摘要

摘要目的:細針穿刺(FNA)是診斷甲狀腺結節的一種方法。當FNA顯示卵泡細胞時，不可能作出明確的診斷，因此手術幹預是必要的。確定不確定甲狀腺結節FNA樣本的基因表達模式有助於區分良性和惡性濾泡性甲狀腺病變。

方法:FNA上有濾泡細胞且病理診斷為濾泡性甲狀腺腺瘤(FTA)或癌(FTC)的患者均包括在內。在確定手術時收集甲狀腺組織。定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)和陣列譜儀包括84個參與轉化和腫瘤發生的基因。RT²Profiler PCR陣列數據分析軟件基於ΔΔCt計算確定折疊變化。基因表達歸一化為5個家務管理基因。

結果:19例患者術後病理:10例為FTA, 9例為FTC。FTC組中有11個基因相對於腺瘤組上調或下調大於2倍;caspase-8和IL-8兩個基因差異有統計學意義(p≤0.05)。利用子網絡富集分析(SNEA)算法，涉及轉化生長因子(TGF)家族和過氧化物酶體增殖物激活受體δ (PPARδ)家族的基因子網絡都被高度調控。

結論:我們的初步數據確定了兩個可能有助於區分FTC和FTA的潛在基因，並證明了FNA樣本的qRT-PCR的潛在作用。這可能有助於甲狀腺結節的檢查，最終指導不確定濾泡性病變的治療。

關鍵字

良好的針吸活組織檢查;濾泡性甲狀腺腺瘤;濾泡性甲狀腺癌;癌症基因分析;甲狀腺結節

縮寫:FNA):良好的針吸活組織檢查;FTC:濾泡性甲狀腺癌;FV-PTC:濾泡型甲狀腺乳頭狀癌FTA:甲狀腺濾泡腺瘤;GEC:基因表達分類器;RNA:核糖核酸;cDNA:互補脫氧核糖核酸;qRTPCR:定量逆轉錄聚合酶鏈反應;Ct:循環閾值;B2M:β2微球蛋白; HPRT1: Hypoxanthine Phosphoribosyl transferase 1; RPL13A: Ribosomal Protein L13A; GAPDH: Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase; ACTB: Actin, Beta is a protein coding gene; PCR: Polymerase Chain Reaction; SNEA: Sub-Network Enrichment Analysis;CASP8:半胱天冬酶8;IL8:白介素8;TGF:轉化生長因子;PPARδ:過氧化物酶體增殖物激活受體δ;TRAIL:腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體;TNF- α:腫瘤壞死因子α;TNFR:腫瘤壞死因子受體;CD40:分化簇40是抗原提呈細胞表麵的一種蛋白質，需要激活抗原提呈細胞;NF- κB:活化B細胞核因子kappa -光鏈增強子TGF- β:轉化生長因子β

簡介

大約5-10%的普通人群在一生中被診斷患有甲狀腺結節。大多數甲狀腺結節是良性的;然而，排除惡性腫瘤是必要的，因為這影響患者的治療和預後[1]。細針穿刺(FNA)仍然是甲狀腺結節評估的重要組成部分，並降低了良性結節患者的甲狀腺手術率。以往的經驗表明，高達86%的切除結節為良性[2]。fna指導下對結節進行評估的好處包括:程序簡單、經濟高效、鑒別良惡性疾病的總體可靠性[2-4]。基於FNA結果，臨床醫生對進一步的治療選擇做出知情的決定，包括觀察、重複FNA或手術幹預。雖然FNA是簡單和準確的，但在某些特殊情況下，良性和惡性細胞學的區分變得困難。

對於Bethesda II、V或VI類FNA結果，可以給出明確的建議。III和IV類病變占所有FNA活檢的30%，可能是也可能不是惡性[5]。一般指南主張手術切除這些病變，以確定包膜或血管侵犯，這與惡性腫瘤一致。在切除的病變中，隻有15 - 30%為惡性濾泡性甲狀腺癌(FTC)或濾泡性甲狀腺乳頭狀癌(FV-PTC)[2,6]。大多數病理表現為濾泡性甲狀腺腺瘤(FTA)或多結節性甲狀腺腫[2]中的濾泡細胞增生。因為大多數這些不確定的結節在術後病理上是良性的，如果有更精確的術前檢查，就可以避免手術。

