摘要

在涉及暴力事件的刑事調查中，血液是一種常見的生物液體，通過洗錢可以減少嫌疑人衣服上液體的視覺痕跡。本研究旨在分析洗滌的效果和商用血液增強試劑的應用，通常用於改善稀釋血跡的可視化及其對DNA恢複的影響。增強試劑匈牙利紅，考馬斯藍，阿米多黑，魯米諾，藍星^®法醫瑪格南和含水的亮色水晶紫(LCV)被用於在洗滌後增強棉花、聚酯、牛仔布和羊毛上的人血。用QIAamp從這些樣本中提取DNA^®DNA調查員小試劑盒，用NanoDrop進行量化^™米一台C紫外可見分光光度計。這項研究揭示了以過氧化物酶為基礎的試劑對天然織物產生最大的敏感性，在1:1000的血液稀釋率下都能產生陽性反應。蛋白質試劑對合成纖維產生了更大的敏感性，在血液稀釋率為1:10時都能產生陽性反應。過氧化物酶染色依賴於化學發光特性而不是比色結果，在深色織物上產生了陽性結果，因為與蛋白質染色沒有獲得充分的顏色對比。提取DNA的結果表明，盡管清洗和強化，可量化的來自血跡的DNA仍然存在。此外，測量表明，一些血液增強試劑的應用，特別是阿米多黑，可能會影響DNA的恢複。

關鍵字

Coomassie藍色;過氧化物酶

簡介

在刑事和法醫調查中，犯罪者和受害者之間的聯係往往是調查人員能找到的最具譴責性的證據。正如法醫學家的工作是揭露這種聯係一樣，犯罪分子也會采取必要的步驟，將這種聯係被發現的可能性降到最低。血液證據在暴力犯罪案件中很常見，犯罪嫌疑人試圖銷毀這種證據並非不可能，因為它的存在可以作為罪犯、受害者和犯罪之間的聯係。通常，這些汙點可以被犯罪者清洗或洗去，希望清除證據，減少他們與犯罪的聯係。雖然清洗帶血的衣服可能會去除更明顯的可見血跡，但潛在的痕跡可能會保留下來，這是必須的，這一證據的證明價值不能僅僅因為衣服被洗過而被忽視。洗掉衣服上的血跡會產生稀釋的汙漬，通常很難發現。之前的研究研究了洗滌對血跡的影響[1-3]，但沒有使用多種增強試劑進行綜合分析。有幾種方法可供法醫科學家使用，可以幫助增強稀釋的血跡。可用於檢測微量血液的兩種主要試劑是過氧化物酶汙漬和蛋白質汙漬。每一種染色方法都利用血液成分中發現的不同特性來產生可以表明血液存在的反應。

血液用過氧化物酶試劑與血紅素中的鐵發生反應，在氧化劑存在的情況下產生比色結果。由於血紅素的過氧化物酶活性，血紅素作為染料和過氧化物反應的催化劑，染料在其中被氧化，產生快速的顏色變化。雖然一些基於過氧化物酶的試劑可以產生比色變化的結果，但其他試劑則產生化學發光的結果。過氧化物酶增強試劑包括假定的血液測試，如含水的Leuco Crystal Violet, luminol和Bluestar®Forensic Magnum。雖然這些方法表明血液可能存在，但它們並非毫無阻礙，不能用來暗示血液絕對存在。許多基質，包括一些植物材料、清洗液、金屬和其他鐵源，即使在沒有血[4]的情況下，這些汙漬也可能產生陽性結果。

另一方麵，蛋白質試劑與胺或血液中所有蛋白質中存在的其他基團發生反應。這些汙漬的例子包括匈牙利紅、考馬斯藍和阿米多黑。當應用蛋白質增強試劑來檢測稀釋的血跡時，采用三步法。首先，將汙漬固定在表麵。修複血漬需要破壞二級和三級蛋白質結構，改變親水性區域，使蛋白質不易溶解。這可以防止在使用其他試劑時血跡擴散。第二，蛋白質特異性染色。通常，蛋白質試劑由有色的有機芳香分子組成，既提供可見的顏色，又能與材料結合。這些染料與血液中發現的蛋白質結合，並在最後一步:去染色中保持存在。去染色包括去除多餘的染料，使識別的血液圖案和背景基質之間有更好的對比。 While protein stains are not confirmatory for blood, they provide an inexpensive method of locating potential blood patterns on both porous and non-porous surfaces. Protein stains are not typically considered the first method of choice for blood identification/enhancement as a result of their lack of specificity. They are however, frequently used to enhance weak/dilute bloodstains with impression evidence, such as bloody fingerprints or footwear impressions. Protein stains are the favored choice when dealing with this evidence type as they typically adhere to the residues left behind, while the peroxidase reagents can cause a more dispersive reaction. Many of these reagents, both protein and peroxidase based, are inexpensive, easy to use, and can generally be used on porous or nonporous substrates, including fabrics.

