摘要

在西方世界，食管和胃食管交界處(GEJ)腺癌的發病率呈上升趨勢。為了確定新的診斷和治療策略，需要更好地了解與胃癌相關的分子畸變。我們研究了HOX轉錄反義基因間RNA (HOTAIR)的表達、調控和預後價值，HOTAIR是一種來自HOX簇的長鏈非編碼RNA (lncRNA)。收集了40例接受胃、食管或GEJ腺癌手術的患者的活組織切片。分析具有可能預後價值的臨床病理變量，以確定獨立的預後因素。用qRT-PCR檢測人胃腺癌細胞中HOTAIR的表達，用xCELLigence阻抗分析實時跟蹤細胞增殖和遷移。HOTAIR在切除的胃、食管和GEJ腺癌中的高表達是預後不良的獨立預測因子。我們發現過表達HOTAIR使HFE145胃細胞增殖加倍。miR-449和Vorinostat或siRNA抑製HDACs (miR-449靶點)降低了HOTAIR的表達在體外．HOTAIR表達不受控製通過miR-449對p53的調控。我們提出HDAC作為HOTAIR表達的調控因子的作用。

關鍵字

胃癌;熱空氣;HDAC;mir - 449;非編碼RNA

簡介

盡管胃癌的發病率在全球範圍內有所下降，但在全球範圍內，胃癌仍是第四大最常見惡性腫瘤，也是導致男女癌症死亡的第二大原因[1,2]。在西方世界，食管和胃食管交界處(GEJ)腺癌的發病率呈上升趨勢。雖然食管、胃和GEJ腺癌的臨床轉歸逐漸改善，但患者的生存期仍較差，5年總生存期為20%[3]。因此，需要更好地了解與胃癌相關的分子畸變，以確定新的診斷和治療策略。

非編碼RNA (Non-coding RNAs, ncRNAs)是人類RNA的主要組成部分，並調節基因表達[4,5]。微rna (miRNA)是一類由21-25個核苷酸組成的ncrna，由於其在許多人類惡性腫瘤[6]的發病機製中所起的作用，在過去十年中受到了越來越多的關注。最近，長鏈(>100核苷酸)ncRNAs (lncRNAs)也被認為是基因轉錄的調節因子[4,5]。其中一種lncrna是HOX轉錄反義基因間RNA (HOTAIR)，它是從HOXC位點[7]轉錄而來的。HOTAIR結合到多梳抑製複合體2 (PRC2)上，並將其靶向到HOXD位點，抑製HOXD基因的表達。PRC2是一種組蛋白H3賴氨酸27 (H3K27)甲基化酶，參與發育基因沉默和癌症進展[8,9]。癌細胞中HOTAIR的過表達似乎會將多梳結合譜從上皮細胞重編程到間充質胚胎成纖維細胞，這與轉移進展[10]的高風險相關。

胃癌的發生與HOX基因和HOX簇內編碼的miRNAs的基因表達異常有關[11-13]，這在一定程度上與表觀遺傳變化有關[14,15]。總的來說，這表明在胃癌發生過程中，HOX簇的基因表達發生了普遍的變化。因此，我們希望研究HOX簇中編碼的lncRNA HOTAIR在胃癌活檢組織中的表達和預後價值，以及其調控作用。

材料和方法

患者的選擇和活檢的收集

本隊列研究包括2008年7月至2009年11月期間因胃腺癌、食管癌或GEJ手術的患者。所有個人都提供了知情的書麵同意。丹麥倫理委員會批準收集活組織標本(期刊號為H-B-2008-049)，丹麥數據保護機構批準建立生物銀行(期刊號為2008-41-2138)。從腫瘤組織和鄰近的正常組織中進行活檢。在與RNA提取相鄰的活檢中評估腫瘤含量，範圍在35 - 70%之間。從醫療圖表和病理報告中提取預先定義的臨床和準臨床數據。

細胞培養

人SNU638胃腺癌細胞培養在RPMI 1640培養基中(Carlsbad, CA)，而正常的胃上皮細胞係HFE145(由華盛頓特區霍華德大學Hassan Ashktorab教授提供)在DMEM培養基中(Invitrogen)。兩種培養基均添加10%胎牛血清(FBS) (Invitrogen)， 100µg/ml鏈黴素和100 U/ml青黴素(Invitrogen)， 37ºC, 5% CO2濕化氣氛。與HFE145細胞相比，HOTAIR在SNU638細胞中的表達高出1000倍(圖S2)，因此我們在HFE145細胞中進行過表達研究，而在SNU638細胞中進行敲除實驗。

