摘要

背景:T1D是一種自身免疫性疾病，與腸漏有關，可能是由於出生後第一年的喂養製度。IgG對膳食蛋白質的反應性間接評估了腸道通透性的破壞。本研究的目的是評估早期喂養製度與T1D患兒發病和進化兩年後抗相關飲食抗原(麥膠蛋白、牛酪蛋白和β-乳球蛋白)的血清總IgG應答的相關性，並確定針對這些蛋白質的特異性IgG亞類的相對分布。

方法:對47例T1D兒童和15例健康對照進行了病例對照研究。研究人員記錄了他們出生後第一年的進食情況，並在采訪時采集了血液樣本。采用單克隆抗體ELISA法測定IgG總指標及其亞類(IgG1-4)。

結果:與健康對照組相比，T1D兒童更早地攝入牛奶被觀察到。沒有發現早期飲食和當前存在的IgG抗體之間的聯係。然而，T1D患者對麥膠蛋白、酪蛋白和/或β-乳球蛋白的總IgG反應性增加。這些增加主要與IgG1、IgG2和IgG4亞類有關，正如在其他腸源性自身免疫性疾病如乳糜瀉中觀察到的那樣。在T1D中，麥膠蛋白作為抗原的潛力最大。

結論:在T1D兒童中發現的IgG反應模式有助於理解T1D中漏腸的影響以及與不耐受和自身免疫相關的異常免疫反應。

關鍵字

飲食抗原;免疫球蛋白子類;腸漏;墨西哥;1型糖尿病

簡介

1型糖尿病(T1D)是兒童最常見的自身免疫性疾病之一。這是由於β細胞的破壞，通常導致絕對胰島素缺乏。因此，它們的發病往往與一種或多種自身抗體相關的急性症狀有關，並與DQA和DQB基因[1]有關。除了遺傳易感性，環境因素的相互作用也很重要，如飲食、感染和抗生素的使用;特別是，早期的喂養製度可能會改變生命後期發生T1D的風險。使用含牛蛋白的嬰兒配方奶粉而不是母乳喂養，以及預期在嬰兒飲食中引入穀物，是與自身免疫過程密切相關的兩個因素[2]。

牛酪蛋白(嬰兒配方奶粉中的主要蛋白質)和β-乳球蛋白(最易致敏的牛乳蛋白之一)與患T1D的風險增加有關，無論是否存在胰島自身抗體。這是可能的，因為它們與葡萄糖轉運蛋白GLUT2[3]和視黃醇結合蛋白[4]的結構同源，兩者都存在於人類胰島細胞中。關於穀物，根據越來越多的證據表明T1D和乳糜瀉之間的共同危險因素，有人提出小麥麥膠蛋白在T1D中發揮作用。在4 - 7月齡之間有一個窗口期，建議在飲食中引入小麥。其早期或晚期合並與自身免疫和T1D[5]風險增加有關。

麥膠蛋白和酪蛋白都能改變腸上皮細胞的通透性，有利於細胞旁轉運[3]。目前，“漏腸”模型是研究最多的領域之一，它試圖解釋T1D的起源，並將其與其他因素聯係起來，如腸道菌群組成[6]的變化。然而，目前尚不清楚這種模式是所有T1D患者的普遍情況，還是根據疾病的階段進行修改。因此，評估對這些抗原的體液反應可能是評估腸通透性的間接措施，因為它們通過腸上皮。

本研究的目的是評估早期喂養製度與T1D患兒發病和進化兩年後抗相關飲食抗原(麥膠蛋白、牛酪蛋白和β-乳球蛋白)的血清總IgG應答的相關性，並確定針對這些蛋白質的特異性IgG亞類的相對分布。

方法

對來自索諾拉州兒童醫院(HIES)和一家兒科內分泌科私人診所的墨西哥兒科患者進行了病例對照研究。其中包括23例發病T1D兒童(進化≤2米)、24例長期T1D兒童(進化≥2年)和15例無T1D或過敏症狀、總IgE滴度陰性的健康兒童組成的對照組。T1D發病組的樣本平均年齡為9.8歲，≥2年進化的T1D患者為11.2歲，健康兒童為9.1歲。

該方案獲得了家長的知情同意，並得到了Investigaciónen Alimentación y Desarrollo中心倫理委員會和HIES學習和研究委員會的授權。在他們去內分泌科醫生的例行預約時，他們在與導師的半結構化訪談中收集了他們出生後第一年的進食習慣。然後，每名受試者抽取外周血3 mL，分離血清，4℃保存，待進一步分析。

