文摘

在這裏,我們演示了如何基於陣列的高通量label-free生物傳感器可以應用,高信息單克隆抗體的抗原決定基映射(mab)。高分辨率的抗原決定基mappingusing抗原變異使特定綁定的識別區域Abs。抗原決定基的使用映射可以加快馬伯治療和疫苗的發現並告知數量和多樣性的相互作用研究。具體來說,我們展示機會抗原決定基映射為目標提供了在區分細微的差別在馬伯高度相似。

關鍵字

單克隆抗體;抗原決定基映射;Label-free生物傳感器;高通量篩選

實際價值存在於描述如何進行抗原的抗體

治療馬伯現在FDA批準用於臨床適應症的大多數類重大疾病包括癌症、感染、自身免疫、心血管、肺、炎性疾病[1],市值超過500億美元占七個十大賣毒品的銷售(2、3)。極其競爭格局存在發展的新的治療馬伯盡可能多的目標要求複雜的方法來識別和開發目標功能抗原表位的候選人或優於競爭對手的分子(s) [1,4]。然而,傳統的檢查方法的選擇標準沒有考慮到知識的自由運作。因此,治療開發針對備受矚目的目標可以找到大量的挑戰在商業化階段。此外,許多目標的序列和結構變化也帶來了挑戰,確定一個領先候選人與廣泛的活動。特別是在腫瘤學高度變化的目標。一種可取的候選藥物不易攝動的修改功能相關的目標抗原決定基,可發生例如在不同的疾病或治療方案。同樣,開發有效的疫苗需要誘發免疫反應的能力,針對區域往往會展示hypervariability序列。了解免疫反應引起對病毒的特定方麵的目標是治療傳染病的發展的關鍵。這裏描述的增強抗原決定基映射技術提供的能力提高發現工作流的下一代療法。

治療篩選抗原決定基映射提供了許多優勢

比傳統affinity-based篩查表位的篩選是更有利的選擇治療馬伯候選人(5 - 8)。此外,當與功能分析相結合,基於表位的篩選確定候選人功能性抗原表位導致更少的死胡同候選人增加成功的概率在第二和第三階段試驗[9]。在組合,抗原決定基裝箱和抗原決定基映射使用label-free生物傳感器可以增加成功的概率,降低總體成本,提高研發效率[9]。競爭抗原決定基麵元是最適合作為初級階段篩查工具根據網站集群馬伯的抗原決定基參與。當進行使用labelfree若,如製成的表麵等離子體共振成像(撒),分析隻需要原油或純化馬伯抗原他們提出反對。雖然定義候選抗原決定基箱是一個重要的第一步選擇,它不直接定位抗原表位結構通常也不涉及對超過一種形式的抗原的篩選。

本地化抗原表位和理解對目標序列和結構變化的影響,抗原決定基映射是一個優秀的工具[10]。抗原決定基映射通過數組撒可以在兩種主要的方式進行(1)抗原肽的一個重疊的圖書館是排列在表麵和探測綁定馬伯注射或(2)目標變量/突變體注入在數組馬伯耦合表麵若[11]。圖書館,也稱為參考麵板的方法便於快速映射綁定的網站馬伯識別線性抗原表位;它通常不包含序列的高階結構,以便構象不映射綁定。根據目標,這些信息可能是足夠的定義構造空間關係的抗原決定基麵元社區。抗原決定基映射方法使用突變體/變種確實需要克隆,表達,純化中每個變量的問題,但結合構象上敏感的馬伯可以被監控。此外,突變體/變異方法有助於比較篩選方法對多個抗原亞型。在這兩種格式,數據收集的實時特性提供機會了解利率發生交互,提供進一步的相互作用的理解。在其他篩選方法,如ELISA、缺乏實時數據收集的問題,例如,當綁定是虛弱的。在這裏,我們提出一個抗原決定基映射方法,既能增強抗原的結構特征及其對馬伯的關係。 Epitope mapping was done using high-throughput SPRi with multiple mutant constructs of herpes simplex viral glycoprotein D(gD) and a panel of mAbs with broad epitopic coverage of gD. In a single experiment, this approach confirmed existing mapping data while detecting new binding profiles not previously identified. These results highlight the power of epitope mapping to quickly screenantigen:mAb interactions for a large panels of mAbs and generate a vast amount of information to drive vaccine and therapeutic drug development.

材料和方法

試劑

重組、突變HSV gD構造是由baculovirus-infected昆蟲(Sf9)細胞如前所述(12 - 15)。gD的細胞外部分,抗體反應有關從治療的角度來看,作為建立突變體的起點。總之,突變體是通過表達n和/或糖基截斷物種,小說中插入或刪除序列在野生型序列修改蛋白質結構,否則交換個人殘留識別那些馬伯綁定的關鍵。鼠單克隆馬伯提出對HSV gD 1型或2型得到從幾個來源和描述在以前的手稿,包括規範基於低分組作業通過突變,映射,和競爭研究(16、17)。