在體外藥物治療

刺激前1天，在6個孔板中接種500.000個SNU638細胞。在RNA提取之前，用100µM 5- fu (Hospira Nordic AB, Stockholm, Sweden)、10µM nutin -3 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)或2.5µM、5µM或10µM Vorinostat (Patheon Inc.， Mississauga, Ontario, Canada)處理SNU638細胞24小時。在二甲基亞碸(DMSO)中溶解Nutlin-3和Vorinostat。2.5µM Vorinostat、5µM Vorinostat和10µM Vorinostat或Nutlin3的最終% DMSO分別為0.0025%、0.005%和0.01%。陰性對照細胞用0.01% DMSO處理。所有處理均為3個重複。

轉染

轉染前，將500.000個SNU638細胞接種於6個孔板中24小時。用5µl TurboFect轉染SNU638細胞^TM在體外轉染試劑(Fermentas, Burlington, Canada)，並混合50 nM TaqMan®MicroRNA Assay hsa-miR-449 (Applied Biosystems, Foster City, CA)或50 nM siRNA fecitube基因溶液短幹擾組蛋白去乙酰化酶1 (siHDAC1)， siHDAC2，或組合(Qiagen, Hilden, Germany)。300µl GIBCO^TM加入Opti-MEM I (Invitrogen, Carlsbad, CA)，將混合物孵育20分鍾後應用於細胞。轉染24小時後提取RNA和蛋白質。陰性對照細胞用siGLO siRNA處理(Thermo Scientific, Waltham, MA)。所有的轉染都是三倍的。

細胞死亡的測量

為了確保本文的結果代表了活細胞的基因表達，我們通過計數轉染和藥物處理後24小時培養液中自由流動的細胞數量，測試了miR-449、HDAC sirna和藥物處理對SNU638細胞活力的影響。使用伯爵夫人自動細胞計數器(Invitrogen)進行細胞計數。陰性對照在純培養基或含0.01% DMSO的培養基中培養。所有實驗均為四副本。正如預期的那樣，siHDAC和Vorinostat治療在一定程度上誘導了細胞死亡，這在其他胃癌細胞係中已被證明[16,17]。另外，DNA破壞藥物5-FU和Nutlin-3誘導細胞死亡(圖S3 A和B)。然而，大多數細胞在處理後存活下來，存活的細胞看起來健康，根據本文的測量結果。

細胞增殖和遷移

用LZRSHOTAIR表達載體(Addgene質粒26110)[10]轉染HFE145細胞，研究HOTAIR對胃癌細胞增殖和遷移的作用。在轉染前24小時，將400.000 HFE145細胞用4µg LZRS- hotair或4µg空LZRS載體用Turbofect轉染10 cm板^TM(發酵)如上所述。轉染24小時後，10000個細胞/孔被接種到cm - 16板中用於增殖，20.000個細胞/孔被接種到e - 16板的上腔中用於遷移研究(ACEA Bioscience, San Diego, CA/Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany)。分別對細胞增殖和遷移進行36小時和12小時的實時隨訪，采用RTCA DP儀(ACEA/Roche)進行xCELLigence阻抗分析。該方法允許通過測量金電極上的電阻抗來連續測量細胞增殖或遷移，金電極安裝在井底用於增殖測量，並安裝在微孔聚對苯二甲酸乙二醇酯的底部，劃分上下腔用於遷移測量。增殖研究N=6，遷移研究N=4。采用RTCA軟件(ACEA/Roche)進行計算。