Afirma (San Francisco, CA)[7]開發了一種新的基於fna的基因表達分類器(GEC)檢測方法。由於靈敏度高，該方法在分析一致性和臨床適用性方麵得到了令人鼓舞的結果驗證[5,8]。另一種基於fnabe的檢測方法是Asuragen (Austin, Tx)的miRInform，該方法尚未得到獨立驗證。這已經被研究過，具有高特異性，在不確定的甲狀腺病變[9]中可以排除惡性腫瘤。所有這些檢測都有望幫助對不確定病變進行分類，但尚未獲得廣泛的臨床應用，並可能從其他遺傳標記中受益。

通過檢查甲狀腺濾泡性病變及其FNA樣本，尋找與腫瘤發生有關的特定基因的差異表達，可以鑒定出更多的生物標誌物，從而區分惡性濾泡性病變和良性病變。本研究的目的是利用廣泛的先前發現的致癌相關基因來識別候選遺傳標記，從而可能區分FTA和FTC，從而使其在不確定甲狀腺結節的術前臨床設置中潛在的生物標記麵板中使用。

方法

樣品收集

該研究得到了我們機構審查委員會的批準，並在試驗前獲得了所有患者的同意。2009年10月至2011年6月，所有甲狀腺結節術前FNA顯示濾泡細胞的患者納入研究。根據目前的指南和患者與外科醫生之間的討論，建議患者由單一外科醫生進行手術幹預，形式為甲狀腺葉切除術、甲狀腺全切除術或肺葉切除術後甲狀腺全切除術。手術切除後立即發生體外取結節FNA，室溫下浸泡核糖核酸(RNA) 24小時，-80℃保存。所有手術標本的組織病理學診斷均由獨立的、經委員會認證的病理學家確認。如果術前FNA和術前FNA之間有差異體外FNA他們不包括在研究分析中。對術後手術標本進行分析，確定為濾泡性或Hürthle細胞腺瘤或濾泡性或Hürthle細胞癌。

RNA提取和反轉錄

用3毫克組織的Polytron均質法製備腫瘤組織進行RNA提取。使用RNeasy Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA)對腫瘤組織中的細胞材料進行RNA提取，並使用50 ng RNA與RT反轉錄合成互補的脫氧核糖核酸(cDNA)²前放大器cDNA合成試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)，根據製造商的協議。

實時定量PCR (qRT-PCR)

使用RT²Profiler PCR Cancer Pathway Finder陣列(SABiosciences, Valencia, CA)對樣本進行定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)。該陣列分析了涉及轉化和腫瘤發生的84個基因的表達。使用Realplex Mastercycler係統(Eppendorf, Hauppauge, NY)量化基因表達水平。采用以下熱循環條件:95°C 10分鍾，95°C 15秒/60°C 1分鍾40次放大循環，然後繪製熔體曲線。數據分析采用ΔΔCt方法(ΔΔC_T= 2^{-[(Ct惡性樣本-Ct惡性管家基因)- (Ct腺瘤樣本-Ct腺瘤管家基因)}疊化計算。基因表達歸一化為5個管家基因(B2M、HPRT1、RPL13A、GAPDH、ACTB)的平均表達量。聚合酶鏈式反應(PCR)陣列結果導入Ariadne Pathway Studio進行子網絡富集分析(SNEA)。SNEA利用所有數據點發現高度調控的基因表達子網絡。

統計分析

由於FTC的發生率較低，在研究期間我們的機構隻遇到了9個FTC樣本。在同一時期，收集了前10個FTA樣本並用於分析。所有的歸一化值和統計分析來產生p值t-測試使用Data Assist軟件v 3.01 (Life Technologies, Carlsbad, CA)確定。

