摘要

阿斯巴甜是一種低熱量的糖，廣泛用於人造甜味劑中。盡管不同的研究表明與它相關的健康症狀，但它仍然是有爭議的。研究還表明，阿斯巴甜的攝入會導致大鼠腦神經功能障礙，並且可以觀察到阿斯巴甜對大鼠腦細胞凋亡的線粒體激活作用。在這項研究中，測定了阿斯巴甜短期暴露後遠端腎小管細胞的生化反應。MDCK II型(腎髒)細胞暴露於50µg/ml ~ 250µg/ml的阿斯巴甜中30分鍾。測量了線粒體相關的生化反應，如氧化應激和能量產生。觀察到脫氫酶活性的總體增加和ATP產量的增加。這伴隨著線粒體來源的氧化應激的整體增加。而阿斯巴甜暴露細胞的線粒體膜電位和細胞NAD/NADH比值保持不變。這些結果表明，雖然阿斯巴甜沒有引起線粒體活性的顯著變化，但通過增加ATP生產和氧化應激顯示的線粒體活性升高表明，線粒體參與了阿斯巴甜介導的細胞反應。 More studies would need to be done to clarify the mechanism by which aspartame increases oxidative stress通過線粒體。

關鍵字

氧化應激;線粒體;阿斯巴甜;Malate-aspartate航天飛機

縮寫

MDCK-Madin-Darby犬腎髒;ATP-Adenosine三磷酸;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸;nadh還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸;•阿₂——超氧化物陰離子;H₂O₂過氧化氫;AOA-Aminooxyacetate;DCF-HAD-2 ', 7 ' -二乙酸Dichlorodihydrofluorescein;(MTT-3) - 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl四唑溴化;MAS-Malate天冬氨酸穿梭;MMP或ΔΨm-線粒體膜電位;IMM-Inner線粒體膜;jc -1- 1h -苯並咪唑，5,6-二氯-2-[3-(5,6-二氯-1,3-二乙基-1,3-二氫- 2h苯並咪唑-2-丙烯]-1,3-二乙基-碘化物

簡介

人工甜味劑是作為糖替代品使用的食品添加劑。在過去的幾年裏，它們變得非常受歡迎，因為它們聲稱可以促進減肥，而且糖尿病患者食用它們是安全的。阿斯巴甜、糖精和甜菊糖等人工甜味劑已被美國食品和藥物管理局(FDA)認定為可安全食用。人造甜味劑的主要好處是，這些化學物質不會影響血糖或胰島素水平，因此它們被用於不同的軟飲料和食品中。因此，阿斯巴甜被糖尿病和肥胖人群廣泛使用，因為它有助於減少能量攝入和調節血糖水平。然而，許多關於阿斯巴甜毒性的健康問題已經被提出。研究表明，阿斯巴甜代謝會產生甲醇作為一種副產物，對大鼠[2]的氧化應激負責，而其他研究表明，喂食阿斯巴甜的大鼠患上了腦瘤[3]。在Horio Y等人的一項研究中，阿斯巴甜誘導神經元細胞係PC12的細胞死亡，提示其通過產生活性氧(ROS)[4]參與線粒體凋亡途徑。一項流行病學研究還表明，食用阿斯巴甜有可能導致癌症發展。該研究比較了197名被診斷為尿路腫瘤的患者和397名對照組患者。 The authors reported that the risk of urinary tract tumors was significantly increased upon long-term exposure (more than 10 years) to artificial sweeteners, including aspartame [5]. Besides urinary tract tumors, the carcinogenic effect of aspartame was also reported [6]. In albino rat models, daily administration of aspartame resulted in reduced activities of antioxidant enzymes and increased oxidative stress markers in the kidney and liver [7].