RNA提取和qPCR

手術中收集胃腫瘤或正常相鄰組織的活組織切片，收集後立即放入RNA中(應用生物係統公司)。在-80℃保存之前，將RNA去除，加入1ml Trizol (Invitrogen)。組織樣本在組織分析器(Qiagen)上均質，根據製造商Trizol RNA分離方案(Invitrogen)從組織和細胞培養物中分離RNA。用NanoDrop ND-1000分光光度計測定RNA濃度。RNA質量在2100生物分析儀(Agilent Technologies, Santa Clara, California)上根據製造商協議進行測試，所有RNA樣本的RNA完整性數(RIN)值≥8。利用superscript III First-Strand Synthesis SuperMix for qPCR (Invitrogen)，從1µg分離的RNA中合成cDNA。采用SYBR GreenER q-PCR SuperMix for ABI PRISM (Invitrogen)的定量反轉錄PCR (qRT-PCR)方法分析基因表達。反應在應用生物係統公司的ABI PRISM 7900HT序列檢測係統(SDS)上進行。mRNA的表達歸一化為GAPDH，計算表達量為腫瘤或治療細胞株與正常組織或對照細胞株的表達水平的差異。通過研究標準曲線的斜率來估計引物的效率。 All standard curves had a slope between -3.3 and -3.6 indicating a primer efficiency of 90-100%. mRNA primers were designed using Primer-Blast software from NCBI [18], to span at least one intron in order to ensure amplification of cDNA only (for mRNA primers see Table S1).

西方墨點法

使用RNA/DNA/蛋白質純化試劑盒(Norgen Biotek公司，Throld, Canada)純化蛋白質。400 μ g蛋白裝孔，用聚丙烯酰胺凝膠(NuPAGE®Novex®4-12% BisTris Gel 1.0 mm, Invitrogen)分離。蛋白質被吸到聚二氟化乙烯膜(Invitrogen)上，與來自德克薩斯州達拉斯市聖克魯斯生物技術公司的針對HDAC1 (sc-81598)、HDAC2 (sc-7899)、p53 (sc-126)、Calnexin (sc-11397)的一級抗體孵育一夜。用化學發光法觀察蛋白質(Amersham^TM發射極耦合邏輯^TM選擇Western Blotting檢測試劑，GE Healthcare, Little Chalfont, UK)，使用LAS-1000 Pro v. 2.6 (FujiFilm，東京，日本)。

截止值的定義

將隊列分為低表達組和高表達組，將HOTAIR表達轉化為二元變量。我們使用與Wu等人相同的方法將腫瘤分為兩組:低HOTAIR表達=在2 / 3表達最低的腫瘤中看到的表達。HOTAIR高表達:在腫瘤的最後三分之一中表達最高的表達。Gupta et al.[10]認為HOTAIR RNA表達增加125倍作為分離HOTAIR高表達組和低表達組的截斷值，而在本研究中分離HOTAIR高表達組和低表達組的截斷值為93倍變化。

統計評估

總生存期定義為從手術日期到死亡的時間。時間-事件數據采用Kaplan-Meier方法估計，並采用log-rank檢驗和單變量回歸分析進行比較。采用多重Cox比例風險回歸模型確定CI為95%的獨立預後因素。根據推薦的[20]，由於事件數量較少，僅將四個變量納入分析。選擇單變量分析中最顯著的變量。采用SPSS 19和Graph Pad Prism軟件進行統計分析。qRT-PCR結果以3個技術重複中至少3個獨立實驗的平均值表示，並采用非配對雙尾t檢驗進行分析。在p值≤0.05時，數據集之間的差異被認為顯著。除非另有說明，誤差柱=±SEM。

結果

病人

從2008年7月至2009年11月在哥本哈根大學醫院胃腸外科進行手術的111例患者中有40例入選。所有納入研究的患者都是土生土長的丹麥白種人。10例患者接受了化療，均為輔助治療。7例患者接受術後輔助治療，包括5個周期的氟尿嘧啶(5- FU) +葉酸和局部放射治療(1,8 Gy x 25組分，5組分/周)。另外，3例患者接受了6個周期的泰索帝、卡鉑和卡培他濱治療。

研究患者的生存期與在研究期間接受手術但未收集腫瘤組織的患者無統計學差異(中位生存期為32.2個月(26.4-31.3)vs. 26.9個月(22.4-31.3)。HR=1.65 (0.9-2.8) p=0.078)(圖S1)。胃癌和GEJ/E/G癌患者預後無顯著差異。

納入的40例患者中，3例失訪，4例組織樣本質量太差。患者的人口統計和臨床病理特征見表1。更多的患者特征見補充表S2.19的患者(58%)在分析時已死亡。中位隨訪時間為22個月(範圍1-37個月)。