盡管有可能引起懷疑並有助於重建犯罪，但僅憑洗過的衣服上的血跡往往不足以對一個人參與犯罪的性質和情況作出結論性的推斷。正因為如此，有一種方法既能提高法醫科學家在一塊洗過的布料上可視化稀釋血跡的能力，又能維持和保存可能存在的DNA證據的質量，這是至關重要的。雖然有許多血液增強試劑可用，但這些試劑的應用對從血跡中恢複DNA的能力的影響還在探索中。盡管圍繞這一主題的許多研究認為，盡管使用了增強試劑，仍然可以獲得完整的DNA圖譜[5-10]，但也有一些研究認為，使用這種試劑可能會減少DNA的恢複，特別是在長時間暴露[9]後。為了保存可能對調查至關重要的DNA證據，必須仔細檢查每種試劑對DNA恢複的影響。這項研究首先旨在提供對蛋白質和過氧化物酶血液增強試劑的選擇的綜合分析，以洗滌血跡，在各種不同的織物類型，在一係列稀釋。第二個目的是研究這些試劑對從汙漬中恢複可量化DNA能力的影響。

材料和方法

血液采集

經紐黑文大學機構審查委員會(IRB)批準後，在知情同意的情況下從誌願者身上采集靜脈血。收集並儲存在無菌真空EDTA小瓶中，並在4°C冷藏，直到需要。

樣品製備

選擇了六種常用的和市售的血液增強試劑，其中包括;匈牙利紅，考馬斯亮藍，阿米多黑，水性亮晶紫，魯米諾，和藍星®法醫Magnum，(所有購買自Sirchie®，揚斯維爾，北卡羅來納州，美國)。為了用幹淨稀釋的血液測試試劑，我們從當地商店購買了五種不同類型的純成分織物，包括白棉、黑棉、白色滌綸、黑色滌綸和藍色牛仔布。為了製作能準確代表在刑事調查中發現的樣品，每一種麵料都作為製成品購買，並使用服裝標簽作為服裝成分的指示。為了最大限度地減少血液樣本沉積之前存在於織物上的血液或DNA的可能性，每個織物樣本都要清洗，然後使用Spectrolinker™XL-1500 UV交聯器處理20分鍾。色板(約。分別製備6種增強試劑所需的5種麵料的8 × 6英寸)，並將100 μL人血按7種稀釋倍數滴在每個樣品上;整齊，1:10,1:100,1:1000,1:10萬，1:10萬，1:10萬，1:10萬。每個樣本一式三份，結果是90個獨立的樣本，包含630個獨立的汙漬。為了測試試劑對DNA恢複的影響，我們選擇了四種不同類型的麵料，並從當地商店購買了純成分的麵料，包括白色棉花、白色聚酯、藍色牛仔布和棕色羊毛。 100 μL of neat human blood was deposited onto each fabric type. Each sample was performed in triplicate and photographed prior to laundering. 100 μL of molecular grade sterile water was deposited onto the control samples. All samples were allowed to dry for twenty-four hours at ambient temperature prior to laundering.

洗錢

所有樣品在30°C的標準洗滌條件下洗滌。每組重複分別洗滌。所有洗滌周期參數在每個織物類型的重複之間保持一致。洗淨後，所有樣品從洗衣機中取出，晾幹24小時。

增強

所有的樣品都在使用6種選定的增強試劑洗滌後增強。由於織物的多孔性，選擇噴霧技術而不是將樣品浸泡在試劑中。在使用每種試劑之前，對未衝洗的血液樣本進行對照試驗。

氨基黑:阿米多黑是按照製造商提供的說明使用的。將1克胺黑和10克檸檬酸混合形成工作溶液。加入500毫升dd攪拌30分鍾。用100毫升冰乙酸和900毫升甲醇的漂洗溶液稀釋工作，以1:4的比例。每個樣品噴灑稀釋的酰胺黑工作溶液。在血跡形成時，用漂洗溶液噴灑織物，直到達到充分的對比。樣品幹燥24小時後提取DNA。

匈牙利紅:匈牙利紅是按照製造商提供的說明使用的。每個樣品都噴有提供的匈牙利紅溶液。讓染料凝固一分鍾，然後在織物上噴灑1:1 dd的醋酸混合物，直到獲得足夠的對比。在提取DNA之前，讓樣本幹燥24小時。

