摘要

甲氨蝶呤(MTX)是一種廣泛使用的生物製劑，用於治療嚴重和/或致殘性銀屑病，但口服治療會產生各種副作用。將甲氨蝶呤包裹在柔性脂質體中，通過皮膚給藥可以產生更好的治療作用並減少副作用。為了篩選脂質體配方開發過程中的各種因素，采用了Plackett Burman篩選設計。確定了3個配方變量和8個工藝變量，並使用一個因子圖來預測響應。本研究的目的是在各種因素中找出能夠在柔性脂質體的配方中獲得最高藥物包封率的重要因素。結果表明，應用篩選設計，如Plackett-Burman設計，可以有效地識別最顯著的因素。利用Design Expert v 6.0軟件進行中心複合設計，進一步優化確定的重要因素。從包封效率、粒徑、zeta電位和微觀分析等方麵對設計提出的三種最優方案進行了表征。結果表明，統計設計在甲氨蝶呤柔性脂質體的研製中是可行的。

簡介

牛皮癬是一種慢性皮膚病，影響著全世界0.1%至3%的人口。甲氨蝶呤(MTX)是治療銀屑病[1]中應用最廣泛的生物製劑。甲氨蝶呤已被用於治療嚴重和/或致殘性銀屑病，但口服治療會產生各種副作用。為了克服這些副作用，一種方法是局部施用甲氨蝶呤。外用藥物產品是一種以皮膚為靶點[3]，將藥物送入皮膚治療真皮疾病的產品。但是皮膚是局部藥物吸收的障礙。盡管局部治療中全身毒性的發生率遠低於全身給藥途徑，但局部治療可能無法提供臨床足夠的局部藥物濃度。這就需要新的藥物載體係統來治療皮膚病。增加藥物皮膚滲透的可能性之一是使用脂質體係統。在過去的幾十年裏，脂質體包裹的藥物通過皮膚傳遞經曆了密集的研究。 Classic or the traditional liposomes are of little value as carriers for transdermal drug delivery because they do not deeply penetrate the skin. Only specially designed vesicles have shown to be capable of allowing such enhancement [4]. Novel types of liposomes known as flexible liposomes have been designed with improved bilayer composition and preparation process to push liposomes more deeply into the skin. The basic rationale of such liposome design is that all carriers contain atleast one highly polar amphiphilic components such as sodium cholate, sodium deoxycholate or surfactants of pharmaceutical quality. The provisos have high membrane elasticity, permeability and vesicle stability confirming the flexible liposome mediated drug delivery into the skin [5].

為了支持和證明靈活的監管路徑在製造創新和批準後的變化，需要科學地理解相關的多因素關係和方法來評估這些知識在不同場景中的適用性。這是通過使用多元數學方法來實現的，例如實驗的統計設計(DOE)。在整個製藥過程中應用DOE是質量的關鍵，因為它最大限度地提高了少量實驗的信息量。製藥過程是受多種因素影響的複雜係統。DOE為這些係統確定最佳配方和工藝條件，並提供對潛在關係的理解。

在脂質體配方開發過程中，配方師會對確定哪個工藝或配方變量對反應影響最大感興趣。為了估計各因素的影響，可以使用各種篩選設計來幫助配方者選擇配方成分，從而優化一個或多個產品屬性。Plackett和Burman (PB)設計的正交陣列對於在盡可能小的設計中產生所有主要影響的無偏估計的篩選是有用的。在“n + 1”運行的PB設計中，可以篩選各種數量或“n”個因素。PB設計的投射特性是，它允許實驗者在初始設計的基礎上進行運行，從而有效地分離主效應和交互效應[6-9]。

由於PB設計是分辨率III設計，具有最少運行次數的屬性，但不允許估計因素之間的相互作用，因此隻能識別構成可能的重要相互作用的重要主要因素。此外，可以使用可旋轉中心複合Box-Wilson設計分析重要的主要因素。中心複合設計由一個由2的設計點組成的“立方體”部分組成^K階乘還是2^{k - 1}分數階乘設計，星點和中心點[10]。