人口統計資料
變量		的患者數量	％
性別	男性	25	76
	女	8	24
性能狀態	0	14	42
	1	19	58
年齡	中位數	63年	(36 - 90)
遠處轉移	是的	3.	9
	沒有/未知	30.	91
二特點
變量		的患者數量	％
勞倫 分類	擴散	12	36
	腸	21	67
本地化	食道/ GEJ	19	58
	胃	14	42
節點與癌	N 0 - 1	17	52
	N 2 - 3	16	48

表1:患者人口統計和臨床病理特征。

HOTAIR的過表達是死亡的獨立預測因子

我們發現，與鄰近正常組織相比，腫瘤中HOTAIR的表達從不變到增加近700倍不等(圖1A)。與正常胃上皮組織相比，HOTAIR高表達組的腺癌組織中HOTAIR的表達上調了93到近700倍(圖1A)。HOTAIR表達低的患者生存時間明顯長於HOTAIR表達高的組，中位總生存期為22.9個月，中位總生存期為16.7個月(p=0.026)(圖1B)。

圖1:HOTAIR高表達與生存率差相關:對每個患者，將腫瘤組織中mRNA的表達水平與相應正常組織的mRNA表達水平進行比較。
(一)33例胃癌腫瘤中HOTAIR的qRT-PCR分析。HOTAIR翻倍增加前33%的患者歸為HOTAIR高組，其餘三分之二歸為HOTAIR低組。
(B)11例HOTAIR高生存率(紅色)和22例HOTAIR低生存率(藍色)患者的Kaplan-Meier曲線見A (p=0.026)。

對影響生存的不同預後因素進行檢查，我們發現>年齡=65歲p=0.032 (HR=3.2 (95%CI: 1.1-9.3))， TNM III期+IV期p=0.044 (HR=3.7 (95%CI: 1.4- 10))和HOTAIR高表達p=0.026 (HR=3.3 (95%CI: 1.2-9.6))被確定為患者人群中死亡的唯一顯著預測因素(表2)。

集團	Log-rank (Mantel-Cox)測試	x平方分布	p值	生存曲線 明顯不同?	風險比(Mantel-Haenszel)	比率的95% CI
性	男性與女性	1日19	0275年	沒有	1, 8	0, 63 5, 1
年齡	> = 65 vs < 65	4, 61	0032年	是的	3、2	1, 1到9,3
本地化	GEJ vs眼底/語料庫/腔	0, 37	0545年	沒有	1、3	0, 52歲,5
	GEJ vs語料庫/眼底	0, 03	0864年	沒有	0, 89	0, 23日至3、4
	GEJ vs腔	0, 86	0353年	沒有	1、7	0, 56 - 5 0
	語料庫/眼底vs腔	0, 66	0418年	沒有	2、0	0, 38到10
勞倫分類	擴散和腸	0, 16	0686年	沒有	1，2	0, 46歲,2
圍神經的入侵	是和不是	1, 07年	0301年	沒有	1、7	0, 61 - 4, 7
血管內增長	是和不是	0, 27	0602年	沒有	1，6	28日至9日,0 0
TNM	我+ II和III + 4	4日00	0044年	是的	3、7	1, 4 - 10所示
	T3/4 vs T1/2	0, 46	0498年	沒有	1，4	0, 51到4,1
T	T3 vs T1/2	0 01	0942年	沒有	0, 95	0, 21 - 4, 2
	T4 vs T1/2	1日00	0318年	沒有	1, 8	0, 58歲,3
	T4、T3	1、21	0272年	沒有	1、9	0, 60 6, 1
N	N0和N1 +	0, 03	0868年	沒有	1, - 1	0, 41歲,9
米	M0、M1	0, 23	0629年	沒有	0, 67	0, 13 - 3, 5
熱空氣	高與低	4, 94	0026年	是的	3334年	1、2到9、6

表2:生存分析。

HOTAIR過表達誘導HFE145細胞增殖

為了研究HOTAIR在細胞增殖和遷移中的作用，我們在正常的胃上皮HFE145細胞中過表達HOTAIR。我們發現，轉染HOTAIR使倍增時間從20.9小時(±1.6小時)減半至10.8小時(±0.5小時)(p<0.05)(圖2 A和B)。因此，HOTAIR的高表達使細胞增殖加倍，從而增加了細胞的致癌潛力。HOTAIR過表達在12小時內沒有影響HFE145細胞在細胞膜上的遷移(圖2c和D)，這意味著我們在這些實驗中沒有發現轉移潛力的增加。