結果

人口數據

共研究了19例患者，其中10例為FTA, 9例為FTC。女性患者占大多數(74%)，整個隊列的平均年齡為52.4±13歲。兩組間癌史、甲狀腺疾病家族史、甲狀腺功能減退或甲狀腺功能亢進病史相似。FNA診斷為癌的患者更有可能接受甲狀腺全切除術或肺葉切除術合並甲狀腺全切除術(p<0.0001)。患者人口統計數據列於表1。

基因表達

利用RT獲得基因表達²84個特定基因的PCR基因序列如表2所示。每個樣本中顯示表達的基因百分比根據周期閾值(Ct)被細分為四組:高表達(Ct<25)、中表達(Ct 25-30)、低表達(Ct 30-35)和未檢測到表達。Ct值與基因表達量成反比，也就是說，如果一個基因表達量高，它到達設定閾值所需的周期比低表達的基因要少。FTA樣本中，高表達17%，中表達42%，低表達29%，無檢測表達12%。FTC樣本表現出類似的分布，24%高表達，40%中表達，24%低表達，12%無表達(圖1)。

FTC組中有11個基因相對於FTA樣本有至少2倍的差異表達(上調或下調)(表3)。其中9個基因表達下調;然而，隻有caspase 8 (CASP8)和白介素8(IL8)FTC組基因表達明顯下調(p≤0.02)(圖2)。

利用所有84個基因和SNEA的結果，發現表達受轉化生長因子(TGF)家族成員和過氧化物酶體增殖物激活受體δ (PPARδ)控製的基因子網絡被高度調控(圖3)。CASP8被TGF家族下調，而IL8被PPARδ家族下調

討論

本研究的結果表明，從濾泡病變的FNA中獲得的有限組織是可以有效分析的。目前的研究分析了不確定的濾泡病變，利用基於fna的檢測和qRT-PCR分析，並確定了兩個可能有助於區分FTC和FTA的潛在候選基因:IL8而且CASP8．總的來說，與濾泡性甲狀腺腺瘤的FNA樣本相比，這兩個基因在濾泡性甲狀腺癌的FNA樣本中的表達水平顯著降低。

FTA:濾泡性甲狀腺腺瘤;FTC，濾泡性甲狀腺癌

表1:比較FTA和FTC病變的FNA樣本的患者人口統計數據

表2:RT2 Profiler PCR Cancer Pathway Finder Array中包含的基因及其功能

圖1:顯示表達基因的百分比，並將濾泡腺瘤的Ct範圍與濾泡癌的Ct範圍進行比較。FTA和FTC之間的分布情況類似。

表3:至少2倍變化的內參基因及其各自的p值。隻有Caspase 8和IL-8達到統計學意義。

圖2:FTA與FTC樣品中IL-8和caspase -8表達差異的倍數變化。表達值分別以IL-8和caspase -8最低表達水平的相對倍數差異表示，歸一化為內參基因的平均值。與濾泡腺瘤相比，濾泡癌中IL-8平均下降3.37倍，而caspase -8在濾泡腺瘤中平均下降4.15倍。

的重要性CASP8而且IL8在甲狀腺疾病中，可能是由於它們參與血管生成、細胞凋亡、炎症和細胞衰老，這可以解釋它們在幫助區分惡性和良性病變中的作用。在腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)啟動的機製中，procaspase-8被裂解成其活性形式caspase-8，然後促進凋亡[10]。據觀察，這種trail啟動的級聯特別靶向癌細胞[11]。Lee等人[12]證實了trail誘導CASP8惡性纖維組織細胞瘤中介導的細胞毒性。與這些發現類似，caspase8的減少可能會降低細胞破壞水平，並可能導致腫瘤的發生，這一發現與在癌樣本中觀察到的表達一致。