采用直接酶聯免疫吸附法(ELISA)測定牛奶中醇溶蛋白、酪蛋白和β-乳球蛋白的總IgG指標(Sigma-Aldrich, USA)，方法參照本實驗室[7]。簡單地說，在碳酸氫鹽塗層緩衝液(35 mM NaHCO)中覆蓋100µL的5 ug/mL的麥膠蛋白、酪蛋白或β-乳球蛋白_3.， 15 mM Na₂有限公司_3.， 0.05%苯酚紅，pH 9.6)過夜。用洗滌液(0.1M Tris/HCl pH 7.4, 0.05%吐溫20,0.05%苯酚紅，15mm NaN)洗四次後_3.)，室溫下，用1%魚膠(Sigma-Aldrich)在洗滌緩衝液中孵育1 h。再進行4次洗滌，然後用1:50稀釋的患者血清在洗滌緩衝液中孵育2小時。之後進行四次洗滌，用HRP結合的抗人IgG抗體(Dako，丹麥)在1:200稀釋的洗滌緩衝液中檢測結合的總IgG。再洗滌三次後，用PBS進行第四次洗滌，用3,3´，5,5´-四甲基聯苯胺測定HRP活性。反應在1 M H時停止₂所以₄．在450 nm (Microplate Reader, Bio-Rad, Hercules, CA)下讀取印版。

考慮到平均值+2SD，使用健康兒童血清的吸收值(光密度)來確定每種被測蛋白質的截止值。IgG抗麥膠蛋白、抗酪蛋白和抗-β-乳球蛋白的血清反應性作為指標，用每個患者的血清吸光度值除以截斷值表示。指數≥1.0視為陽性。檢測總IgG陽性的血清，以確定IgG亞類對T1D中這些蛋白的反應模式。

為了評價IgG的亞類，采用ELISA法測定總IgG。如上所述，先前用麥膠蛋白、酪蛋白或β-乳球蛋白覆蓋和固定的培養皿與患者血清一起孵育過夜。之後，進行四次洗滌，分別用小鼠抗人IgG1-4單克隆抗體(Sigma-Aldrich, USA)在1:2000稀釋的洗滌緩衝液中檢測結合IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。四次洗滌後，用生物素化山羊抗小鼠IgG抗體(Southern Biotech, USA)在1:2000稀釋的洗滌緩衝液中孵育培養皿2小時。再進行四次洗滌，然後用1:2000 streptavidin-HRP洗滌緩衝液孵育1小時。最後，經過三次PBS洗滌，HRP反應發展類似於上述方法。所有測量都重複進行四種稀釋度，報告的效價與每個樣品的平均值相對應。

采用方差分析(ANOVA)和Tukey-Kramer檢驗(Tukey-Kramer test)評價各組飼喂方式的差異，ELISA結果采用非參數Kruskal-Wallis檢驗(NCSS-2007)。計算優勢比(95% CI)，以評估出生後1年的喂養方式與後期對麥膠蛋白、酪蛋白和β-乳球蛋白的總IgG免疫反應性之間的關係。P值小於0.05認為有統計學意義。

結果與討論

健康兒童和T1D兒童中母乳喂養的兒童比例相同。然而，如表1所示，T1D患兒組的母乳喂養平均持續時間較對照組低1.5個月。T1D患者攝入牛奶的時間明顯較早，平均為1.8個月，而健康兒童的平均為5.4個月。根據國際建議，對照組的所有健康兒童在4到7個月之間引入穀蛋白，但53%的T1D患者沒有。雖然兩組均值相似(p>0.05)，但T1D組的變變性更大，反映在更大的標準差上。

表1:健康兒童和T1D兒童在出生一年內的喂養製度。

每組的平均值顯示出來。樣本大小。SD:標準差。組間差異(p<0.05)以星號(*)表示。

一些研究表明，在嬰兒配方奶粉中引入牛奶蛋白的年齡與自身免疫和T1D[4]的發展之間存在關聯，這與我們的結果一致。最近，Lamb et al.[8]假設，通過喂養嬰兒配方奶粉，早期接觸牛乳蛋白會導致胰島素耐受性的喪失，並促進胰島素特異性T細胞的出現。然而，他們的研究結果顯示，當前牛奶攝入量比引入年齡的影響更大，主要是在HLA風險低/中等的兒童中。這是一個有趣的發現，因為我們的T1D樣本中隻有36%具有高風險基因型，而64%具有低/中度HLA相關風險[9]。

