摘要

本研究的目的是通過監測實驗兔的肝功能參數，評價半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸對保護肝細胞免受對乙酰氨基酚毒性作用的比較效果。在本研究設計中，動物被分為兩組;急性治療組和慢性治療組。每組被進一步分為五個亞組;對照組(組- i)、中毒組(組- ii)、半胱氨酸處理組(組- iii)、賴氨酸處理組(組- iv)、甘氨酸處理組(組- v)。本研究表明，半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸可顯著降低對乙酰氨基酚誘導的肝毒性家兔肝髒酶的升高。在急性和慢性毒性研究中，與甘氨酸處理的動物相比，半胱氨酸和賴氨酸處理組的肝髒指數顯著降低。因此，與甘氨酸相比，半胱氨酸和賴氨酸作為遊離的藥物清除劑具有更好的臨床應用價值。

關鍵字

撲熱息痛;肝毒性;半胱氨酸;賴氨酸;甘氨酸

簡介

肝是一個兼具分泌和排泄功能的器官。肝髒的大部分合成和代謝功能都是由肝細胞完成的。肝細胞在蛋白質、碳水化合物、脂肪、維生素和激素的代謝和儲存中起著重要作用。血漿蛋白也由肝實質細胞合成。肝髒既能合成膽固醇，又能清除膽固醇。非必需氨基酸，當需要時，也由肝髒合成[1,2]。

肝細胞內存在穀草轉氨酶(SGOT)、穀丙轉氨酶(SGPT)、堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)等肝酶。當肝細胞損傷或死亡時，這些酶在循環中被釋放。SGOT和SGPT的血漿半衰期分別為16-18小時和42-48小時，線粒體SGOT的半衰期為87小時。這些酶是肝損傷的標誌。膽紅素是由網狀內皮係統中血紅蛋白的酶分解而形成的。肝功能損害[3]時血漿膽紅素水平升高。

對乙酰氨基酚(n -乙酰基對氨基苯酚，4-羥基乙酰苯胺)，又稱對乙酰氨基酚，是常用的鎮痛解熱藥物。在治療劑量上，它是最安全有效的藥物。當意外服用大劑量藥物或企圖自殺時，這種毒性劑量的撲熱息痛會引起肝髒小葉中心壞死，引起肝衰竭，最終導致死亡[4,5]。氧化應激、硝基酪氨酸形成、炎症細胞因子和線粒體通透性轉變被認為與撲熱息痛誘導的肝毒性有關。撲熱息痛主要通過與葡萄糖醛酸和硫酸鹽結合代謝，但也有一個次要途徑是通過Cyp4502E1酶係統將撲熱息痛轉化為有毒代謝物n -乙酰-p -苯醌亞胺(NAPQI)。NAPQI通過穀胱甘肽(GSH)途徑通過形成穀胱甘肽綴合物來解毒。過量服用撲熱息痛會產生高濃度的NAPQI，導致穀胱甘肽儲備耗竭。因此，這種有毒代謝物與正常細胞蛋白的-SH基團反應形成撲熱息痛蛋白加合物，引起細胞死亡[6,7]。

氨基酸有許多保護作用，可以幫助身體對抗壓力狀況。它們大量存在於蛋白質豐富的飲食中，如家禽、雞蛋、小麥、西蘭花、大蒜、洋蔥、紅辣椒、大豆和堅果。n -乙酰半胱氨酸是穀胱甘肽的前體，用於預防對乙酰氨基酚誘導的肝毒性[8]。穀胱甘肽由三種氨基酸組成;甘氨酸，穀氨酸和半胱氨酸。l -半胱氨酸是一種非必需含硫氨基酸，可在人體內由蛋氨酸氨基酸合成。在蛋白質營養不良或穀胱甘肽肝耗損引起的氧化應激情況下，半胱氨酸恢複γ穀氨酰半胱氨酸連接酶[9]。半胱氨酸是穀胱甘肽(GSH)的前體，具有強大的抗氧化性能，並作為細胞外還原劑[10]。賴氨酸也是一種必需氨基酸，有助於重金屬螯合、蛋白酶的激活、激素和抗體的產生，從而增強免疫係統。甘氨酸是一種非必需氨基酸，在人體內可由肝髒由其他氨基酸合成。 Glycine provides defense to body against variety of conditions such as sepsis, hemorrhage and attack of endotoxins. Glycine also protects the liver, kidney, skeletal muscles and heart against reperfusion injury due to ischemia, cold conditions various toxic compounds and drugs [12].

