摘要

作品簡介:Oct4基因是參與幹細胞自我更新控製的重要基因之一。近年來，該基因被認為是一種新的癌症分子標記。因此，在本研究中，我們檢測了Oct4基因在MIA Paca-2、PA-TU-8902和AsPC-1細胞係以及胰腺癌中的表達。

方法:在本實驗研究中，MIA Paca-2、PA-TU-8902和AsPC-1細胞係分別在DMEM [1] (GibcoDulbecco 's Modified Eagle Medium是一種廣泛使用的支持多種不同哺乳動物細胞生長的基礎培養基)和RPMI [2] - 1640 (RPMI又稱RPMI 1640或Roswell Park Memorial Institute Medium，最早由Moore於1967年描述，用於成功培養和擴展人類淋巴樣細胞)培養液中培養，培養液中含有10%胎牛血清(FBS)，溫度為37℃。含5% CO的培養箱₂和90%的水分。胰腺腫瘤和非腫瘤標本購自伊朗腫瘤銀行。然後進行RNA提取和cDNA合成。采用Real-time PCR檢測Oct4表達水平。用流式細胞術和免疫細胞化學方法檢測靶基因在細胞係中的蛋白表達水平。

結果:腫瘤細胞係中Oct4的表達水平高於對照組(正常組織)。用流式細胞術和免疫細胞化學檢測靶細胞中靶基因的蛋白表達水平。

結論/影響:Oct4可以被認為是胰腺癌細胞中癌症的分子標記物。這個基因可能在癌細胞不受控製的增殖中起著重要作用。

簡介

胰導管腺癌(PDAC)是最致命的實體癌，目前是美國癌症死亡的第四大常見原因。由於PDAC在癌症早期沒有症狀，診斷時廣泛轉移，對化療和放療有高耐藥性，因此診斷較晚。盡管過去幾十年對胰腺癌的研究不斷擴大，但這一領域的治療進展甚微。

事實上，盡管大多數癌症呈下降趨勢，但pdac的發病率和死亡率繼續上升，預計到2030年，胰腺癌將成為西方社會癌症死亡的第二大最常見原因。據報道，全世界胰腺癌(其中85%為腺癌)的發病率在每10萬人中1至10人之間，男性比女性更普遍[5]。這種癌症很少在40歲以下的人群中被診斷出來，平均診斷年齡為71歲。這種疾病是男性癌症死亡的第八大原因，是女性癌症死亡的第九大原因[6]。

在伊朗，這種癌症的患病率低於歐洲和美國。大多數人在確診時已發生轉移，因此手術或化療幹預對這些患者的效果最差。胰腺癌臨床治療挑戰的潛在障礙之一是對PDAC進展的分子機製的認識有限。事實上，表觀遺傳途徑缺陷的發生是涉及這類癌症發展的關鍵機製之一。研究表明，在胰腺癌中，像許多癌症一樣，細胞周期調節基因的表觀遺傳學調控、DNA修複、細胞連接和細胞信號通路的缺陷導致腫瘤的發展、進展和藥物治療[7]的耐藥性。

胰腺癌早期的表觀遺傳障礙克服了遺傳障礙。一般來說，癌症被認為是由多種基因突變的積累引起的，但越來越多的證據表明，癌細胞在癌症形成、維持和發展過程中也會發生表觀遺傳異常[8]。

換句話說，組織腫瘤包含不同種類的細胞群，這些細胞在生物學上是不同的，它們具有自我再生的潛力。

根據克隆進化模型，癌症腫瘤細胞是由細胞內基因變化的積累和已有克隆的逐漸選擇造成的。大多數摧毀癌細胞的傳統療法都是基於這一理論。

這些方法的局限性，包括晚期癌症患者預後差，表明腫瘤細胞中含有一群負責啟動腫瘤生長和擴張的細胞，以及轉移和複發的能力。這些細胞被命名為癌症幹細胞(CSCs)，因為這些癌細胞和基本幹細胞在增殖方麵有相似之處。該模型估計了CSCs的以下特征:

1) Self-rehabilitation;

2)異質性，如多維分化潛能;

3)抗凋亡。

這些特征似乎導致了傳統療法的效果降低，而傳統療法對分化或未分化的腫瘤細胞的作用更大。未分化的幹細胞群隻占腫瘤塊的一小部分。CSC理論估計，這些細胞是由祖幹細胞演化而來的，祖幹細胞有一定程度的分化，它們具有有限的增殖潛力[11]。

最近的研究表明，胚胎幹細胞的特異性轉錄因子如Oct4和Nanog在CSC功能的穩定中起著非常重要的作用，是抑製這些細胞增殖和產生抑製癌細胞生長的藥物的重要靶點[12,13]。

事實上，Oct4蛋白是由Pou5f1基因編碼的轉錄因子，而Pou5f1基因是位於人類基因組6號染色體上的DNAbinding蛋白家族中的一個基因。Oct4的表達與幹細胞的多能性有關，是控製哺乳動物胚胎發生早期階段[14]的重要因子。

在一定程度上，該因子對維持胚胎幹細胞的自我更新特性至關重要，其表達的任何增加或減少都將改變細胞的命運。所以它參與了癌症形成的過程。到目前為止，尚未有Oct4在分化細胞[15]中表達的報道。

最近的許多研究表明Oct4基因在膀胱癌、乳腺癌和骨肉瘤中的蛋白水平表達。除此之外;Tai等人證實了Oct4在幾種癌症細胞係中存在，包括肝癌、腎癌、胃癌、宮頸癌和骨癌。然而，該基因在正常細胞中不表達，這使其成為一種非常適合作為癌細胞分子標記的候選基因[16,17]。