氧化應激是ROS的產生和抗氧化防禦[8]之間缺乏平衡，導致氧自由基超過細胞[9]的抗氧化係統的狀態。自由基:氧化劑或ROS，如•O₂-(超氧化物)和H₂O₂(過氧化氫)通常由線粒體在正常的細胞代謝中產生，並被抗氧化劑如泛素-10維生素C和E[7]消除。線粒體是ROS的主要生產部位，在這裏，電子從電子傳遞鏈中泄漏出來，與分子氧結合形成•O₂-是大多數ROS的前體。超氧化物的形成部位如圖1所示。每個位點對整體超氧化物水平的貢獻是器官特有的，也取決於呼吸鏈的減少程度[10-12]。當線粒體不合成ATP，並且由於電子轉移緩慢而有較高的線粒體膜電位時，預計會產生更高的超氧化物。氧化應激引起的不平衡可以破壞重要的生物分子，如DNA或導致脂質過氧化，影響細胞膜和整個細胞[9]。長期維持這種氧化應激可導致ROS的產生，從而可能導致體細胞突變和腫瘤轉化[8]。因此，DNA突變或損傷的增加會導致異常細胞增殖和癌症的形成[8]。一項研究專門檢查了阿斯巴甜對馬丁達比犬腎(MDCK)細胞的影響。本研究發現，暴露於阿斯巴甜後，細胞活力下降，而線粒體衍生的活性氧化物種則以劑量依賴性的方式增加。本研究提示阿斯巴甜治療可能引起MDCK細胞[13]氧化應激。

圖1:超氧化物產生的部位。
電子傳遞鏈的複合體I到III是超氧化物的主要生產者，它被線粒體[16]中的超氧化物歧化酶轉化為過氧化氫。

本研究假設，阿斯巴甜水解為其氨基酸成分:天冬氨酸和苯丙氨酸，通過蘋果酸天冬氨酸穿梭增加細胞內氧化應激。在正常情況下，這個循環從天冬氨酸轉化為草酰乙酸開始，然後再轉化為蘋果酸。蘋果酸可以進入線粒體基質，在那裏它被氧化回草酰乙酸，草酰乙酸被轉化為天冬氨酸，並運輸回細胞質，在那裏循環再次開始[14]。在蘋果酸氧化成草酰乙酸過程中獲得的電子進入電子傳遞鏈，產生反應性氧化產物。如果天冬氨酸的含量增加，蘋果酸天冬氨酸穿梭體的活性也會增加。

在本研究中，主要目的是闡明阿斯巴甜對Madin-Darby犬腎細胞氧化應激急性作用的機製。通過測量蘋果酸天冬氨酸穿梭酶的活性、細胞內ATP的產生、線粒體膜電位的變化和線粒體來源的氧化應激的定量來測量線粒體功能。線粒體依賴性過程(如檸檬酸循環)活性的升高可能因此產生大量的活性氧化物種，並導致氧化應激[15]的增加。

材料和方法

材料

Madin-Darby犬腎(MDCK) II型細胞購自歐洲鑒定細胞培養集(ECACC)。阿斯巴甜，ATP生物發光體細胞檢測試劑盒(FLASC)，還原β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)還原二鈉鹽，氨基乙酸(AOA)， 2 '，7 ' -二氯二氫熒光素二乙酸(DCF-HDA)， Trizma堿，Tris-HCl，阿斯巴甜，磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)， Dulbecco ' s Modified Eagle’s培養基(DMEM)從Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)獲得。NAD/NADH比色分析試劑盒購自Abcam Inc. (Cambridge, MA)。Mitosox Red、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)和青黴素鏈黴素購自Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)。

細胞培養

Madin-Darby犬腎(MDCK) II型細胞在添加10%胎牛血清和1%青黴素青黴素的DMEM中，在37°C和5%二氧化碳的潮濕培養箱中保存。細胞被允許在不同的培養容器中粘附一夜，然後用不含或含不同濃度阿斯巴甜的培養基替換。

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)測定法:MDCK細胞以每孔10000個細胞的密度鍍於96孔板中，並在37°C和5%的二氧化碳中放置過夜。第二天，在37℃條件下，將細胞暴露於濃度為0 ~ 250 μg/ ml的培養基中0.5和1小時。然後在細胞培養基中製備的0.5 mg/ml MTT中孵育細胞2小時。用50 μl二甲基亞碸(DMSO)溶解還原的紫色福瑪讚產物，用TECAN Sunrise微板閱讀器在550 nm下定量測定還原的福瑪讚。對所有樣本進行三次重複。

