糖尿病研究與治療科學

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研究文章
2型糖尿病相關基因單核苷酸多態性的驗證

愛麗絲JayaPradhaCheekurhty* 1C Rambabu2Amit Kumar3.

1印度安得拉邦古圖爾龍樹大學生物化學係研究學者
 2印度安得拉邦古圖爾龍樹大學教授
 3.生物軸DNA研究中心首席執行官，印度海得拉巴納戈爾邦拉古達

*通訊作者:Alice Jaya Pradha Cheekurhty，阿查裏亞龍樹大學生物化學係研究學者，印度安得拉邦Guntur龍樹那Nagar，電話:9581771118;電子郵件:alicejaya@gmail.com


摘要

本研究的目的是分析候選基因Calpain10和脂聯素等位基因變異在印度安得拉邦和特倫甘納邦離散糖尿病人群中對2型糖尿病的遺傳易感性中已證實的作用。

為了完成我們的目標，發現之前報道的snp的存在，我們不僅發現了報道的snp的一致性，還在Calpain 10基因中發現了新的單核苷酸多態性。

關鍵字

2型糖尿病(T2DM);calpain10 (CAPN 10);脂聯素(ADIPOQ);單核苷酸多態性;風險因素

簡介
2型糖尿病

2型糖尿病(T2DM)的發生和相關並發症的進展是由於幾種遺傳、環境和生化危險因素[1]的相互作用。糖尿病的患病率正以驚人的速度在全世界所有年齡組中增長，並對成年人產生顯著影響[2,3]。據國際糖尿病聯合會(International Diabetes Federation)觀察，在印度，居住在南部各州的人更容易患糖尿病，因為他們的生活方式具有“亞洲印度人表型”特征，這使他們更容易患糖尿病[4,5]。生化[6]和遺傳因子[7]與2型糖尿病的結局有關。

本研究是2型糖尿病及其相關並發症的遺傳和非遺傳危險因素的病例對照研究的一部分。研究了7個基因的snp和生化參數，以發現這兩個危險因素的個體效應和綜合效應。

之前報道的Calpain-10 [8-12] (CAPN10)和脂聯素[13-17]中的單核苷酸多態性(SNPs)是通過研究我們研究開始時的相關工作篩選出的。

CAPN10

半胱氨酸蛋白酶編碼的Calpain10基因[18]位於染色體2q37.3上，全長66 kb，外顯子15個。它的作用是調節多種細胞功能，可能負責脂肪細胞的分化。它在血糖調節中的作用是眾所周知的。這是第一個但不是最後一個通過定位克隆和全基因組篩選確定的2型糖尿病易感性候選基因[19]。CAPN10在不同種族人群中的作用在廣泛的人口研究中得到了檢驗，但結果不一[20-23]。這是由於種群間的遺傳異質性。一些證實了最初的發現，包括三個內含子CAPN10單核苷酸多態性的單倍型組合(UCSNP-43、19和-63)與T2DM風險的增加有關，但有些則沒有。

ADIPOQ(24、25)

脂聯素屬於脂肪因子家族。它是ADIPOQ基因的產物，位於染色體3q27上。它是人類血漿中最豐富的主要脂肪細胞分泌蛋白，在脂肪代謝和血糖調節中起重要作用。它包括肌肉和肝髒的胰島素敏感性，調節能量內穩態和葡萄糖耐量。低循環脂聯素水平與肥胖和糖尿病有關。

材料和方法
樣品收集

接受常規血液檢查的受試者的外周血樣本由診斷中心收集。他們要麼是自我激勵，要麼是醫生開的處方。每個受試者都進行了簡單的問卷調查，主要是為了有一個病例的曆史。樣本包括來自印度安得拉邦和特倫加納邦15-85歲之間的糖尿病患者和正常健康受試者。本研究的病例對象為糖尿病患者，其生化報告顯示空腹血糖(FBS)大於126 mg/dl或≥7.0 mmol/L，餐後血糖(PPBS)大於200 mg/dl或≥11.1mmol/L (WHO糖尿病診斷標準)。FBS和PPBS值低於上述值且無糖尿病家族史的健康受試者作為對照組。

根據研究方案，200名受試者采用坐姿采集EDTA和非EDTA小瓶的外周血樣本。20名患有其他傳染性疾病的受試者被排除在研究之外，而正在接受2型糖尿病治療的受試者被納入研究。最終共有180名受試者被納入研究，其中96名女性，84名男性。