本研究的主要目的是確定各種氨基酸對撲熱息痛誘導的肝毒性動物的療效。半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸在改善撲熱息痛引起的肝損傷方麵的相對有效性進行了評估，撲熱息痛是最常用的止痛和退熱藥物。

材料

化學物質

本實驗研究使用三種氨基酸，l -半胱氨酸(Daejung)、賴氨酸(Fluka Granite)和甘氨酸(Merck Pharmaceuticals)來檢查它們的肝保護作用，同時使用撲熱息痛來誘導肝毒性。所用溶劑均為分析級。蒸餾水是根據我們實驗室的蒸餾計劃獲得的。

實驗動物

從當地市場購買體重1 ~ 2公斤的白化兔。這些動物被養在拉合爾旁遮普省大學藥學院的動物房裏。在開始實驗之前，他們已經適應了一周的環境。兔子被喂了新鮮的綠色飼料和水隨意。

采血

兔子被放在一個木箱裏，兔子的耳朵被小心地剃掉。揉耳使耳緣靜脈突出。用鋒利的手術刀細切，離心管采血。采集的血液在冰水中保存10分鍾，並以4000轉/分鍾的速度離心15分鍾。最後用Eppendorf微量移液管采集血清並標記。

實驗設計

家兔主要分為兩組;急性治療組和慢性治療組。每組又分為5個亞組，每個亞組取6隻兔(n=6)進行實驗研究。治療前，對所有家兔進行物理生化檢測，隻選取健康家兔進行研究。

急性治療組(ATG組)

在每個治療亞組中，給予各自方案後6小時，抽取血液樣本，觀察肝功能試驗(LFT)參數，即SGPT、SGOT、ALP、LDH和總膽紅素(TB)的變化。

第一組(對照組):對照組給予蒸餾水灌胃管。

第二組(有毒組):以黃芩苷為懸浮劑，將3g/kg撲熱息痛粉溶於水製備撲熱息痛混懸液，經胃管灌胃給藥，誘發急性肝毒性。

III組(l -半胱氨酸處理組):在給予急性對乙酰氨基酚中毒劑量前10min腹腔注射l -半胱氨酸(600mg/kg)。

IV組(賴氨酸治療組):在給予急性對乙酰氨基酚中毒劑量前10分鍾腹腔注射l -賴氨酸(10mg/kg)。

V組(甘氨酸處理組):甘氨酸(800mg/kg)在給予急性毒性撲熱息痛劑量前10min經胃灌服。

慢性治療組

在本研究組中，每個亞組均按各自方案治療30天，然後抽取血樣，觀察肝功能試驗(LFT)參數(ALT、AST、ALP、LDH和總膽紅素)的變化。

第一組(對照組):該組給予安慰劑(水)經胃管口服，持續30天。

第二組(有毒組):將撲熱息痛粉75mg/kg/d溶於水，以黃芩苷為懸浮劑製備撲熱息痛混懸液，在肝功能試驗正常的家兔體內，經胃管灌胃給藥30天。

III組(l -半胱氨酸處理組):l -半胱氨酸(200mg/kg)在對乙酰氨基酚治療的家兔30天毒性試驗的最後一周腹腔注射。

IV組(賴氨酸治療組):l -賴氨酸(3mg/kg)在對乙酰氨基酚治療的家兔30天毒性試驗的最後一周腹腔注射。

V組(甘氨酸處理組):甘氨酸(266.6mg/kg)在對乙酰氨基酚30天毒性方案的最後一周通過胃管口服給藥。

統計分析

數據采用SPSS 21.0統計軟件進行分析。所有肝髒剖麵圖參數均記錄為均值的標準偏差。不同實驗組比較采用方差分析(ANOVA)，采用SPSS統計工具進行事後tukey檢驗^®版本21。統計值p≤0.05被認為是顯著的。