因此，本研究旨在使用篩選設計(如Plackett Burman設計)確定重要因素，並使用中心複合材料優化配方。

材料與方法

甲氨蝶呤來自印度孟買的生化製藥公司。大豆磷脂酰膽堿、膽固醇、膽酸鈉取自印度孟買Himedia實驗室。丙二醇和甘油購買自SRS科學，班加羅爾，印度。卡波波爾p940是來自印度卡納塔克邦抗生素私人有限公司的禮物樣品。氯仿和甲醇從印度Qualigens獲得。全程使用雙蒸餾水(Millipore)。

脂質體的製備

簡單地說，脂質相由大豆磷脂酰膽堿(SPC)、膽固醇和溶解在CHCl中的表麵活性劑(膽酸鈉)組成_3.: MeOH (2:1 v/v)混合物在幹燥的圓底燒瓶中。有機溶劑通過真空蒸發器(Rotavapor-R, W.Büchi, Flawil Schweiz)在脂質轉變溫度以上除去，在燒瓶壁上獲得均勻、薄的脂質膜。沉積的脂膜用含甲氨蝶呤的磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)水化，在室溫下持續旋轉1小時60分鍾。將分散體置於超聲探針(超聲處理器，UP200S, Hielscher超聲技術)下，使用冷卻墊進行2 - 6分鍾，得到小的單層狀(SUV)脂質體。最後，製備的脂質體分散體在室溫下儲存2小時，以退火任何結構缺陷。

色譜測定

甲氨蝶呤濃度采用先前報道的方法進行了輕微修改，采用Shimadzu LV at - 10vp液相色譜法，在302 nm處，配備可變紫外檢測器和計算機集成設備[11]。色譜柱為Phenomenex Luna 5u C₁₈(2) 100 A, 250 x 4.60 mm。流動相為乙腈-檸檬酸磷酸鹽緩衝液(90:10)，pH為6，流速為1ml/min，室溫，保留時間(R.T.)為7.2±0.3 min。

Plackett-Burman篩選設計

從上述的薄膜水化過程中，很明顯，高效脂質體製備的設計是一個多變量過程，其中許多因素都可能影響所需的脂質體性能。配方師很難猜測這些因素對預期反應的影響。

研究了11個可能影響藥物夾持的變量。研究的配方變量為藥物/脂類、藥物/膽固醇和藥物/表麵活性劑。考察了蒸發溫度、蒸發速度、蒸發時間、水化時間、水化溫度、水化體積、水化速度和超聲時間。使用design expert V. 6.05軟件構建了一個Plackett-Burman (PB)設計，包括12個實驗，包括3個重複。使用這種設計，每個變量對結果響應的影響程度可以獨立於所有其他測試變量來估計。每個變量在低水平(-1)和高水平(+1)兩個水平下進行測試，測量的反應為藥物夾持率(PDE)。藥物/脂類比值在低、高水平分別為1:5 mg ~ 1:10 mg，藥物/膽固醇在低、高水平分別為1:2.5 mg ~ 1:0.5 mg，藥物/表麵活性劑在低、高水平分別為1:0.66 mg ~ 1:1.66 mg。其他工藝變量按低、高水平變化(表1)。根據PB實驗設計，采用薄膜水合法製備柔性脂質體。如前所述，確定了捕集效率。

表1:這11種檢測因素的低水平和高水平

中央複合箱威爾遜設計

使用軟件- Design Expert V. 6.0.5©Stat ease Inc.， U.S.A.生成一個隨機可旋轉CCD。根據模型，它包含四個全析因設計點，四個軸向點和三個中心點，在兩個層次上變化。設計包括從PBSD中鑒定出的兩個顯著性因子在高、低水平上的估計(表3)。每個因子的高、低水平分別編碼為+1和-1，均值為0。中心點的增加使我們能夠檢測到響應中的非線性，因此我們重複三次以得到實驗誤差或純誤差的估計。還包括軸向點，軸向點是被調查因素的水平，位於原始高或低因素範圍之外的距離[10,12]。CCD包含每個因子的五個層次:低軸向、低階乘、中心、高軸向和高階乘。測量的臨界反應變量是藥物夾持。模型的實際擬合采用統計軟件計算。運行順序隨機化，以確保不受時間相關變量的影響，並滿足觀察的獨立性的統計學要求。編碼後的CCD矩陣及結果如表4所示。

