誘導E74A和CPR95轉錄本在體外．由此可見，CPR95與E74A具有一定的相關性。CPR95上遊E74A結合位點的定點突變和報告實驗表明CPR95和E74A具有很強的相關性。通過基因組信息和瞬時報告實驗，我們證實了CPR95表達的調控機製。本研究結果表明，CPR95在家蠶翅盤蛹前階段受蛻皮激素應答轉錄因子E74A的調控。

關鍵字

時間表達;表皮蛋白;蛻皮激素脈衝;定點誘變;基因槍

簡介

昆蟲角質層是一種多層結構，具有表皮層、毛球層和內膜三個功能區域，在蛋白質組成、結構特征和生理功能[1]上存在差異。昆蟲角質層的性質是由角質層蛋白質的結構決定的，不同角質層類型在力學性能上有顯著差異，這些差異與單個蛋白質[2]的性質有關。昆蟲角質層的特征在種類和階段上存在差異，這種差異是由角質層蛋白質的組合所帶來的。角質層蛋白的特征是重複出現幾個主要由疏水殘基[2]組成的小基序。因此，昆蟲在每次幼蟲蛻皮時形成新的角質層，在幼蟲向蛹或蛹向成蟲轉化時形成不同類型的角質層。昆蟲角質層主要由幾丁質和角質層蛋白質組成，角質層蛋白質決定了角質層的性質，帶來了昆蟲角質層的多樣性。

角質層蛋白有表皮蛋白反應性表達的報道[3-12]。大部分表達由蛻皮激素脈衝誘導;該表達式需要20E的存在和去除[9,11,13]。這種情況與蛻皮周圍的階段相似。很少有報道20E上調的例子[7,9,10]。體外添加蛻皮素誘導。因此，表皮蛋白基因具有不同的發育特征，由不同類型的蛻皮激素信號誘導，這些事情在最近的一篇綜述[14]中進行了描述。

表皮激素應答轉錄因子已被證明決定表皮蛋白基因[4]的表達。βFTZ-F1增加了表皮蛋白基因BMWCP5的啟動子活性，該基因在化蛹前後表達，此時表皮甾體滴度在峰值後下降[15,16]。BR-C Z2激活BmorCPG11啟動子獨立於其他蛻皮素反應轉錄因子[6]。除上述轉錄因子外，EcR結合表皮蛋白基因啟動子區，BMWCP10，激活其轉錄[15]。BHR3監管BmorCPH5，且其轉錄峰出現的時間早於BMWCP5[4]。因此，轉錄因子結合到目標角質層蛋白基因的上遊，導致角質層蛋白基因在翅盤和表皮的階段性表達。因此，如前所述，表皮蛋白基因是蛻皮反應轉錄因子的靶點。這些研究是通過使用基因組數據庫進行的，並假設蛻皮激素反應性轉錄因子E74A調節CPR95的表達。

材料與方法

實驗動物

一種雜交的b .森在25°C的12小時光照下飼養:12小時暗光周期。幼蟲在幼蟲5齡6 d開始遊蕩，3 d後化蛹，成蟲在化蛹10 d後封閉。第4 ~ 5個幼蟲蛻皮、遊離、化蛹、羽化發育階段分別為V0、W0、P0、A0。化蛹前3天設為W1-W3。將W3期分為W3早期(W3E)、W3中期(W3M)和W3晚期(W3L) 3個不同的子期。W3子階段是根據時間和腿長度[3]明顯縮短來確定的。

在體外翼盤培養

製備W2期幼蟲翼盤並進行培養在體外如前所述[4]。根據之前的報告[17]，在25°C的無菌條件下進行培養。

定量逆轉錄pcr

為了測定角質層蛋白基因和轉錄因子的表達水平，根據前人報道[4]進行總RNA和cDNA合成。定量逆轉錄PCR使用ABI7500實時PCR儀(Applied Biosystems)，根據製造商的協議，使用Fast Start Universal SYBR Green Master (Roche)。使用核糖體蛋白S4的基因對每個樣本中的數據進行歸一化。寡核苷酸引物使用Primer3軟件(http://frodo.wi.mit。如表1所示。