線粒體膜電位:BD MitoScreen (JC-1)試劑盒製備用於流式細胞術檢測的細胞樣品。首先，將t25燒瓶中的MDCK細胞分別用50 μg/mL或250 μg/mL的阿斯巴甜在CO中處理30分鍾₂孵化器。細胞經過胰蛋白酶化，1000rpm離心5分鍾。細胞在0.2 μM的sc -1工作液中重懸(按試劑盒提供的方案配製)，在CO中孵育₂培養15分鍾。在所有細胞樣品中加入2ml 1X Assay Buffer。樣品在400 × g離心5分鍾，重懸於1ml的1X測定緩衝液中。樣品在相同條件下再次離心，並在1X測定緩衝液中重懸。使用BD LSR Fortessa對細胞進行分析。平均熒光讀數在530 nm和590 nm處采集。對所有樣本進行三次重複。為了進行熒光成像，5萬個MDCK細胞被放置在6孔板上，並在CO2培養箱中放置一夜。第二天用0.2 μM JC-1 (BD Biosciences)處理15分鍾。細胞圖像使用EVOS熒光顯微鏡(Life Technologies)在GFP和RFP濾鏡下拍攝。 Next, the JC-1 solution was removed from the wells and PBS, 50 μg/mL and 250 μg/mL were introduced into one of each well. Images for the wells were taken right after adding the treatment and also at the end of 30 minute incubation with the treatments in a CO₂孵化器。

細胞內ATP水平:5萬個MDCK細胞被放置在24孔板上，在37°C和5%的二氧化碳中放置一夜。第二天，用PBS清洗細胞，並在37°C條件下，將細胞暴露於不同濃度(0 ~ 250 μg/ml)的阿斯巴甜0.5和1小時。細胞用PBS衝洗，用冰水溶解。使用移液管將細胞從孔中剝離，然後將裂解物煮沸3分鍾，隨後使用Sigma FL-ASC生物發光體細胞檢測試劑盒(Sigma- aldrich)中提供的程序進行ATP測定。使用96孔板測量熒光素-熒光素酶反應的化學發光，並在發光計(Victor3, PerkinElmer)中讀取。每個樣品中ATP的含量從2到100 pmol ATP的標準曲線中推斷出來，這個範圍產生線性響應。細胞內NAD⁺/ NADH NAD⁺和NADH水平分別用NAD/NADH檢測試劑盒(比色法)(Abcam Inc.)測定。簡單地說，為了測量NAD的總水平⁺NADH，從暴露於阿斯巴甜30min的MDCK細胞中獲得的裂解物轉移到96孔板中。按照套件中的描述進行測量。將標準NADH溶液和NAD連續稀釋，生成標準曲線⁺/NADH比值計算為[(NADtotal- NADH)/NADH]。

從腎髒組織中分離線粒體

C57BL/6NJ小鼠毒株經CO暴露後安樂死₂15分鍾。從他們中獲得的腎髒組織在冰分離緩衝液(2 mM Tris-HCl, 250 mM蔗糖，4 mM氯化鉀，2 mM EDTA, 04 g/L BSA pH 7.5)中洗滌並均質。取出的腎髒置於20毫升分離緩衝液中，切成小塊。懸浮液被放置在玻璃均質器中，並用一個緊密的玻璃杵將腎髒進一步磨成更細的顆粒。將勻漿轉移到50 mL管中，在Sorvall ST 16離心機(賽默飛世爾科學公司)中以1000 × g的速度離心10分鍾。提取上清，再以10000 × g離心10分鍾。丟棄上清液，將顆粒重懸於1ml分離緩衝液中。將得到的體積稀釋4倍，再次以10000 × g離心10分鍾。將得到的含有線粒體的顆粒重懸於300 μL的分離緩衝液中。在測定蘋果酸天冬氨酸穿梭酶(MAS)活性時，將懸浮液置於冰上。用Bradford法測定線粒體懸液的蛋白質濃度。

蘋果酸天冬氨酸穿梭酶(MAS)活性:在小鼠腎髒線粒體分離的同一天，測定了線粒體的蘋果酸天冬氨酸穿梭酶活性。對對照的蘋果酸天冬氨酸穿梭活性的測量是這樣進行的:2毫升含有300毫米甘露醇的緩衝液，10毫米KH₂阿寶₄， 10mm Tris-HCl, 10mm KCl, 5mm MgCl₂將pH為7.4的2 mM天冬氨酸與2 mM ADP、0.035 mM NADH、3 U/mL MDH和2 U/mL天冬氨酸轉氨酶(AST)混合在石英試管中。將0.1 mg線粒體懸濁液中的蛋白質添加到比色皿中，使用Agilent Technologies Cary 8454 UV-Vis在340 nm下測量NADH的基線氧化2分鍾。一旦基線氧化速率恒定，將5mm穀氨酸和5mm蘋果酸添加到比色皿中，以啟動蘋果酸天冬氨酸穿梭酶活性，並在接下來的4分鍾內進行測量。陰性對照，將0.2 mM AOA與線粒體提取物一起引入，並按上述方法測定MAS活性。在阿斯巴甜處理中，線粒體提取物分別與50 μg/mL阿斯巴甜、250 μg/mL阿斯巴甜、50 μg/mL阿斯巴甜- 0.2 mM AOA和250 μg/mL阿斯巴甜- 0.2 mM AOA孵育30分鍾。這些樣品的MAS活性被測量為對照，這裏使用的緩衝液缺少2mm天冬氨酸。對所有樣本進行三次重複。