Coomassie藍色:考馬斯錫藍是按照製造商提供的說明使用的。將4克考馬斯色藍與200毫升甲醇和200毫升ddH混合，形成工作溶液₂O, 40 mL冰乙酸。將450毫升甲醇和450毫升ddH混合製成漂洗溶液₂O，和100ml冰醋酸。每個樣品都噴有考馬斯藍工作溶液。等待60秒使血漬顯現，然後用漂洗溶液噴灑樣品，直到獲得足夠的對比。樣品幹燥24小時後提取DNA。

含水亮色水晶紫:根據製造商提供的說明，使用含水的淺色結晶紫。使用所提供的組件創建了一個工作解決方案。每個樣品都噴有含水晶紫工作溶液。樣品幹燥24小時後提取DNA。

魯米諾:魯米諾是按照製造商提供的說明使用的。將所提供的成分結合起來，輕輕搖晃，直到粉末完全溶解，就形成了工作溶液。每個樣品都在黑暗中噴灑工作溶液。樣品幹燥24小時後提取DNA。

藍星^®法醫萬能:藍星^®根據製造商提供的說明使用法醫馬格南。將所提供的成分結合起來，輕輕旋轉，直到藥片完全溶解，就形成了工作溶液。每個樣品都在黑暗中噴灑工作溶液。樣品幹燥24小時後提取DNA。

攝影:每個樣本的照片都是使用佳能EOS Rebel T3i數碼單反相機(18.0 MP)在血液沉積、洗滌和使用自動設置和手動聚焦增強試劑應用後的每個階段拍攝的。對於血液增強試劑顯示化學發光結果，照片使用光圈f/8, ISO值400，快門速度45秒。這些照片是在試劑應用過程中在黑暗中拍攝的，在照片收集過程中，房間的燈被迅速打開和關閉，以使織物樣品的可視化。

DNA提取:在完成所需的處理後，用無菌剪刀剪出每個血跡，並將其置於無菌的2ml微型離心管中。使用QIAamp®DNA調查員試劑盒進行DNA提取，步驟改編自QIAamp®DNA調查員手冊中的“從體液汙漬中分離總DNA”協議。最後一步洗脫，將30 μL所提供的緩衝ATE塗於柱膜中心，室溫孵育5分鍾。管子以每分鍾14000轉的速度離心1分鍾。離心後，柱被丟棄。洗脫液保存在-20°C直到需要。

DNA定量:使用NanoDrop™One C UV-Vis分光光度計定量每種提取物中存在的DNA。選擇雙鏈DNA定量參數，用QIAamp®DNA研究者試劑盒中提供的1 μL Buffer ATE對儀器進行空白處理，取1 μL DNA提取液置於底座上，記錄樣品中DNA的濃度。每個DNA提取樣本定量三次，濃度報告為三次測量的平均值。

結果

增強試劑敏感

清洗後對幹淨血液的增強和對不同麵料的稀釋結果顯示，過氧化物酶試劑(魯米諾、LCV和Bluestar®Forensic Magnum)對天然麵料(白棉、黑棉和牛仔布)的敏感性最高，因為它們對1:10 00以下的麵料都有陽性反應。然而，當蛋白質試劑被測試時，與過氧化物酶試劑相比，它們在白色聚酯上顯示出最大的靈敏度(1:10)，而過氧化物酶試劑隻在洗淨的幹淨血液上產生陽性反應。由於蛋白質基試劑是顏色反應，而不是基於化學發光，因此在深色織物上使用時，即使得到了陽性反應，由於深色背景和顏色反應之間缺乏對比，結果也不可見，結果不確定。所有試劑在1:10萬、1:10萬和1,000,000樣品上均為陰性。圖1顯示了白棉上增強反應的樣本圖像。所有增強試劑與測試對照樣品的反應均符合預期。

圖1:在白棉上洗滌後血液增強反應的圖像
(A)亮色水晶紫
(B)魯米諾
(C)藍星^®法醫萬能
(D) Coomassie藍色
(E)匈牙利紅
(F)氨基黑。

表1:洗滌後的增強結果顯示每種試劑對不同類型織物的敏感性。表示沒有反應，而a特遣隊表示每個試驗的反應都是積極的。1: 1000以上的樣本均為陰性。
關鍵詞:L =魯米諾;BFM = Bluestar®Forensic Magnum;含水亮色結晶紫;HR =匈牙利紅;CB =考馬斯色藍;AB = Amido Black。✘