同樣的,IL8在胰腺癌和結腸癌中，由於其與慢性炎症和隨後向腫瘤細胞轉化的關係，已被證實與致癌有關[13,14]。然而，原因尚不清楚IL8考慮到它的促炎作用，它在癌樣本中的表達會減少。一種可能的解釋IL8本研究的水平是基於腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和TRAIL[15]之間已建立的同源性。在宮頸癌細胞中，TNF-α和腫瘤壞死因子受體(TNFR)相關因子通過CD40和NF-κ b通路上調IL8水平，並在人腸上皮細胞係中證實了trail誘導的IL8表達[16,17]。如果TRAIL表達減少，IL8也可能因此而減少。

TRAIL和TNF-α之間的相關通路可能支持我們將TRAIL作為這些觀察的中心組成部分的基礎。TRAIL水平的下降可能為這兩種疾病提供了原因IL8而且CASP8減少。已知TRAIL可激活惡性細胞中的細胞死亡，而不影響正常細胞，並已被證明可啟動惡性前期細胞[10]的凋亡。當抑製細胞凋亡機製促進腫瘤發生時，人們可能期望炎症因子如IL8增強表達能力然而，調低了IL8可能是由於上遊組件的擾動。TRAIL缺陷與自身免疫和細胞周期調節紊亂有關[18,19]。因此，TRAIL表達的固有減少可能最終導致降低CASP8而且IL8這是我們在聯邦貿易委員會的樣本中觀察到的。最終，關於TRAIL途徑的明確結論需要直接測量濾泡性甲狀腺癌標本中的遺傳標記，這可能是未來研究的一個領域。

為了幫助解釋基因表達水平和疾病狀態，引入了基因集富集方法。開發SNEA是為了識別兩種情況(即腺瘤與癌)之間表達有顯著一致性變化的基因集。每個子網絡由一個中心實體組成，它調節下遊基因的表達。因此，如果下遊表達靶點偶然包含比預期更多的差異表達基因，中心實體很可能是差異表達譜[20]的激活調控因子之一。在我們的SNEA分析中，我們能夠展示兩個高度調控的基因子網絡:TGF基因家族的表達靶點和PPARδ的表達靶點。ppar是具有轉錄因子功能的核受體，PPARδ通過β-連環蛋白途徑具有抗炎和抗癌作用。轉化生長因子-β (TGF-β)已被發現抑製上皮細胞的功能和增殖;在腫瘤細胞中，由於信號通路的改變，這些功能減弱。這導致不受控製的增殖和刺激侵襲，轉移和血管生成。TGF-β在甲狀腺癌中的作用已被研究; however, studies remain inconclusive [21]. While TGF and PPARδ may not have been shown thus far to have a direct relationship to the development of follicular carcinoma, perhaps a mechanism in these gene families is associated due to the upregulation of bothIL8而且CASP8．這些結果為未來的研究指明了一個潛在的領域。

圖3:sna結果顯示FTC和FTA之間高度調控的表達子網絡。Caspase 8作為TGF家族的一部分被下調，IL-8作為PPARδ子網絡的一部分被下調。與FTA相比，FTC中紅色基因表達上調;藍色,表達下調。

本研究的局限性是樣本量小。其他幾個生物標記物接近統計學顯著性差異。如果獲得更大的能量，生物標誌物的相關途徑可以進一步支持我們的結果。

我們的初步數據表明，利用FNA樣本的qRT-PCR, FTC和FTA之間可能存在遺傳差異。中突出顯示兩個可能的候選標記CASP8而且IL8．此外，FTC中以TGF和PPARδ為中心的基因表達子網絡高度調控，這為未來的研究提供了前景。本試驗可作為術前診斷和治療不確定濾泡病變患者的診斷工具。

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文章類型:評論文章

引用:peples CE, Simon R, Nagar S, Chung HS, Ahmed S，等。(2015)利用癌症基因譜鑒別良性和惡性濾泡性甲狀腺病變。國際內分泌代謝紊亂雜誌(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2380-548X.105

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出版的曆史:

收到日期:2015年5月23日

接受日期:2015年6月09

發表日期:2015年6月15日