ROS生成試驗:用流式細胞術測定ROS生成。等量的細胞被放入T25燒瓶中，在37°C和5%的二氧化碳中放置一夜。第二天，衝洗細胞，在100 μM ddf - hda中暴露30min。然後用不同濃度的0 ~ 250 μg/ml在HBSS/葡萄糖中製備的阿斯巴甜在37°C下處理細胞30分鍾。細胞經胰蛋白酶化後，以1000轉/分鍾的速度離心5分鍾。細胞微球在300 μl HBSS/葡萄糖中重懸，使用BD LSR Fortessa (BD Biosciences)，使用異硫氰酸熒光素(FITC)通道Ex/Em 495 nm/519 nm進行分析。對所有樣本進行三次重複。

使用MitoSox Red生產線粒體超氧化物:MDCK細胞置於T25燒瓶中，用5 μM Mitosox Red在37°c下孵育10分鍾，然後分別以50 μg/mL或250 μg/mL的阿斯巴甜處理30分鍾。治療後，細胞用PBS清洗和胰蛋白酶處理。細胞被重新懸浮在PBS中，並使用BD LSR Fortessa (BD Biosciences)進行分析。細胞的平均熒光讀數在590 nm處采集。對所有樣本進行三次重複。

統計分析:用Student 's t檢驗確定阿斯巴甜處理組和各自對照組之間差異的顯著性。數值以平均值±標準差(SD)表示，並由三次獨立實驗計算。P<0.05為差異有統計學意義，用星號*表示，P<0.05。

結果

阿斯巴甜對細胞活力的影響

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)是一種由脫氫酶或產生氧化還原等價物的其他酶係統還原的四唑鹽。因此，MTT的降低被用來作為細胞活力的一種衡量標準，以及指示細胞內脫氫酶的活性。MDCK細胞暴露於不同濃度的阿斯巴甜(10 μg/ml到250 μg/ml)中，30分鍾時脫氫酶活性沒有變化，表明細胞活力沒有下降(圖2)。然而，在孵育1h後，細胞在濃度為20、50和100 μg/ml時脫氫酶活性明顯高於對照組。在較高濃度的阿斯巴甜下，這種升高並不顯著(圖1)。這些結果表明，阿斯巴甜可能通過其副產物天冬氨酸刺激細胞內脫氫酶活性。

圖2:用不同濃度的阿斯巴甜處理MDCK細胞30分鍾和1小時，測定細胞活力。
MDCK細胞用阿斯巴甜處理30 min和1 h。細胞暴露於3-(4,5-二甲基噻唑-2 -基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)中，在550 nm處測定溶解的福馬讚產物的吸光度值。如果n=3時*p值<0.05，則認為值顯著。

用JC1測定阿斯巴甜對線粒體膜電位的影響

阿斯巴甜是由苯丙氨酸和天冬氨酸(天冬氨酸)通過甲醇連接在一起。身體將阿斯巴甜分解成它的副產品。天冬氨酸作為TCA循環的間合碳源通過富馬酸鹽和草酰乙酸鹽;讓我們測試了阿斯巴甜對線粒體膜電位(MMP)的影響，MMP是通過線粒體內膜(IMM)上的電子通量產生的，由NADH和FADH貢獻₂．這些電子載流子是在TCA循環中產生的，目的是將電子轉移到IMM上的電子傳遞鏈上。