表2:來自Plackett Burman篩選設計的方差分析
* (P < 0.05)

表3:構成CCD的因素及其對應的層次

表4:中心複合設計與包封效率的編碼矩陣
*三次試驗的平均值
PDE:藥物包埋百分比和sd標準偏差

檢查點分析最優解

通過檢查點實驗驗證了所得到的三維圖和多項式方程在薄膜水合合成MTX脂質體中的應用。自變量(X₁和X₂)是從軟件建議的三個檢查點中提取的。通過取自變量(X₁和X₂)和平均PDE。將預測的PDE與觀測到的PDE進行比較(表5)，並從粒徑、多分散性指數、zeta電位、體外釋放度和顯微分析等方麵表征了最佳溶液。

表5::以膽酸鈉為表麵活性劑/邊緣活化劑的響應麵二次模型方差分析結果
* (P < 0.05)
# (p > 0.05)
自由度
F =個體分布之間距離的測量
概率“P”小於0.05表示模型項顯著

脂質體特征

將遊離藥物與包埋藥物分離後，測定包埋效率。將5 ml脂質體懸浮液進行超離心(Beckman L7超離心機，Beckmann Coulter GmbH) 50分鍾，轉速40000轉，溫度6℃。采用高效液相色譜法通過超離心後上清液遊離濃度間接測定甲氨蝶呤含量。

$ $ \ % EE \ = {{{rm \{量}}\,rm的{}}{\ \,rm{藥物}}{\ \,{\ rm{裹入}}}\ / {{\ rm總}{}\,{\ rm{量}}\,rm的{}}{\ \,{\ rm{藥物 }}\,}}\, \ 乘以100 $ $

在適當稀釋脂質體製劑後，使用Nanosizer (Nano-ZS, Nanoseries, Malvern Instruments, UK)分別用動態光散射(DLS)和激光多普勒電泳(LDE)測定顆粒大小(z -平均尺寸和多分散指數)和ζ -電位。每種情況都進行了六次獨立測量。得到了粒徑的質量分布、電泳遷移率及多分散性指數。尺寸報告為水動力直徑的z平均平均直徑(nm)以及多分散性指數。Zeta電位(mV)由電場中的電泳遷移率計算[13-17]。

在體外滲透研究

在體外研究采用Franz擴散細胞在35±2°C的人體屍體皮膚上進行。受體相(PBS pH值7.4)以100 rpm的速度用磁力攪拌器不斷攪拌。擴散細胞和受體細胞體積的有效滲透麵積為2.5 cm²和75毫升。變形脂質體MTX凝膠配方(分散在不同濃度的卡波凝膠基中)含有最終濃度為0.25% w/w的MTX用於在體外釋放研究[18,19]。將含MTX 2.5mg的脂質體MTX凝膠塗於屍體皮膚表麵。樣品按預定時間間隔在24小時內通過擴散池的采樣口提取，並在302 nm處使用高效液相色譜法進行分析。

初級皮膚刺激試驗

甲氨蝶呤脂質體凝膠的刺激性;在雄性Wistar大鼠(150-200克)中測定0.25% w/w MTX。試驗開始前24小時，動物被安置在一個空調房間(20°C)，背部毛發修剪短。這些動物被分成兩組，每組6隻。第一組大鼠服用優化後的脂質體配方，第二組大鼠服用已上市的脂質體配方。在每隻大鼠背部兩側各畫兩個正方形，每個正方形各取0.5克配方。使用尼龍網保護被處理動物，由具有小孔隙的塑料方塊支撐，保持在處理區域上方。暴露72小時後，取出測試物質，並根據Draize皮膚反應評估(獲得Al-Ameen藥學院倫理委員會的倫理許可，經CPCSEA批準)[20]對暴露皮膚的水腫(0-4級)和紅斑(0-4級)的形成進行評分。