數組撒

數組的大約40 anti-HSV gDmAbs被耦合到一個生物傳感器表麵使用一個連續流Microspotter (CFM)。總之,共價附件馬伯的表麵是由第一次激活羧甲基化葡聚糖表麵的混合物1-Ethyl-3 - (3 - dimethylaminopropyl)碳化二亞胺(EDC)和n-hydroxysuccinimide (NHS)。馬伯準備在乙酸鈉pH值4.0被流動離散位置數組允許耦合通過胺組。剩餘使用乙醇胺活性酯被撲滅。調查區域的序列的關鍵馬伯綁定,gD突變體注入在馬伯數組和檢測使用一個宜必思MX96 SPR成像,負責監控質量的存在綁定到每個40馬伯實時位置在生物傳感器表麵。由於失活在耦合過程中,否則non-reactivity gD的亞型在這項研究中,使用一些馬伯產生約束力的信號分析(數據未顯示)。受體gD, Nectin-1和HVEM注射後綁定gD突變體的馬伯小組評估馬伯是否會幹擾受體結合。綁定組件被馬伯表麵注射的甘氨酸pH值2.0每個周期。

結果

本地化的網站gD受製於特定的馬伯調查使用gD的變體,圖1。這些馬伯的規範小組作業,根據先前的研究,是列在圖的頂部,連同馬伯的能力與受體競爭Nectin-1 HVEM綁定到細胞外gD。受體競爭在很大程度上遵循規範化小組作業,符合關於這些馬伯從結構綁定角度。

圖1所示。抗原決定基的映射馬伯gD的突變體。馬伯沒有先前的規範化作業被列為(Unk)。中斷Nectin-1 / HVEM綁定顯示為(+),mab不檢測受體阻斷不確定(ND)。紅細胞表明缺乏約束力的突變體,黃色細胞表明低水平的綁定,和綠色細胞表明高綁定響應。插圖顯示SPR傳感器克信號,作為響應單元(俄文)時間(秒)。

綁定響應對突變體由anti-gD馬伯表示熱圖,圖1。突變體的gD列出行和馬伯排列列。綠色細胞信號表示強烈的綁定,黃色細胞中間有約束力的信號,和紅細胞識別缺乏約束力。變體不僅本地化結合N - gD或c端區域,但也強調特定殘留綁定的關鍵。指的是規範集團Ia和組Ib馬伯,突變體Y38A (306 t)和V231W (306 t)可以用來區分這些子組。他們表明,盡管這些馬伯有許多共同的特征,導致其規範分組(如綁定盡管V231W突變),特定的殘基綁定可以用來區分的關鍵與抗原決定基映射方法(Y38A)如圖2所示。此外,這種方法的吞吐量能力確定馬伯Y38A出現同樣敏感突變和以前沒有被映射,如108年代和77年代。Sensorgram概要文件所示一個擴展視圖代表馬伯的集團Ia和組Ib強調綁定響應的差異觀察和強調這種撒方法提供的價值實時跟蹤綁定。Y38A突變破壞了幾乎所有綁定的Ib馬伯但不是Ia馬伯。受體競爭概要文件和表位映射配置文件符合gD的結構(見圖2和補充視頻)。

圖2。3 d的結構表示兩個mutationsof糖蛋白Dshown如圖1所示。晶體結構(pdb模型2 c36) gD。突變更詳細所示強調這種抗原決定基映射研究中確定的結構差異。

討論

高通量撒的麵板anti-gD馬伯的抗原決定基映射使用突變體證實先前的抗原決定基關係映射以及確定綁定地區幾個馬伯以前待定。同時與ELISA抗原決定基映射可以執行,實時label-free檢測信息豐富得多(圖1、2)。此外,基於數組的撒在每個注射也有優勢與ELISA的變體同時看到所有獨特的馬伯位置數組,降低整體抗原的要求。挑戰與變異抗原決定基映射來需要克隆,表達,淨化一個大型麵板的抗原變異。通常,丙氨酸掃描(即獵槍誘變)[18]是用來創建一個表位映射參考麵板個人殘留在哪裏更改為丙氨酸和綁定屬性評估(18 - 20)。這種方法的采用資源需求有限;然而,提高平台生成這些麵板的[11]和改進技術,包括基於陣列的大規模篩選撒,以前無法這個工作流可以生成信息的早期發現。機會提高建模的抗原和抗體的關係也存在使用抗原決定基映射方法。這些信息來自於這些類型的研究是適合通知蛋白質對接預測算法。此外,抗原決定基映射結合結構和綁定分析(生物物理預測軟件)可以提高誘變設計和布局。

結論

結果提出了手稿展示與構象表位映射突變體是一個多才多藝的和健壯的工具擴大篩查曲目在藥物發現和開發疫苗。與其他表位表征方法,如競爭裝箱和受體競爭,抗原/抗體的詳細影像可以開發的關係。這個工作流的主要推動者是使用實時若,這裏展示了使用基於數組的撒,,可以有效地積累數據多路複用的方式,提供一個完整的圖片結合的相互作用問題。總的來說,這些研究的數據可以使新發展預測建模,並最終提高藥物和疫苗開發。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:同上N T,凱恩斯TM,盧H, Closmore,艾森伯格RJ, et al。(2016)理解抗體:抗原的關係用抗原變異製成Spriepitope映射。J藥物Res Dev 2 (4): doi 1009.124 http://dx.doi.org/10.16966/2470

版權:©2016同上N T,等。這是一個開放的文章下分布式知識共享歸屬許可條款,允許無限製的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被認為提供了原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2016年11月08

接受日期:2016年12月15日

發表日期:2016年12月20日