表1:引物清單

質粒構建和誘變

CPR95的上遊區域(-2040 ~ +18和-136 ~ +18)根據之前的報道[3]進行了PCR擴增。擴增的DNA片段被消化尚馳而且NheI然後紮進尚馳而且NheI熒光素酶報告質粒pGL3-基礎的位點生成構建物。一個Renilla熒光素酶報告器(PhRGhsp以果蠅熱休克蛋白70啟動子[18]作為歸一化對照[11]。以CPR95-136質粒為模板，采用快速變化TM定點突變試劑盒(Stratagene)檢測CPR95的單突變體(-104/-102)E74Amut。用Pfu DNA聚合酶擴增20納克質粒DNA，然後用酶消化母質粒DpnI．將突變質粒導入XL1-Blue超能力細胞。誘變反應按照製造商的說明進行。每個突變的引入都通過測序確認。用於生成結構物和突變的寡核苷酸引物如表1所示。

熒光素酶瞬時表達測定

報告結構在翼盤中的瞬時表達如前所述[4]所示。按照製造商的說明，將12.5 mg金顆粒(直徑:1.0µm)包被質粒DNA (pgl3衍生載體各50µg和5µg phRG-hsp)。使用粒子槍(Bio-rad)將報告器結構引入翼盤。轟炸在150 psi(磅每平方英寸)的氦氣壓力下進行。轟擊後，翼盤在25°C的Grace培養基(Invitrogen)中培養48小時，加入或不加入2µg/ ml的20E (Sigma)。培養方法已在前麵[17]中描述。培養48小時後，翼盤在PBS中洗滌兩次。將組織懸浮在25µl 1x報告細胞被動裂解緩衝液(Promega)中，在液氮中冷凍/解凍5個循環，然後在4℃平衡上清液1 h。在4℃下以12000 g離心收集上清液2 min。熒光素酶報告檢測使用雙熒光素酶報告檢測係統(Promega)在一個光度計(Perkin Elmer)中根據製造商的方案進行。將熒光素酶活性歸一化至Renilla熒光素酶活性水平。 All experiments were performed at least five times. The results were expressed as the mean ± S. E. M., and significance was set at p <0.05.

組織學研究

切片包含頭部、胸部和腹部的包皮(圖1)，在Carnoy固定液中固定2小時，然後脫水，石蠟包埋。7微米的切片在二甲苯中脫蠟，通過酒精係列再水化，然後用自來水洗滌15分鍾。洗滌後，進行周期性酸性Shiff (PAS)反應[19]，以檢測來自BM的多糖。然後將載玻片浸入莉莉溶液中10分鍾(100 ml KIO)₄+ 0.4 ml 60% HNO_3.)，在Shiff試劑中孵育30分鍾，然後在H₂所以_3.溶液[5ml 1N HCl + 5ml 10% K₂年代₂O₅+ 100 ml H2 O] (3×1 min)，用自來水衝洗10分鍾。然後用蘇木精染色5分鍾，用酸性酒精(70%乙醇+ 1ml 1N HCl)浸泡1分鍾，在自來水中洗滌15分鍾。洗滌後，用分級乙醇(70%、90%、95%和無水)脫水，用二甲苯清除，並用加拿大香脂和蓋片安裝。切片在光學顯微鏡(Olympus BX50)下觀察，並使用DP-BSW軟件進行記錄。

圖1:以下物質W3期中期幼蟲。A.箭頭表示胸椎表皮樣本的解剖位置。B.箭頭表示腹部表皮(A)、翼盤(W)和頭囊(H)的樣本位置。

結果

CPR95在翅盤表達的角質層蛋白基因中有明顯的表達譜家蠶

角質層蛋白基因，CPR95(圖2A)，在第五幼蟲階段表達家蠶，與E74A相似。E74A是一種蛻皮激素應答轉錄因子，在蛹前血淋巴中蛻皮激素含量下降的W3L期出現表達高峰。因此，為了了解E74A和CPR95的表達譜，我們對E74A和CPR95的表達進行了分析。

圖2:角質層蛋白基因CPR95 (A)和蛻皮素響應轉錄因子E74A (B)的發育概況。從翅盤中提取RNA，反轉錄為cDNA，用於Real-Time PCR。數值表示三個獨立實驗結果的平均值±S.E.M.。