結果與討論

可變形脂質體的製備與表征

為了增加牛皮癬治療的“治療階梯”，設計並配製了氨甲蝶呤(MTX)的超成形脂質體，並加入了生物相容性成分，如脂質、膽酸鈉和膽固醇。結果表明，脂質含量越高，膽酸鈉含量越低，藥物包埋率越高。可能的解釋是MTX作為極性分子被包裹在水核中，需要更多的脂質來形成脂質薄片。據報道，適當比例的膜軟劑(表麵活性劑)摻入在超成形脂質體[21]中起著重要作用。表麵活性劑量的增加導致聚集體解體，通常以兩酸鹽的形式出現，降低了藥物的包封效率。

本研究的目的是使用PBSD來確定這些變量，可以控製PBSD來配製具有最大藥物包封的柔性脂質體。

目標PDE固定在最大捕獲。在收集了12次運行的數據並計算出響應後，係統就可以進行分析，首先是回歸係數的計算。PBD基於Hadamard矩陣，結果用多元線性方程解釋¹²¹

Y = a₀+一個₁x₁+一個₂x₂+ ...........+一個₁₁x₁₁

y代表預測的反應x_{1 -}x₁₁表示設置(因子)，a_{1 -}一個₁₁它們各自的係數和a₀表示均值截距。

給出各因素之間數學關係的多元線性方程被發現是

藥物誘捕率= +29.55418

+ 0.81537 x藥物/脂類

+12.45967 x脂質/膽固醇

-17.78244 x脂質/表麵活性劑

-0.051368 x蒸發速度

-0.23826 x蒸發時間

+0.20323 x水化時間

-0.14067 x超聲時間

在估計各因素的回歸係數後，通過方差分析(ANOVA)確定影響因變量的顯著性因素。對顯示估計影響的結果的統計分析見(表2)。方差分析表示用於估計因素的主要影響的平方和(SS)， F-ratio (F)作為各自的均方效應(MS)和均方誤差的比值。“P”-概率值表示影響響應的重要因素^74年,75年．模型P值為0.0164 (P <0.05)，具有顯著性。(表2)中的“P”值表明各因素的主要影響具有統計學意義(P < 0.05)或邊際顯著性(P < 0.10)。帶星號的因子，即x₁:藥物/脂類，x₂:藥物/表麵活性劑，x₆:蒸發時間，x₇:水化時間對反應影響顯著(p < 0.05)。觀測值與擬合值(R²= 0.982)。

通過應用Plackett Burman篩選設計，我們可以識別影響PDE的顯著變量。這大大減少了在進一步研究中需要調查的因素數量(從11個因素減少到4個因素)。

為了優化配方變量和研究各主要效應之間的相互作用，采用響應麵法(具體為;隨機中心複合設計)。

通過改變兩個自變量製備了13批MTX的UDL，並根據PBSD選擇其水平(圖1)₁)和膽酸鈉(x₂)為自變量，測定13個批次(製備為三份)的PDE(因變量)，結果記錄於(表4)。

圖1:PDE的實際值與預測值與PBSD的相關性。

脂質體的藥物包埋率顯著增加，在29.1124±2.998 ~ 57.1795±1.549之間。在x的+1階₁(脂質)和-1水平的x₂(膽酸鈉)的PDE±為49.6095±2.015，而x₁(脂質)和+1水平的x₂(膽酸鈉)PDE±為29.1124±2.998。