JC1是一種染料，以單體的形式進入線粒體，發出綠色波長的熒光。線粒體去極化(膜電位)的存在導致這些單體聚集，產生j聚體，然後發出紅色波長的熒光。用流式細胞儀和熒光顯微鏡對細胞進行分析，結果分別見圖3A和圖B。圖4顯示，與流式細胞術測定的對照相比，50 μg/mL阿斯巴甜處理細胞的紅綠熒光比值增加，250 μg/mL阿斯巴甜處理細胞的紅綠熒光比值略有下降。然而，這些差異都不顯著。圖5顯示了MDCK細胞在各自處理前和處理後30分鍾的圖像，顯示了清晰的紅色熒光，表明阿斯巴甜處理的MDCK細胞和未處理的MDCK細胞的線粒體都處於通電狀態。

阿斯巴甜處理的細胞內ATP水平

盡管∆Ψm未受影響，但在暴露後30分鍾內，用250 μg/ml阿斯巴甜處理的細胞中產生了顯著升高的ATP水平，如圖4所示。蘋果酸-天冬氨酸穿梭過程包括穀氨酸-天冬氨酸載體和2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)載體將蘋果酸交換為2-氧戊二酸。梭子的作用是將胞質NADH運輸到線粒體基質。NADH用於呼吸作用，呼吸作用產生ATP, NADH的胞質水平調節(由於胞質中天冬氨酸水平的增加而增加)有助於細胞中ATP水平的升高。在β細胞[16]中葡萄糖刺激的胰島素分泌過程中，發現胞質NADH水平受穀氨酸-天冬氨酸載體的調節。因此，我們檢測了阿斯巴甜處理細胞中的NAD+/NADH比值。

細胞內NAD+/NADH比值的測定

NAD是一種二核苷酸，由一個核苷酸含有腺苷環，另一個核苷酸含有煙酰胺組成。在細胞代謝途徑中，NAD參與氧化還原反應，將電子從一個反應帶到另一個反應。作為NAD，它作為氧化劑在那裏接收電子並形成NADH, NADH反過來又可以作為還原劑提供電子。河畔⁺/ NADH濃度測定的未處理和處理的細胞0.2 mM AOA作為實驗的對照。AOA是一種已知的蘋果酸天冬氨酸穿梭酶抑製劑，由於穿梭酶活性在AOA處理的細胞中受到抑製，NAD會減少⁺/ NADH比率。如圖5所示，NAD沒有差異⁺在添加或不添加阿斯巴甜30分鍾後觀察細胞的/NADH比值。

阿斯巴甜對蘋果酸天冬氨酸穿梭體(MAS)活性的影響

使用0.2 mM氨基乙酸(AOA)處理的線粒體的蘋果酸天冬氨酸穿梭酶活性有望顯著降低，因為它是一種已知的穿梭酶抑製劑。盡管圖6顯示，AOA+250 μg/mL阿斯巴甜和AOA+50 μg/mL阿斯巴甜處理的線粒體活性下降，但並不顯著。此外，250 μg/mL和50 μg/mL阿斯巴甜處理的線粒體活性差異不顯著。這很可能是由於在特定的處理中，三個副本間MAS活性的比率不同。然而，盡管阿斯巴甜的存在，總體的MAS保持不變。這可能是由於缺乏完整的細胞係統，由細胞的胞質部分和線粒體部分組成，在分離的腎髒線粒體中測量MAS活性時，它們協同工作。

阿斯巴甜對細胞氧化應激的影響

ddf - hda試驗數據如圖7所示，在不同濃度的阿斯巴甜環境下，氧化應激評估30分鍾。該實驗背後的理論是，非熒光熒光素在被活性氧氧化時會發出熒光，因此，當應用於完整的細胞時，DCFH- da穿過細胞膜，被酯酶水解為DCFH，然後被活性氧氧化為DCF(二氯熒光素)，具有高熒光[12]。暴露於250 μg/ml阿斯巴甜30min後，MDCK細胞氧化應激明顯高於對照組。然而，較低濃度的阿斯巴甜沒有表現出這種壓力。

MitoSO™紅色指示劑是二氫乙硫胺的衍生物，二氫乙硫胺是一種探針，可被吸入主動呼吸的線粒體。MitoSOX™紅色指示物(或HE)被超氧化物氧化導致2位羥基化。2-羥乙烯(以及MitoSOX™Red指示劑的對應衍生物)在約400 nm處有一個熒光激發峰，這在除超氧化物外的ROS產生的乙烯氧化產物的激發光譜中是沒有的。因此，400 nm處的熒光激發和約590 nm處的發射檢測提供了超氧化物與其他ROS的最佳區分。圖8中的圖表顯示，與對照組(153 RFU)相比，250 μg/mL阿斯巴甜處理30分鍾(170 RFU)的細胞超氧化物產量顯著增加。這表明，與正常MDCK細胞相比，250 μg/mL阿斯巴甜處理的細胞線粒體中超氧化物的產生增加。