CPR95和E74A翼盤也類似嗎

CPR95表達量在W3E期後迅速升高，在W3L期達到峰值，此時血淋巴中蛻皮甾滴度下降，隨後迅速下降(圖2A)。E74A轉錄本在W3E期後迅速升高，在W3L期達到峰值後迅速下降(圖2B)，這與CPR95的表達相似。E74A和CPR95轉錄本在W3L期後迅速下降(圖2)，此時血淋巴蛻皮甾體滴度下降。因此，我們檢查了治療後去除蛻皮素(蛻皮素脈衝)的效果。去除激素後E74A轉錄物增加(圖3A)，添加環己亞胺後沒有觀察到。CPR95的轉錄在去除20E後也表現出類似的增加(圖3B)，添加環己亞胺抑製了轉錄。結果表明，兩個基因的轉錄都隨著20E的去除而被激活。兩種基因均表現出相似的蛻皮激素脈衝反應性;通過去除20E誘導轉錄。從表達譜的相似性來看，CPR95是由蛻皮激素應答轉錄因子E74A誘導的。 Therefore we searched the upstream genomic sequences of CPR95 and found two putative E74A binding sites [4] upstream of CPR95 gene (Figure 4). Then, we applied reporter assay for the promoter analysis of CPR95 related with E74A.

圖3:ecdysone脈衝處理對E74A (A)和CPR95 (B)的影響。從翅盤中提取RNA，反轉錄為cDNA，用於Real-Time PCR。將W2期的翼盤在含2µg/ml 20E的培養基中孵育12小時，然後轉移到含或不含環己亞胺(50µg/ml)的無激素培養基中，待指定時間。數值表示三個獨立實驗結果的平均值±S.E.M.。星號表示學生t檢驗的p<0.05顯著性。

圖4:CPR95不同長度的啟動子活性^/從側翼地區。熒光素酶報告結構具有不同長度的5^/將CPR95野生株和突變株的-側翼轟擊成W2期的翼盤，加或不加2µg/ml 20E培養48 h。數字是指假定轉錄起始位點的核苷酸位置。熒光素酶活性歸一化為Renilla熒光素酶活性。熒光素酶試驗進行了五次，結果報告為平均值±S.E.M.螢火蟲/雷尼拉比值。

報告基因分析顯示CPR95與E74A基因有相關性

20E脈衝處理後，含有CPR95上遊2040 bp區域的質粒顯示出更高的啟動子活性(圖4)。含有E74A假設結合位點的缺失構建物(CPR95-136)顯示出類似的活性(圖4)。因此，我們使用CPR95-136對該結合位點進行突變，導致啟動子活性降低(圖4)。在不含20E的培養基中，CPR95啟動子區域的熒光素酶活性下降至含有20E的培養基中。這表明突變消除了20E脈衝的影響，而20E脈衝的影響被認為是E74A的影響。這一結果有力地表明，CPR95啟動子活性受E74A調控。

討論

角質層蛋白基因在五齡幼蟲翼盤中的不同表達模式已經報道並闡明了翅盤角質層蛋白基因的調控家蠶通過基因組數據庫[4,11,15,20]。在此，我們闡明了相關的蛻皮激素反應轉錄因子。不同表皮蛋白基因的啟動子區域被EcR和不同表皮蛋白反應轉錄因子βFTZ-F1、E74A、BR-C Z2、BR-C Z4結合激活，形成不同的表達模式。這些研究通過使用基因組信息和使用翼盤的瞬態報告試驗取得了成功。

在本研究中，我們發現一個表皮蛋白基因CPR95在W3E期後轉錄量迅速增加，在W3L期達到峰值，然後迅速下降。角質層蛋白基因大多在化蛹[21]前後出現表達高峰，轉錄因子βFTZ-F1、BR-C和E74A調控這些角質層蛋白基因的表達[4-6,15]。E74A是唯一與CPR95發育特征相似的轉錄因子。CPR95由蛻皮激素脈衝誘導，並表現出與E74A相似的蛻皮激素反應性(圖3)d .腹[22],m . sexta[23],家蠶(4、24)。在本研究中，我們發現了CPR95和E74A的相關性。ecdysone脈衝處理對CPR95啟動子有很強的調控作用，而E74A近端假定結合位點的突變則使其消失(圖4)。結果表明E74A與CPR95有很強的相關性。結合qRTPCR的結果，我們認為CPR95的轉錄受E74A的調控。提示對蛻皮激素的響應性決定了轉錄因子及其相關表皮蛋白基因的表達時間，導致了CPR95和CPR95的差異BmorCPH5表達式[4]。據報道，含有R&R殘基[25]的角質層蛋白可與幾丁質結合[26,27]並構建小檢。雖然一些非R&R角質層蛋白具有角質層結合能力[28,29]，但大多數已報道不與幾丁質結合[30,31]。翅盤中表達的角質層蛋白基因大多在化蛹前通過蛻皮激素脈衝信號轉錄，且大多具有R&R殘基。由於CPR95具有R&R殘基，且轉錄較晚，因此可以構建檢粒BmorCPH5[4]。