因此，在本研究中，我們比較了胰腺癌細胞與正常胰腺細胞中Oct4的表達情況。

本研究的主要目的是證明Oct4是一種特異性的腫瘤啟動子，在廣泛的腫瘤中表達，特別是在本研究中胰腺癌中表達，但在正常組織中不表達。本研究首次將Oct4基因啟動子作為腫瘤特異性啟動子在MIA Paca-2、PATU-8902和AsPC-1細胞係中的表達與健康胰腺組織細胞進行比較。

材料與方法

PDAC和非癌症胰腺腫瘤(NCPT)標本，AsPC-1, MIA Paca-2和PA-TU-8902細胞係購自伊朗德黑蘭巴斯德研究所。在形態學檢查和保證細胞健康後，每個培養瓶105個細胞經過幾代後在培養瓶中培養，並分析基因表達模式。

樣品直接置於無菌和無rnase微管中作為活檢組織，用美國MGM氮罐轉移到實驗室，-80°C保存，直到RNA提取。培養達到70%密度後，將細胞係從培養基中分離(胰蛋白酶化)，用PBS緩衝液洗滌兩次，分離出細胞總RNA。PDAC、NCPT標本、MIA Paca-2和PA-TU-8902細胞係的培養基為高糖DMEM。AsPC-1細胞係的特異性培養基為RPMI 1640+10%胎牛血清。培養基中添加1%青黴素/鏈黴素，細胞在37°C和5% CO中培養₂濕度90%。細胞加倍時間為25-40小時。每個活檢標本在病理學家的監督下被分為癌組織和健康組織，並分別進行RNA純化。在保證電泳提取的RNA質量和分光光度計光吸收後，所有mRNA分子轉化為cDNA，在Oligo (dT) 12-18 Primer的幫助下轉移到-20°C的冰箱中。

用Primer設計軟件對Oct4基因的正向引物和反向引物進行序列設計，然後在NCBI [18] (National Center for Biotechnology Information)上對BLAST [18] (Basic Local Alignment Search Tool)進行序列設計，以確保其準確性(表1)。

目標基因	設計的低聚糖	底漆的訂單	長度
OCT4	F	CGCAAGCCCTCATTTCAC	111
	R	CATCACCTCCACCACCTG

表1:Oligo (dT) 12-18引物

為了擴增所需基因，首先製備引物，然後利用實時PCR擴增目標基因的mRNA (cDNA)。在每個PCR中加入4微升專有的正向和反向引物，3微升cDNA, 10微升MastermixSyber green和3微升脫氧核糖核酸酶遊離水(最終體積為20微升)，然後用一種特殊的粘合劑覆蓋板以防止蒸發。按照推薦程序將平板置於Real-Time PCR儀中(95°C, 30秒，一次循環，45次循環，條件為;95°C 10秒，52- 58°C 15秒，72°C 20秒)。所有上述測試至少重複3次。

調查結果及結果

本研究中使用的人體樣本包括6個胰腺組織活檢標本。AsPC-1細胞樣本來自一名62歲白人女性胰腺癌患者的標準實驗室試劑盒。MIA Paca-2細胞樣本來自一名65歲胰腺尾部和身體的胰腺癌患者的標準實驗室試劑盒。PATU-8902細胞樣本取自一名44歲胰腺癌女性患者的標準實驗室試劑盒。胰腺導管腺癌(PDAC)樣本來自一名55歲的男性，NCPT樣本來自一名50歲的波斯男性，正常胰腺組織來自一名45歲的波斯男性，均在伊朗德黑蘭腫瘤銀行購買。

采用RT - PCR方法檢測腫瘤細胞係活檢標本和胰腺活檢標本健康組織中Oct4基因的表達。研究基因中Oct4在MIA Paca2、PA-TU-8902、AsPC-1、PDAC和NCPT中的表達較對照組(正常胰腺組織)高8 ~ 9倍。

目的基因(Oct4)在PDAC、NCPT、MIA Paca-2、PA-TU-8902、aspc -1細胞係中與對照組(正常)比較的表達率見表2、圖1。

圖1:Oct4表達率。

細胞係樣本	AsPC-1 細胞	MIA - Paca細胞	pa - tu - 8902 細胞	正常胰腺細胞	PDAC	NCPT
目的基因:Oct4	9.2	8.5	8.3	1	9.6	8

表2:Oct4表達率。

通過對CSCs理論的認識和對CSCs與胚胎幹細胞行為相似性的分析，研究人員發現oct4基因是胚胎幹細胞的關鍵基因之一，是這些細胞多能性和自再生的主要因素，它也參與了癌症細胞[19]。

本研究對三種胰腺腫瘤來源細胞係(AsPC-1、MIA Paca-2和PATU-8902)、胰腺腫瘤組織周圍健康細胞、PDAC和NCPT中同時表達Oct4基因的情況進行了評估。結果證實，該基因的表達在胰腺癌細胞係中增加，但在癌組織旁的正常細胞中不增加。這一結果證實了大量癌症組織中的細胞有能力在不受控製的分裂下自我再生，從而形成癌症組織。

結論

本研究結果表明，胰腺癌細胞表達控製自我再生的主要基因，由於Oct4基因的表達已被證明是幹細胞基礎的標誌，因此可以認為這些細胞實際上是CSCs。

參考文獻

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Shahri SSZ, Sayyedalhosseini S(2020)基因Oct4作為一種新的腫瘤標記物在胰腺腫瘤和非腫瘤細胞係中的表達。J Diab Res Ther 6(2): dx.doi.org/10.16966/2380-5544.154

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出版的曆史:

收到日期:2020年11月06日

接受日期:2020年11月18日

發表日期:2020年11月24日