結果

對乙酰氨基酚，l -半胱氨酸，賴氨酸和甘氨酸對急性治療研究中肝髒輪廓的影響

在急性毒性研究中，觀察了撲熱息痛的毒性作用以及l -半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸三種氨基酸對SGOT、SGPT、ALP、LDH和總膽紅素水平的保護作用(表1，圖1A)。應用統計學工具比較中毒組(組II)與對照組(組1)，發現中毒組SGOT(84%↑)、SGPT(70%↑)、ALP(22%↑)、LDH(80%↑)、總膽紅素(57%↑)水平均顯著升高(p<0.05)。半胱氨酸處理組(III組)與毒理組(II組)比較，血漿SGOT(60%↓)、SGPT(41%↓)、ALP(63%↓)、LDH(73%↓)和總膽紅素(59%↓)水平均顯著降低(p<0.05)。同樣賴氨酸治療組(第四組)明顯下降(p < 0.05)的等離子體水平的血清(30%↓)、血糖(↓61%),高山(↓49%),LDH(↓73%)、總膽紅素(↓57%)相比毒性組(組2),但甘氨酸治療組(V)沒有任何明顯變化(p > 0.05),血清(↓18%)水平顯著下降(p < 0.05),血糖水平(↓33%),高山(↓26%),LDH(↓66%)、總膽紅素(↓46%)。

對乙酰氨基酚，l -半胱氨酸，賴氨酸和甘氨酸對肝髒慢性毒性研究的影響

在慢性毒性研究中，觀察了撲熱息痛的毒性作用以及l -半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸三種氨基酸對SGOT、SGPT、ALP、LDH和總膽紅素水平的保護作用(表2，圖1B)。毒性對照組(組II)與對照組(組1)比較，SGOT(64%↑)、SGPT(103%↑)、ALP(15%↑)、LDH(23%↑)、總膽紅素(33%↑)水平均有統計學差異(p<0.05)。半胱氨酸處理組(III組)與對照組(II組)比較，血漿SGOT(25%↓)、SGPT(29%↓)、ALP(19%↓)、LDH(28%↓)和總膽紅素(20%↓)顯著降低(p<0.05)。同樣賴氨酸治療組(第四組)明顯下降(p < 0.05)的等離子體水平的血清(21%↓)、血糖(↓25%),高山(↓12%)和非顯著改變LDH水平(23%↓)和總膽紅素(↓17%)比陽性對照組(組2)。甘氨酸治療組(V)沒有任何明顯變化(p > 0.05),血清(↓18%)水平,LDH(19%↓)和總膽紅素(↓16%)而顯著下降(p < 0.05),血糖水平(↓25%),高山(↓15%)。

表1:l-半胱氨酸，賴氨酸，甘氨酸對對乙酰氨基酚治療兔急性治療的影響
1.組I:對照組，組II:毒性組，組III:半胱氨酸處理組，組IV:賴氨酸處理組，組V:甘氨酸處理組
2.數值用平均值±SEM表示
3.*表示P<0.05
4.第一組與第二組比較。第二組與第三、四、五組比較

表2:l-半胱氨酸、賴氨酸、甘氨酸對撲熱息痛慢性毒性兔sgot水平的影響
1.組I:對照組，組II:毒性組，組III:半胱氨酸處理組，組IV:賴氨酸處理組，組V:甘氨酸處理組
2.數值用平均值±SEM表示
3.*表示P<0.05
4.第一組與第二組比較。第二組與第三、四、五組比較

圖1:半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸對對乙酰氨基酚誘導的急性肝毒性的比較影響

圖1 b:半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸對慢性對乙酰氨基酚肝毒性研究中肝髒參數的比較影響。

表3:急性和慢性研究中治療組的多重比較
1.組I:對照組，組II:毒性組，組III:半胱氨酸處理組，組IV:賴氨酸處理組，組V:甘氨酸處理組
*表示P<0.05

討論

藥物性肝損傷(Drug - induced liver injury, DILI)是藥物治療應用的主要限製因素。它是肝髒最常見的疾病。肝毒素有一個獨特的途徑，通過它們破壞肝細胞。個體因素在患者易發生藥物性肝損傷(DILI)中也起關鍵作用。通過毒物基因組學和蛋白質組學的進步了解這些因素，可以將損害降到最低。一些預防藥物性肝毒性的藥物已經投入市場。其中，氨基酸在防止細胞損傷方麵起著核心作用。本研究觀察了半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸對抗肝毒素的比較效果。