圖2:HOTAIR誘導胃HFE145細胞增殖:HFE145細胞分別轉染LZRS-HOTAIR表達載體(紅色)或空LZRS對照載體(藍色)。
(A, B)HOTAIR誘導增殖，使HFE145加倍時間縮短50% (p<0.05)。
(C, D)相比之下，HOTAIR不促進細胞的遷移。增殖試驗N=6，遷移試驗N=4。
*表示與對照組細胞差異顯著p<0.05。

抑製HDAC抑製HOTAIR的表達

我們之前已經證明了miR-449在胃癌[21]中的表達下調。我們進一步證明miR-449靶向HDACs並抑製胃癌細胞[21]的生長。hox簇在一定程度上受表觀遺傳控製，因此miR-449可以調控其表達。此外，Chiyomaru等人[22]已經表明，HOTAIR是miR-34a的直接靶標，而miR-34a是一種與miR-449具有相同種子序列的miRNA。相同的種子序列使miRNAs能夠靶向相同的序列，這表明miR-449在HOTAIR下調中的作用。因此，我們假設miR-449通過直接或間接調節HOTAIR來抑製胃癌細胞的生長，因此我們研究了miR-449過表達如何影響HOTAIR的表達。我們發現轉染miR-449到SNU638細胞會導致HOTAIR表達的減少(圖3A)。miR-449靶向多種信號通路，發現miR過表達可激活p53(圖3B)[21]。通過5-FU或Nutlin-3處理激活p53會增加HOTAIR的表達(圖3c和D)，因此不能解釋miR-449轉染後HOTAIR表達的降低。然後，我們尋找miR-449可以調控HOTAIR表達的其他機製，並發現miR-449靶向HDAC1和-2(圖4 A和B)。因此，我們測試了HDAC1和-2的siRNA敲除如何影響HOTAIR表達。 First we confirmed the knockdown of HDAC1 and -2 by RTq-PCR and Western blotting (Figure 4 C and D). We found that siRNA knockdown of HDAC1 and -2 alone and especially combined led to a marked reduction in HOTAIR expression (Figure 4E). The effect of HDAC inhibition on HOTAIR expression was further confirmed with a dose dependent reduction in HOTAIR expression by the HDAC inhibitor Vorinostat (Figure 4F). Thus, we conclude that miR-449 regulates HOTAIR expression by either directly targeting HOTAIR or indirectly through the inhibition of HDACs.

圖3:過表達miR-449會降低HOTAIR的表達，但激活p53不會降低HOTAIR的表達
(一)轉染miR-449後，HOTAIR在SNU638細胞中的表達減少。
(B)Western blotting證實轉染miR-449可增加p53的表達。
(C, D)qRT-PCR結果顯示，在5-FU或Nutlin-3誘導的p53激活後，HOTAIR表達增加。所有療程均為24小時。
*表示與對照組細胞差異顯著p<0.05。

圖4:抑製HDACs可降低SNU638細胞中HOTAIR的表達。
(A, B)miR-449過表達後，HDAC1和HDAC2 mRNA和蛋白的表達降低。(C, D)RTq-PCR和Western blotting證實HDAC1和HDAC2敲除。(E)siRNA敲除HDAC1和HDAC2後，HOTAIR mRNA表達減少。(F)HDAC抑製劑Vorinostat劑量依賴性地降低HOTAIR的表達。所有療程均為24小時。
*表示與對照組細胞差異顯著p<0.05。

討論

局部浸潤和遠處微轉移往往在手術時無法檢測到，是癌症相關死亡的主要原因。因此，為了個體化和強化圍手術期治療，盡早發現生物標誌物以識別高危複發和生存期短的患者是很重要的，最好是在診斷時就發現。