選擇多態性

我們研究了CAPN10基因中rs2975760[26]和rs3792267[27]和ADIPOQ基因中rs3774261[28]的多態性，這些多態性被報道與T2DM的風險有關，並在我們的研究人群中進行了驗證。

方法

在剩下的180個血液樣本中，選出90個為糖尿病患者，90個為對照組。對不同生化參數的CBP和脂質譜進行分析，其中51個樣品按Sambrook等[29-31]的方法進行提取和純化。在使用裂解緩衝液和蛋白酶k進行裂解之前，通過在Tris洗滌緩衝液中洗滌將白細胞成分從其他細胞成分中分離出來。在裂解步驟中，所有受汙染的紅細胞和血清蛋白都被去除。這些溶解的蛋白質用醋酸鈉沉澱。利用聚合酶鏈式反應[31,32]從該分離純化的DNA中擴增與T2DM相關的特定SNP靶區的CAPN 10和ADIPOQ基因。PCR反應混合物由TaqDNA聚合酶、引物(正向和反向)、核苷酸和反應緩衝液組成。在底漆噴砂工具上進行底漆設計。優化了PCR的條件，以獲得高產量的特異性目標序列。PCR擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳[33]上定性檢測，溴化乙錠染色後在轉光器中可見。然後用Sanger測序方法[34]對這些擴增子進行測序。 The sequenced portions of the genes were checked for the consistency of reported mutations in our samples.

多態性分析

對這兩個基因擴增部分的測序顯示，在我們研究的部分糖尿病人群中存在snp。我們觀察到29例CAPN10基因中存在rs2975760和rs3792267 snp。20例T2DM患者存在rs2975760 SNP。20例T2DM患者出現C→T (Ala→Val)的核苷酸及相應氨基酸變化。另外20例rs3792267 (SNP)中出現G→C (Val→Ile)的變化。

在17例T2DM患者中發現SNP rs3774261的ADIPOQ基因的核苷酸變化和相應的氨基酸變化為A→G (Met→Ile)。13例T2DM患者的核苷酸及相應氨基酸發生A→G (Arg→Gly)的新位置變化。CAPN10基因snp在對照組中不存在。在7例T2DM病例中均存在這3個snp(表1)。

圖1:T2DM病例與對照組FBS水平的比較

圖2:T2DM病例與對照組PPBS水平的比較

表1:單核苷酸多態性的位置

圖1:CAPN10中新snp的盒子陰影

討論和結果
分析生物化學參數

該病例對照觀察研究顯示，與對照組相比，2型糖尿病患者空腹血糖值增加超過126 mg/dl，餐後血糖值增加超過200 mg/dl(世衛組織標準或糖尿病)。

血糖分布平均值FBS為152±92.8,92±11.7,p = 0.8; PPBS為229.3±67.6,131.2±18.8,p = 0.7。空腹血糖和餐後血糖的比較如下圖1和圖2所示。

相關研究表明，大多數空腹和餐後血糖水平升高的受試者都是SNP變異陽性的病例。本研究的一個發現是檢測離散糖尿病人群中報告的SNPs，我們可以在CAPN10[35]中發現新的位置的SNPs，在我們的一些研究人群中存在。SNP在糖尿病人群中的分布如下圖所示，圖1顯示了新型SNP在研究人群中的分布情況。

我們發現CAPN10、ADIPOQ基因型和代謝表型之間存在顯著相關性。calpain10和脂聯素中報道的SNPs與2型糖尿病的關聯可以在我們的離散研究人群中成功複製。攜帶這些基因變異的正常個體，如果血糖水平不受控製，超過世界衛生組織糖尿病診斷推薦標準的值，則可能麵臨更大的糖尿病風險。

結論

我們得出結論，CAPN10基因的遺傳變異影響非糖尿病受試者的血糖水平。這顯示了多種因素對糖尿病預後的綜合影響。在新位置發現的SNP可能是2型糖尿病的新的生物標誌物。然而，要建立CAPN10和ADIPOQ與印度Andhra Pradesh和Telangana地區糖尿病人群的結論性聯係，還需要更大樣本量的進一步分析。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Cheekurhty AJP, Rambabu C, Kumar A(2016) 2型糖尿病相關基因單核苷酸多態性的驗證。J Dia Res Ther 2(1): doi http://dx.doi。org/10.16966/2380 - 5544.114

版權:©2016 Cheekurhty AJP。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2015年11月07

  • 接受日期:2016年1月18日

  • 發表日期:2016年1月25日