在表3中，對比研究表明，半胱氨酸和賴氨酸在降低SGOT水平方麵的作用取決於以下途徑，但甘氨酸在降低SGOT水平方麵的作用並不相同，但甘氨酸在肝髒炎症病理狀況中起著重要作用。半胱氨酸處理組(III組)急性和慢性毒性研究中SGPT、SGOT、ALP、LDH和膽紅素水平均顯著降低(P<0.05)。半胱氨酸是合成穀胱甘肽和PAPS(3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸鹽)所必需的。對乙酰氨基酚的硫酸化需要PAPS，而NAPQI的解毒需要穀胱甘肽。所以半胱氨酸通過將對乙酰氨基酚代謝轉向更安全的一側[15]來防止對乙酰氨基酚誘導的肝毒性。穀胱甘肽具有降低活性氧活性的抗氧化特性。半胱氨酸還通過增加穀氨酰半胱氨酸連接酶的水平使身體從氧化應激中恢複，這種酶是合成穀胱甘肽所必需的。賴氨酸處理組(iv組)SGOT和LDH水平同樣顯著降低，SGPT水平極顯著降低，ALP水平極顯著降低。L-N⁶-(1-亞氨基乙基)-賴氨酸(L-NIL)是賴氨酸的衍生物。也有研究表明，L-NIL作用於iNOS酶的活性位點並抑製其活性。L-NIL通過滅活NF-B來阻止iNOS mRNA的表達，NF-B調節iNOS mRNA的表達。L-NIL還通過減少肝髒中NO的產生來維持GSH水平，因為活性氮物種被GSH[16]清除。它還能恢複鼻竇的灌注。L-NIL還通過降低對乙酰氨基酚[17]的生物活化來預防肝損傷。

甘氨酸(V組)治療的結果略有不同，如表3和圖1所示。在急性和慢性研究中，隻有SGPT水平顯著降低。甘氨酸是穀胱甘肽的一部分，穀胱甘肽是穀氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的三肽，保護細胞免受自由基相關的氧化應激[18]。甘氨酸還能提高大鼠肝移植的存活率[19]。甘氨酸可防止肝毒性藥物[20]中毒引起的吞噬、肝細胞損傷、纖維化和細胞凋亡。甘氨酸還具有抗過氧化作用，通過恢複超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和穀胱甘肽過氧化物酶的活性，從而保護細胞免受NAPQI的氧化應激。甘氨酸還能維持肝髒[1]的脂質過氧化(LPO)水平。本研究也證實了甘氨酸在維持肝髒抗氧化活性方麵的作用。在撲熱息痛誘導的肝毒性中，庫普弗細胞被激活，導致細胞因子的釋放。甘氨酸門控氯通道位於庫佛細胞上。因此，由於甘氨酸通過超極化細胞膜使庫佛氏細胞失活，細胞因子的產生受到抑製。 So glycine possesses anti-inflammatory activity and improves hepatic pathologic conditions [21]. Glycine also increases portal blood flow, production of bile, the hepatic microcirculation which improves cytochrome P450 activity and significantly reduces the levels of ALT,AST during hepatocellular injury [22].

結論

由此推測，半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸可顯著降低對乙酰氨基酚誘導的肝毒性家兔肝髒酶的升高。在急性和慢性毒性研究中，與甘氨酸處理的動物相比，半胱氨酸和賴氨酸處理組的肝酶顯著降低。

利益衝突

聲明不存在利益衝突。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:胡曉明，王曉明，王曉明，等。(2016)半胱氨酸、賴氨酸和甘氨酸對對乙酰氨基酚誘導的肝損傷的影響。J藥品開發2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-1009.112

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出版的曆史:

收到日期:12月7日

接受日期:2016年1月18日

發表日期:1月21日