將估計的總IgG臨界值與T1D患者的結果進行比較，計算其指標，發現96%(45/47)患者的IgG抗麥膠蛋白反應陽性。此外，43%(20/47)和32%(15/47)的T1D患者抗酪蛋白IgG和抗β-乳球蛋白抗體陽性。在T1D發病組和長期進化組中，三種蛋白的IgG總陽性比例在統計學上相似。

在評估早期喂養方案與抗麥膠蛋白、酪蛋白或β-乳球蛋白的IgG反應性之間的關係時，未發現顯著相關性。因此，對於小麥引種年齡和IgG抗麥膠蛋白指數較高的小麥，其OR為1.63 (0.4 ~ 6.1,95% CI)。引入的牛奶也有類似的結果，對酪蛋白(2.82,95% CI 0.7-10.8)和ß-乳球蛋白(2.5,95% CI 0.4-12.3)有IgG反應性。

在出生後的頭幾個月接觸牛奶會導致針對牛奶蛋白的IgG亞類抗體滴度升高，至少在8歲之前是這樣。IgG亞型在不同時間達到成人水平。IgG1在5-7歲左右，IgG2在10歲左右，IgG3在7-9歲之間，而IgG4的水平在生命的頭兩年趨於上升，然後下降，直到13歲左右達到成人水平。這種在整個兒童期逐漸增加的模式反映了嬰兒早期飲食暴露的長期影響[11]。由於IgG4與黏膜有關，因此研究了它與自身免疫和T1D[11]的發展之間的關係。

在陽性IgG的情況下，評估這些IgG亞型對這些蛋白質的反應性，使我們能夠找到T1D的特定反應模式，檢測到與T1D進化時間相關的一些差異，如圖1所示。對於醇溶蛋白，發現IgG1、IgG2和IgG4的亞類具有顯著的反應性，其中IgG2與T1D進化時間有關。IgG3對酪蛋白的反應性在T1D發病時顯著升高，但在長期T1D組較低。此外，對於β-乳球蛋白，其與麥膠蛋白相似的特征是IgG1、IgG2和IgG4水平的升高。然而，由於其在95%的>患者中具有較高的免疫反應性，麥膠蛋白在T1D中表現出最高的潛在抗原。

圖1:與健康對照組相比，T1D患兒發病及病程≥2年時的麥膠蛋白、酪蛋白和β-乳球蛋白特異性IgG亞類抗體濃度(n=15)。中位數和25-75百分位範圍(方框)給出。組間差異(p<0.05)以星號(*)表示。

在T1D兒童中發現的抗麥膠蛋白和抗β-乳球蛋白免疫反應模式，以IgG1、IgG2和IgG4濃度的增加為特征，與在乳糜瀉青少年中發現的抗麥膠蛋白[12]的免疫反應模式相似。乳糜瀉是另一種自身免疫性疾病，與T1D具有相同的基因和腸道起源。這種反應不能完全歸為Th1(主要與IgG1和IgG2相關)，因為乳糜瀉和T1D患者都表現出更高濃度的IgG4亞類，表明是Th2反應，這是過敏過程的特征。在這方麵，IgG4和IgE的產生是並行調控的;Th2細胞中的白細胞介素-4可誘導B細胞中IgG4和IgE的轉換。這可能部分解釋了飲食如何調節免疫係統在生命早期的適當或不充分成熟。

總之，所有這些發現都支持這樣一個事實:由於他們的飲食和/或他們的特征性炎症過程，T1D患者的腸道通透性發生了改變。這導致了膳食蛋白質通過腸上皮細胞。因此，這不僅是一種細胞反應，也是一種體液反應。因此，兒童時期的炎症環境，特別是T1D前期和T1D前期，可能與免疫係統畸變有關，引發不耐受甚至自身免疫。

致謝

這項工作得到了墨西哥科學和技術委員會(CONACYT) S0008-2009-01-115212的資助。我們感謝Rene Valenzuela提供的技術支持。作者聲明沒有利益衝突。

參考文獻

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引用:Mejía-León ME, Calderón de la Barca AM(2016) 1型糖尿病兒童抗膳食抗原血清IgG亞類。J Dia Res Ther 2(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2380-5544.115

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收到日期:2016年1月08

接受日期:2016年1月20日

發表日期:2016年1月26日