的表達式BR-Z2,βFTZ-F1而且e - 74 a分別在頭部、胸部和腹部的表皮上明顯[5,6]。組織學照片和基因表達譜顯示表皮的不同區域表達不同的表皮蛋白反應轉錄因子，決定了表皮蛋白基因在該區域的表達(圖5)。因此，這些表皮蛋白反應轉錄因子可能調控其靶基因，其表達序列將導致昆蟲變態。

圖5:表皮三個不同區域的顯微照片。三個區域的整合呈現出不同的特征。觀察到不同類型的表皮層(ep)和表皮層(pr)。細胞核(N)和基底膜位於基底區。

本研究結果表明，角質層蛋白基因根據其調控轉錄因子進行序列表達，從而產生一係列連續的角質層蛋白，從而構建角質層外、外和內角質層。這些不同類型的角質層蛋白結合形成蛹角質層，目前的研究結果表明，蛻皮膜反應轉錄因子決定了角質層蛋白基因的表達空間。基因組信息和瞬時報告分析將進一步闡明昆蟲角質層的形成機製。

參考文獻

1. 威利斯JH(1996)角質層的變形，它的蛋白質和他們的基因。見:Gilbert LI, Tana JR, Atkinson BG(編輯)，細胞生物學:一係列專著:變態。兩棲動物和昆蟲細胞的胚胎後基因表達重編程，學術出版社，聖地亞哥，253-282。［Ref。］
2. 楊文傑，王文傑，王文傑，等(1995)昆蟲表皮蛋白的研究進展。昆蟲生物化學Mol生物25:153-176。［Ref。］
3. 李麗娟，李誌剛，李誌剛(2015)家蠶翅盤表皮蛋白甘氨酸- rich13基因表達的轉錄調控。昆蟲科學27:1-6。［Ref。］
4. 李麗娟，李誌強，李誌強，等(2013)家蠶翅盤表皮蛋白基因的轉錄調控。基因512:337-347。［Ref。］
5. Ali MS, Iwanaga M, Kawasaki H(2012)家蠶表皮層表皮蛋白靶基因表達區域的研究。開發基因進化222:89-97。［Ref。］
6. 王海波，王海波，王海波，川崎H(2012)家蠶翅盤角質層蛋白基因BmorCPG11和BMWCP5的表達在蛹前階段受到不同程度的調控。比較生物化學生理學B生物化學摩爾生物學162:44-50。［Ref。］
7. 李誌剛，李誌剛，李誌剛(1989)煙草角蟲幼蟲表皮多基因家族的表達和激素控製。Dev Biol 132: 292-303。［Ref。］
8. 李誌剛，李誌剛，李誌剛(2001)植物表皮變態發育的激素調控在體外:幼蟲特異性角質層基因表達的控製。Dev Biol 114: 369-378。［Ref。］
9. 張誌剛，張誌剛，張誌剛，等。(1996)20-羥基蛻皮素對昆蟲表皮細胞增殖的影響在體外．歐洲生物化學雜誌240:336- 341。［Ref。］
10. 田誌平，田誌平，田誌平，等。(2003)家蠶翅盤表皮激素反應蛋白基因的分離與比較。昆蟲生物化學Mol Biol 33: 671-679。［Ref。］
11. 倪妮，王海波，鍾玉生，米田K, Iwanaga M，等。(2009)家蠶翅盤BMWCP2脫皮激素脈衝響應區分析。比較生物化學生理學B生物化學Mol生物學153:101-108。［Ref。］
12. 王海波，Iwanaga M, Kawasaki H(2009)家蠶BMWCP10啟動子的激活及BR-C Z2在飛盤內的調控。昆蟲生物化學Mol生物學39:615-623。［Ref。］
13. Zhong YS, Mita K, Shimada T, Kawasaki H(2006)家蠶富含甘氨酸蛋白基因編碼角質層的一個主要成分，與其他角質層蛋白基因具有不同的發育特征。昆蟲生物化學Mol Biol 36: 99-110。［Ref。］
14. Charles JP(2010)昆蟲角質層蛋白基因表達的調控。昆蟲生物化學Mol Biol 40: 205-213。［Ref。］
15. Wang HB, Nita M, Iwanaga M, Kawasaki H (2009) βFTZ-F1和Broad-Complex在家蠶翅盤中正向調控翼角質層蛋白基因BMWCP5的轉錄。昆蟲生物化學Mol生物學39:624-633。［Ref。］