DNA複蘇

盡管清洗和應用了增強試劑，但從每個樣品中獲得了可量化的DNA。總體而言，洗滌和強化血樣(平均15.9±8.3 ng/μL)的DNA回收率低於未洗滌血樣(平均18.0±1.5 ng/μL)。洗滌後的空白樣品(平均8.6±3.7 ng/μL)的DNA回收率高於未洗滌的空白樣品(平均3.6±3.9 ng/μL)，說明在洗滌過程中可能存在DNA轉移，如圖2所示。

圖2:從經增強試劑處理的織物樣品中提取DNA，包括對照組。

所有織物類型的DNA產量為;匈牙利紅(平均14.1±6.2 ng/μL)、Commassie藍(平均13.0±10.2 ng/μL)、luminal藍(平均15.4±7.2 ng/μL)、Bluestar®Forensic Magnum藍(平均18.3±8.6 ng/μL)和洗滌(未處理)血樣(平均14.1±7.3 ng/μL)。LCV(平均29.9±14.3 ng/μL)處理的樣品DNA回收率最高。胺黑處理的樣品(平均4.6±2.8 ng/μL)的DNA回收率最低，與未洗滌的空白樣品(平均3.6±3.9 ng/μL)相當，表明胺黑對DNA回收率有影響。棉花的DNA回收率最低(平均為6.0±3.6 ng/μL)。牛仔布樣品在洗滌和使用增強試劑後DNA含量最高(平均24.8±11.6 ng/ μL)。聚酯(平均16.9±7.3 ng/μL)和羊毛(平均15.8±13.0 ng/μL)樣品產量相當。

討論

當帶血的衣服被清洗時，汙漬變得更稀，如果不進行處理或增強，就無法通過視覺檢測。以前的一些研究已經證明了使用蛋白質和過氧化物酶增強試劑增強血跡的能力。由於蛋白質和過氧化物酶試劑的配製是為了增強血液痕跡，否則無法檢測到，該試劑的工作是在洗滌織物基質[12]上的稀釋血跡之間提供充分的對比。蛋白質染色常產生彩色反應，常用於增強印痕證據中的稀/弱血跡，如血跡指紋和鞋印。但特異性較低，染色前需固定，染色後需去染色。在整個研究過程中，固定和分離過程是耗時和繁瑣的，特別是與使用過氧化物酶試劑的一步反應相比。固定是沉澱基本蛋白和防止血液浸出的必要條件。固定方法有很多，如交聯、脫水、沉澱或破壞二級/三級結構[13,14]。5-磺基水楊酸固定安全、有效、方便，是首選的固定方法。所需的固定和去染色步驟可能會對DNA的恢複產生影響，因為它引入了額外的步驟，可能會導致本已非常微小的DNA水平的丟失。 In this study, samples treated with amido black post laundering revealed the lowest recoverable yields of DNA and it is possible the fixation and de-staining procedures contributed to this low yield recovery. The peroxidase reagents that produce chemiluminescence with blood, luminol and Bluestar^®法醫馬格南，有明顯的優勢，麵料的背景顏色沒有影響，因為反應可以在光明和黑暗的表麵上可視化。在本研究中觀察到，使用化學發光試劑在深色織物上得到陽性反應，而使用顯色反應試劑得到的顏色對比不足，無法記錄結果。魯米諾最早由Albrecht HO[16]描述，Specht HW[17]介紹了魯米諾在法醫領域的應用。多年來，人們提出了一些方案;但是Grodsky配方仍然是金標準[18]。藍星^®法醫瑪格南是一種基於魯米諾配方的商業產品。然而，它克服了魯米諾遇到的一些困難，並產生了更持久的化學發光[19]。本研究觀察到藍星陽性反應產生明亮和持久的反應。事實上,藍星^®可在正常光線下顯示，消除了魯米諾所需的完全黑暗，為現場使用提供了明顯的優勢。然而，一些物質會幹擾魯米諾/藍星®反應。有些會產生假陽性結果，如過氧化物酶、金屬離子和其他氧化劑，如次氯酸鹽[4]。而其他物質可能抑製魯米諾反應，產生假陰性結果，如化學發光猝滅劑(如氧和叔氨基酸)和抗氧化劑[20,21]。標準家用漂白劑含有次氯酸鹽，使用魯米諾會產生假陽性結果。然而，這種反應會產生更明亮的閃光，並且很容易被有經驗的法醫科學家識別。然而，如果犯罪者在洗衣服過程中使用家用漂白劑，則有風險。當潛在的洗過的潛在汙點確實是血時，可能會報告假陽性。這項研究沒有包括任何含洗滌劑的漂白劑，因此需要在未來進一步調查。這項研究強調了廣泛的血液增強試劑可用的商業，並需要謹慎的策略選擇試劑。 The ability to visualize bloodstains on articles of clothing following laundering with the assistance of enhancement reagents indicates that components of blood remain in the fabric even after this treatment, suggesting that DNA may persist on the clothing as well. Previously, studies have indicated that DNA persists despite attempts to clean up evidence through laundering [5,7, 22,23]. One such study [24], investigated the effects of laundering on the ability to recover DNA from semen stains on various items of clothing. This study found that DNA could be obtained from items of clothing despite laundering, and found that the DNA yield they obtained did not significantly diminish as the number of wash cycles increased. Additionally, the study found that items of unstained clothing in the wash with stained items also had quantifiable amounts of DNA recovered, indicating the potential for DNA transfer from one article of clothing to another during the wash cycle [24]. This is in agreement with this research study where DNA was recovered from previously unstained samples which had been laundered with stained samples. Other studies have also indicated the ability to obtain full DNA profiles following the application of enhancement reagents [7,9]. Although no studies have been published to date in regards to DNA collection following both laundering and enhancement of blood stains, studies such as this one are indicative of its plausibility. In this study, across all fabric types, laundered samples treated with Amido Black had a low DNA recovery when compared to samples treated with the 5 other blood enhancement reagents. Although it cannot be said that DNA profiles would be unattainable from laundered bloodstains enhanced with this reagent. Amido Black differed from other protein reagents in its composition; unlike Hungarian Red and Coomassie Blue, Amido Black working solution and wash solutions were prepared with a significant amount of methanol, acetic acid, and citric acid in comparison to water. Since DNA is a highly reactive molecule, it is possible that interactions between these compounds led to a higher rate of DNA degradation. Because of these results, caution should be used when choosing Amido Black as an enhancement reagent for blood on laundered clothing. Additionally, water-based working solutions should be chosen over methanol-based working solutions when possible.