二次模型的多項式方程給出了各因素之間的數學關係

Pde = 12.164

+ 0.9312 *脂質

- 3.1753*膽酸鈉

- 0.0034*(脂質)²

+ 0.0736 *(膽酸鈉)²

+ 0.000692 *脂質x膽酸鈉

忽略全模型中不顯著(P>0.05)項，建立簡化模型

Pde = 12.164

+ 0.9312 *脂質

- 3.1753*膽酸鈉

- 0.0034*(脂質)²

+ 0.0736 *(膽酸鈉)²

在估計各因素的回歸係數後，通過方差分析(ANOVA)確定影響因變量的顯著性因素。對顯示估計影響的結果的統計分析見(表5)。方差分析表示用於估計因素的主要影響的平方和(SS)， F比(F)作為各自的均方效應(MS)和均方誤差的比值。“P”-概率值表示影響響應的重要因素。方差分析表明，PDE最適合二次模型，而不是線性模型。模型f值為52.03，概率“P”值<0.0001，這意味著模型f值是由噪聲引起的概率隻有0.01%。預測的r平方為0.8426，與調整後的r平方為0.9551合理吻合，表明二次型模型擬合。擬合缺失良好，“P”值為0.0693，無顯著性。

數學模型表明，二次項x₁, x₂(x₁）²(x₂）²均顯著(p<0.05)影響PDE。因此脂質和膽酸鈉在MTX PDE中起重要作用。

x因素的綜合作用₁和x₂可以通過響應麵圖和攝動圖(圖2和圖3)進一步說明，這表明脂質濃度(x₁)，即脂質濃度的增加增加了MTX包封百分比，而膽酸鈉濃度的情況下觀察到負麵影響(x₂)即表麵活性劑濃度的增加使PDE降低。圖4表示實際響應值與預測值的比較。

圖2:顯示脂質影響的三維響應曲麵圖(x₁)和表麵活性劑(x₂)對含膽酸鈉的UDL的反應(藥物夾持百分比)

圖3:攝動圖顯示x的影響₁(脂質)和x₂(表麵活性劑)對含膽酸鈉的UDL的藥物包封率(PDE)的影響

圖4:含膽酸鈉的UDL的實際與預測值之間的相關性

回歸分析、方差分析和診斷圖顯示，+1水平的血脂和-1水平的膽酸鈉具有較高的PDE。可能的解釋是MTX作為極性分子被包裹在水核中，需要更多的脂質來形成脂質薄片。如前所述，適當比例的膜軟劑(表麵活性劑)摻入在超成形脂質體中起著重要作用。表麵活性劑量的增加導致聚集體解體，通常以兩酸鹽的形式出現，降低了藥物的包封效率。由於這些UDL的目的是局部應用，較高的表麵活性劑濃度也可能影響銀屑病皮膚。這些結果與已有文獻一致[3,5,6,8,21]。因此，為了獲得脂質和膽酸鈉的最佳設置，采用了可取性方法進行數值優化。對因變量(響應)進行了工藝優化，優化配方使脂質濃度最大化，膽酸鈉含量最小化，以獲得更高的PDE。以脂質和膽酸鈉濃度為範圍，PDE為目標50%為約束條件，得到3種數值優化溶液。為了驗證響應麵模型的可靠性，根據預測模型製備了響應麵模型，並對響應麵模型進行了PDE評價。 Results in table 6, showed a good relationship between the experiment and predicted values, which confirms the practicability and validity of the model.

表6:膽酸鈉作為表麵活性劑/邊緣激活劑的MTX超變形脂質體的約束條件及數值優化解(設計專家V. 6.05, Stat Ease, Inc.， USA)

最優解的表征

並通過檢查點實驗驗證了設計的實用性。利用薄膜水化進一步配製了軟件提出的三種最佳溶液，並對PDE進行了測試。觀察到的響應(PDE)與Design Expert軟件預測的響應相似，百分比偏差小於5%。