討論

在過去的幾年裏，人類的飲食中越來越多地接觸到人工甜味劑，因為它被認為是想要減少糖攝入量的消費者的更健康的選擇。

阿斯巴甜是最常用的人工甜味劑之一。1981年，美國食品和藥物管理局批準了它的上市，現在它被用作穀物、配料、糖霜、糖果、口香糖、幹製混合飲料和酸奶[15]的糖替代品。它是由兩種天然氨基酸天冬氨酸和苯丙氨酸合成而成，這使得它可以像蛋白質一樣在體內被消化，並且有4千卡/毫克的熱值，盡管它比蔗糖[15]甜180-200倍。盡管阿斯巴甜是有史以來測試最嚴格的食品成分[16]，但不同的研究報告關於阿斯巴甜攝入的健康問題，繼續對這種甜味劑的使用產生爭議。

動物模型研究表明，食用阿斯巴甜可導致葡萄糖不耐受和肥胖[17]、癌症[18,19]以及肝功能障礙[16]和腎毒性作用[20]。

在動物和細胞模型中，阿斯巴甜毒理學效應的實驗研究與氧化應激有關。長期接觸阿斯巴甜的大鼠大腦顯示出抗氧化狀態的改變，表明自由基生成[2]。MDCK細胞表現出明顯的細胞活力和細胞內與ROS相關的酶活性下降，即過氧化氫酶和超氧化物歧化酶[11]。這些細胞中的脂質過氧化水平顯著增加[11]。然而，這項研究測量了暴露在24到72小時後的這些影響。在我們的研究中，評估了阿斯巴甜暴露對MDCK細胞的急性作用，並闡明了阿斯巴甜毒性可能的生化機製。

在濃度為20 ~ 100 μg/ml的MDCK細胞中，短期(30分鍾)的阿斯巴甜暴露對細胞活力沒有影響，但在1h後，細胞顯示出更多的福馬甘產物，這是脫氫酶活性增加的代表(圖2)。細胞中的脫氫酶主要位於線粒體內。在圖3A中，暴露於阿斯巴甜30分鍾的MDCK細胞內線粒體的能量變化沒有明顯變化。對照組和高、低濃度阿斯巴甜處理的細胞中綠色單體與紅色團聚體的比例保持相似，說明阿斯巴甜處理的細胞線粒體膜電位(∆Ψm)與未處理的細胞相比沒有顯著變化。∆Ψm高度依賴於fof1 - atp酶，其活性維持穩態∆Ψm，除非膜發生解耦;即使在H2 - O2誘導的氧化應激[11]中也可以看到這種調節。因此，對∆Ψm的更改是意料之外的。盡管阿斯巴甜對∆Ψm沒有影響，但與未處理的對照組相比，阿斯巴甜處理的MDCK細胞在濃度為50 μg/ml及以上時，細胞內ATP產量顯著增加(圖4)。這可能是由於暴露1小時後，觀察到處理細胞中脫氫酶活性升高(圖1)。脫氫酶產生的NADH進入電子傳遞鏈，在細胞中產生ATP。線粒體膜上穿梭係統的參與，即蘋果酸-天冬氨酸穿梭(MAS)，將NADH運輸到線粒體。 Therefore, alongside measuring the NAD⁺在處理細胞/NADH比值中，測定離體小鼠腎線粒體中MAS活性。兩種NAD⁺阿斯巴甜處理未影響/ NADH比值和MAS活性(圖5和圖6)。然而，在測量MAS活性時缺乏整個細胞係統可能導致阿斯巴甜治療後無法看到活性升高。

圖3:用JC-1流式細胞儀在570 nm/530 nm處測定MDCK細胞在阿斯巴甜作用下的吸光度值之比。
MDCK細胞用JC-1染料和各自的處理處理。用流式細胞術測量每種處理細胞的吸光度值。繪製570 nm/530 nm吸光度值的比值，以確定三種不同類型細胞處理的線粒體膜電位的差異。如果n=3時p值<0.05，則認為值顯著。

圖3 b:阿斯巴甜處理MDCK細胞的熒光顯微鏡圖像。
用EVOS熒光顯微鏡(Life Technologies)在6個孔板上對阿斯巴甜處理的MDCK細胞進行成像。使用RFP和GFP兩種濾鏡拍攝圖像。