在這項研究中，在每一種類型的織物中，可量化數量的DNA被證明在洗滌過程和血液增強試劑的應用中持續存在。盡管洗過的血液樣本的DNA回收率通常低於未洗的血液樣本，但所有麵料上洗過的樣本都有足夠的DNA存在，以便可能產生證明的DNA譜。同樣，除Amido Black外，所有增強試劑處理的樣品的DNA產量都高於空白樣品。由於高溫和濕度等因素可以通過加速連接DNA分子的鍵的斷裂來幫助DNA降解，可以預期的是，清洗和增強試劑的應用過程將導致DNA回收率的降低。從整體上看，洗滌過的空白織物樣品比未洗滌的空白織物樣品有更高的DNA恢複量;然而，除了洗滌之外，這些樣品被完全相同地處理。因此，有人認為，在洗滌過程中，DNA在樣品之間的交叉轉移是可能的。因為這些空白樣本與在清洗過程中浸泡在水中的其他樣本處於相同的環境中，這很可能導致血液樣本中的DNA在從織物上清洗時轉移到空白樣本中。這一結果與先前的研究一致，表明在洗滌過程中，DNA從精液染色的衣服交叉轉移到未染色的衣服[24]。在選擇增強試劑時，重要的是法醫不僅要選擇對其他潛在證據類型破壞性最小的方法，還要考慮汙漬的來源和交叉轉移的可能性。

結論

本研究的結果提供了一個有價值的分析，DNA的持久性在各種織物洗滌和處理後，與市售血液增強試劑。結果表明，盡管在整個法醫調查過程中通常使用商業上可用的蛋白質和過氧化物酶試劑進行清洗和增強，但來自血跡的可量化的DNA仍然存在。這一結論支持了在調查過程中不應忽視洗過的衣服的觀點，並可能產生關於發生的暴力犯罪的證據和識別信息。結果還表明，血液增強試劑的應用，包括Amido Black，可能會影響DNA的恢複能力。正因為如此，建議法醫在選擇增強試劑時要謹慎，並考慮到DNA的持久性。這一信息為法醫專業人員提供了寶貴的資源，以便在未來做出決定時既能增強對洗過衣服上稀釋的血跡的可視化能力，又能保持可能存在的DNA證據的完整性。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Hartley G, Glynn CL(2017)洗滌後蛋白質和過氧化物酶血液增強試劑的比較分析及其對DNA恢複的影響。法醫鑒定1(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2577-7262.101

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出版的曆史:

收到日期:2017年8月01

接受日期:2017年8月22日

發表日期:2017年8月25日