水動力半徑對應的z平均尺寸(nm)用Malvernizer確定。形成的囊泡均為單層狀，z均值< 120 nm。MTXSC1、MTX-SC2、MTX-SC3的z -平均尺寸(n =3)分別為112.4 nm、101.3 nm和97.00 nm。表征粒徑均勻程度的多分散性指數(PI)表明，MTX-SC1、MTX-SC2、MTX-SC3的粒徑分布呈單峰分布，PI(粒徑分布曲線寬度)分別為0.160、0.128、0.125。以膽酸鈉為表麵活性劑的MTX- sc1、MTX- sc2和MTX- sc3脂質體的zeta電位均值分別為-18.84 mV、-18.52 mV和-18.6 mV(表7)。

表7:MTX超成形脂質體的表征
*-三次試驗的平均值(n = 3);Pde±s.d;藥物誘捕率±標準偏差;PI:聚分散指數(n= 3)

空白脂質體和MTX脂質體配方通過50 nm聚碳酸酯膜片擠壓前後體積的比較，進行變形性試驗。無MTX時，空白SC - OS1、空白SC - OS2、空白SC - os3的擠出體積百分比分別為86.7%、87.9%和85.3%。含MTX的MTXSC1、MTX- sc2、MTX- sc3的擠出體積百分比分別為84.4%、86.5%和86.2%。鏡下可見脂質體為單層狀囊泡。與光散射尺寸測量一致，脂質體的尺寸在95-115 nm範圍內。

在體外藥物釋放

在體外滲透研究為我們提供了有關輸送係統行為的寶貴信息在活的有機體內．以生理緩衝液PBS (pH 7.4)作為Franz擴散細胞的受體液，研究超變形脂質體增強藥物轉運的潛力。為了研究藥物的滲透模式，在體外利用Franz擴散細胞對人體皮膚進行了滲透研究。脂質體MTX凝膠在不同濃度Carbopol下的滲透分布如圖5所示。所有凝膠配方的透皮通量值均在33.582 mcg/cm之間²降至50.746微克/厘米²MTX - LG4(1%卡波波爾凝膠基)對藥物有控製和持續釋放作用。

圖5:不同比例卡波酚對脂質體MTX凝膠的滲透特性

初級皮膚刺激試驗

脂質體MTX凝膠和普通MTX凝膠應用24小時和72小時後，根據聯邦有害物質法案(FHSA)推薦的Draize評分檢查測試部位的皮膚反應。試驗結束後計算試驗物品的主要刺激指數(P.I.I.)。各製劑的初級刺激指數為0.00;說明老鼠的皮膚沒有刺激。

在本試驗條件下，配方(脂質體MTX凝膠和普通MTX凝膠)不是主要的皮膚刺激物。主要刺激指數小於5.00，表明兩種配方均安全。

結論

篩選設計的應用，如所述的Plackett-Burman設計(PBD)，大大減少了脂質體製劑的數量，並提供了盡可能多的關於變量影響的信息。PBD有效地識別了最顯著的因素。脂質和表麵活性劑濃度對藥物包埋率影響顯著。從CCD出發，以多項式形式導出了最大偏微分方程的優化公式。優化工藝變量和應用統計設計可使PDE提高到57%。在控製藥物從局部應用配方輸送到皮膚的各種因素中，顆粒大小和脂質體表麵電荷影響藥物沉積到皮膚深層。

所有配方分布均勻，多分散性指數在0.3以下，說明穩定性，粒徑在120- 140 nm範圍內有助於提高滲透和增強在皮膚層的積累，這是治療銀屑病的最終要求。

此外，對所選配方的體內研究將證明這種給藥係統適合於局部應用抗銀屑病藥物的長期作用，其副作用小於常規配方[22]。

確認

我們要感謝印度醫學研究委員會(ICMR)提供高級研究獎學金。我們也感謝印度Al-Ameen藥學院的校長和管理層為開展這項工作提供的所有支持。我們非常感謝Bharati Vidyapeeth大學Poona藥學院校長對流變學研究的支持。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Vanaja K, Shobha Rani RH, Narendra C(2016)統計設計在甲氨蝶呤脂質載體配方中的應用。J藥品開發2(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-1009.113

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出版的曆史:

收到日期:1月12日

接受日期:2016年1月25日

發表日期:1月29日