在本研究中，我們發現HOTAIR在食管、GEJ和胃腺癌活檢組織中最高上調至690倍，且HOTAIR高表達與生存率差相關。在乳腺癌[10]、肝癌[23]、結直腸癌[24]和最近胃癌中，HOTAIR的誘導也被發現是遠處轉移和死亡發展的有力預測因子，獨立於已知的臨床和病理危險因素，如腫瘤大小、分期和激素受體狀態，支持本文提出的結果[25,26]。HOTAIR在HOXC位點表達，通過招募PRC2[7]抑製HOXD簇。HOTAIR的過表達伴隨著染色質狀態的改變，使PRC2被招募到上皮細胞中正常情況下不與PRC2結合的基因上，導致抑製腫瘤轉移的多個基因[27]的表達下調。HOTAIR過度表達調控的基因包括CDH1靶基因[24]，該基因與胃腺癌[28]侵襲性增加和轉移發展有關。這很可能是HOTAIR過表達易導致胃、食管和GEJ腺癌預後不良的機製之一。

我們發現HOX簇中HOTAIR編碼的異常表達與胃癌的進展有關。在本研究中，我們證實了HOTAIR過表達誘導正常胃上皮細胞的增殖，與食管鱗狀細胞癌[29]、胃腸道間質瘤[30]、結直腸[24]、胰腺[31]、肝細胞[23]和乳腺[10]癌和細胞係的觀察結果平行。結合早先的報道[10,13,24-26]，這表明HOX簇轉錄本的轉錄控製失調對胃癌的發生很重要。多項研究表明，HOTAIR的高表達導致包括胃癌在內的多種癌症的不明顯轉移增加。我們測量了過表達HOTAIR後非癌細胞係HFE145在膜上的遷移能力，在12小時內沒有發現任何遷移增加。然而，我們沒有研究HOTAIR過表達對細胞通過遷移以外的其他方式傳播和轉移能力的影響，如粘附喪失、生長因子表達和染色質狀態重構。目前對控製HOTAIR表達的過程知之甚少。因此，精確的轉錄控製需要進一步闡明。在本研究中，我們發現miR-449可能通過直接靶向HOTAIR或靶向HDACs引起HOTAIR的下調。將HOTAIR作為miR-449的直接靶點超出了本文的範圍。 HDACs deacetylate histones and tighten their interaction with DNA, resulting in the inhibition of gene transcription [32]. Here we showed that inhibition of HDAC1 and -2 leads to a loss of HOTAIR expression. Thus HDACs may inhibit the transcription of HOTAIR repressors, although this needs further investigation. The reduction of HOTAIR expression by siHDAC and vorinostat implies that treatment with HDAC inhibitors may have a role in gastric cancer therapy, which has also been suggested by Claerhout et al. [17]. In support of this, high HDAC expression is associated with poor prognosis in gastric cancer [16].

結論

總之，HOTAIR的表達升高增加了胃癌細胞的增殖，並與胃癌患者的不良預後相關，這證實了最近的研究結果[26]。我們的數據顯示，miR-449和HDAC可能參與胃癌中HOTAIR的調控，但這需要進一步的研究。胃腸道腫瘤中HOTAIR的高表達應進一步研究，以區分癌症風險增加和可能需要更廣泛的手術和/或積極的圍手術期化療。

致謝

感謝Mette Hedegaard Moldaschl提供的專家技術援助。這項工作得到了丹麥MRC (LFH)、諾和北歐基金會(LFH)、哥本哈根大學、衛生和醫學科學學院(JABS)、腫瘤研究基金會(MG)和羅氏公司(MG)的支持。

作者的貢獻

JS、MG、LiB和BF采集了本文的數據。JS, MG和LFH獲得了資金，設計了研究，分析和解釋數據，並起草了手稿。JS, LiB, BF和LFH對手稿中重要的知識內容進行了批判性的修改。JS進行分子生物學研究，MG進行統計學分析。BF進行了病理評估。LFH監督了這項研究。所有作者閱讀並批準了最終稿件。

的利益衝突

作者聲明沒有利益衝突。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Strickertsson JAB, Grunnet M, Bardram L, Federspiel B, Friis-Hansen L (2017) miR-449和HDAC調節HOTAIR表達，預測切除的胃食管腺癌的不良預後，並使HFE145細胞增殖率加倍。J Gastric Disord Ther 3(2): doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-8689.135

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出版的曆史:

收到日期:2017年9月26日

接受日期:2017年11月08

發表日期:2017年11月10