16. 櫻井平，田秀文，佐竹生(1998)家蠶終幼蟲場的血淋巴蛻皮甾體效價和蛻皮甾體依賴發育事件:低蛻皮甾體效價在幼蟲蛹蛻變中的作用和頭部關鍵期的重新評價。昆蟲物理學44 867-881。［Ref。］
17. 川崎H(1989)家蠶翅盤的培養方法。Tiss培養方法12:31-33。［Ref。］
18. 李誌強，李誌強，李誌強，等(2001)鱗翅目昆蟲體外誘導外源基因的表達。在體外細胞發育生物學雜誌37:564-571。［Ref。］
19. 金山H，富上M, Adachi N, Fukai Y, Okumoto T(1986)[茯苓菌絲中抗腫瘤活性多糖的研究。]3對小鼠腫瘤的抗腫瘤活性]。Yakugaku zashi 106: 307-312。［Ref。］
20. Wang HB, Moriyama M, Iwanaga M, Kawasaki H (2010) Ecdysone直接和間接調控家蠶翅盤角質層蛋白基因BMWCP10。昆蟲生物化學Mol Biol 40: 453-459。［Ref。］
21. 王曉燕，李誌剛，李誌剛，等。(2008)家蠶角質層蛋白基因的克隆與鑒定。昆蟲生物化學雜誌38:1138-1146。［Ref。］
22. Karim DF, Thummel SC (1991) Ecdysone協調果蠅E74A和E74B轉錄的時間和數量。基因開發5:1067-1079。［Ref。］
23. Stilwell GE, Nelson CA, Weller J, Cui H, Hiruma K(2003)煙草角蟲表皮激素的階段性調控。Dev Biol 258: 76-90。［Ref。］
24. 張誌剛，張誌剛，張誌剛(2007)20-羥基蛻皮激素對家蠶前絲腺轉錄因子E74基因的調控作用。昆蟲學報16:581-590。［Ref。］
25. 李誌強，李誌強，李誌強(1988)一個與果蠅角質層基因同源的小圓翅蛾幼蟲角質層基因的結構和表達。Mol生物學203:411-423。［Ref。］
26. 李誌剛，李誌剛(2001)節肢動物角質層蛋白與幾丁質結合的保守結構域，中國生物醫學工程學報，31(4):344 - 344。［Ref。］
27. 田川平，李春華，泉泉(2004)家蠶軟質角質層蛋白質的幾丁質識別機製分析。昆蟲生物化學，Mol生物學34:1059-1067。［Ref。］
28. 唐玲，梁軍，詹誌，向誌，何寧(2010)家蠶幼蟲蛋白中幾丁質結合蛋白的鑒定。昆蟲生物化學Mol Biol 40: 1077-1087。［Ref。］
29. Willis H(2010)節肢動物結構角質層蛋白:基因組學時代的注釋、命名和序列特征。昆蟲生物化學Mol Biol 40: 241-251。［Ref。］
30. 安徒生SO(2000)蝗蟲、蝗蟲和蟑螂蛻皮後若蟲角質層蛋白質的研究。昆蟲生物化學Mol Biol 30: 569-577。［Ref。］
31. Togawa T, Augustine Dunn W, Emmons AC, Willis JH(2007)岡比亞按蚊和其他昆蟲表皮蛋白編碼的CPF和CPFL基因家族。昆蟲生物化學Mol Biol 37: 675-688。［Ref。］

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條信息

文章類型:研究文章

引用:李麗娟，王麗娟，王麗娟，等。(2016)一種表皮蛋白在基因組分析中的調控研究。Int J Mol Genet Gene Ther 2(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2471-4968.104

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出版的曆史:

收到日期:2015年12月16日

接受日期:2016年一月五日

發表日期:1月10日