圖4:阿斯巴甜處理的MDCK細胞內ATP的產生。
用Sigma FL-ASC生物發光體細胞檢測試劑盒(Sigma- aldrich)測定經不同濃度阿斯巴甜處理1 h的MDCK細胞的細胞內ATP。如果n=3時*p值<0.05，則認為值顯著。

圖5:河畔⁺阿斯巴甜處理MDCK細胞的/NADH比值。
用50和250 μg/mL的阿斯巴甜處理以阿斯巴甜棒為指示的細胞30分鍾。經AOA棒指示的細胞用0.2 mM AOA處理10分鍾。對照組細胞不處理。使用NAD/NADH檢測試劑盒(比色法)(Abcam)測定細胞內NAD/NADH比值。如果n=3時p值<0.05，則認為值顯著。

圖6:阿斯巴甜處理的小鼠腎髒線粒體中的蘋果酸天冬氨酸穿梭活性。
用250 μg/ mL的阿斯巴甜處理250 bar指示的線粒體。用50 μg/mL的阿斯巴甜處理50 bar指示的線粒體。以50-AOA和250-AOA標記的線粒體分別用指示濃度的阿斯巴甜和0.2 mM AOA處理。所有療程均為30分鍾。如果p值<0.05，則認為值顯著。

圖7:阿斯巴甜處理的MDCK細胞中活性氧的產生。
細胞與不同的處理孵育30分鍾。采用流式細胞術，用ddf - hda探針測定活性氧含量。熒光用綠色熒光的幾何平均值表示。如果n=3時*p值<0.05，則認為值顯著。

既往研究結果顯示，隨著阿斯巴甜[13]暴露時間的延長，細胞內ROS增加，而我們發現MDCK細胞暴露於濃度為250 μg/ml的阿斯巴甜30min內ROS增加。線粒體對氧化應激(即超氧化物的產生)的貢獻在圖8中得到了清楚的闡明，MDCK細胞暴露於250 μg/ml阿斯巴甜後，與未處理的對照組相比，在暴露30分鍾內線粒體超氧化物的產生顯著增加。這些結果中一個有趣的結論是可能與2-氧戊二酸脫氫酶有關。在Starkov AA等人[21]的一份報告中，從小鼠大腦中分離出的線粒體中，發現2-氧葡二酸脫氫酶是正常功能線粒體中ROS產生的主要部位[21,22]。我們推測，天冬氨酸水平升高導致2-氧戊二酸脫氫酶過度活躍是MDCK細胞ROS和超氧化物水平升高的主要原因。

圖8:阿斯巴甜處理MDCK細胞線粒體中超氧化物的產生。
細胞與不同的處理孵育30分鍾。用mitososored流式細胞術測定超氧化物的產生。細胞的熒光值在Ex/Em 510 nm/590 nm下測定。如果n=3時*p值<0.05，則認為值顯著。

此外，在一個在sillico2-氧戊二酸脫氫酶配合物與天冬氨酸轉氨酶和蘋果酸脫氫酶結合形成三元配合物，在蘋果酸和穀氨酸存在的情況下，可以增強蘋果酸氧化[23]。這種複合物可以通過維持TCA循環中間產物的濃度，減少酶間中間產物的轉運時間，有效地提高反應速率。此外，它還增強了TCA循環和MAS之間的相互作用，從而使胞漿中的代謝狀態轉化到線粒體中，反之亦然。

結論

總之，我們認為胞漿天冬氨酸水平的升高驅動MAS，導致ATP水平升高和2-氧戊二酸脫氫酶活性升高，從而導致腎細胞氧化應激水平在暴露後30分鍾內升高。在接觸阿斯巴甜1h後，MTT試驗顯示脫氫酶活性的升高。為了進一步證實這一點，需要使用放射性標記葡萄糖來評估整個細胞係統中MAS的活性，並測量其在AOA存在和不存在時的吸收(24)。

參考文獻

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Maria A, Maryam A, Shoba VA(2019)線粒體來源的氧化應激與阿斯巴甜對腎細胞的影響相關。國際內分泌代謝紊亂雜誌5(3):dx.doi.org/10.16966/2380-548X.161

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出版的曆史:

收到日期:2019年11月04

接受日期:2019年11月21日,

發表日期:2019年11月28日,