摘要

背景:不同富血小板纖維蛋白(PRF)膜在再生醫學(包括再生牙科)中的臨床應用數量有所增加。PRF完整的血小板、白細胞和幹細胞在局部增骨過程中發揮重要作用，釋放細胞因子和生長因子。手術後管理的一個組成部分是漱口水的應用，特別是二葡萄糖酸洗必泰，為了防止術後感染，建議使用漱口水。在某些情況下，漱口水和PRF膜之間可能存在接觸。因此，我們測試了漱口水對折疊F-PRF細胞活力的影響。

方法:測試了3個漱口水品牌:Chorsodyl、李斯德林6合1和Elmex Sensitive Plus，在治療30秒和72小時後使用MTT活性測定(每天兩次，30秒)。膜樣品在細胞培養條件下培養。

結果:30秒漱口水處理顯著降低新鮮F-PRF活力15-21%，這取決於藥劑。治療72 h後，活性損失約50%。

結論:血小板和其他血細胞數量的減少不能啟動最佳的骨形態發生。MTT法是一種廉價、可靠、簡單的方法，用於評估血小板和細胞活力以及F-PRF膜或任何類型的富血小板產物的潛在再生能力。建議在PRF手術後至少5-7天內將PRF膜與口服液隔離和/或使用攻擊性較弱的漱口水。

關鍵字

漱口水;F-PRF;生存能力;MTT試驗;再生牙科

縮寫

CHX:洗必泰;DMEM: Dulbecco 's Minimal Essential Medium;F-PRF:折疊富血小板纖維蛋白;Lcs:白細胞;MTT法:甲基四唑測定法;PBS:磷酸鹽緩衝鹽水;請:血小板;紅細胞:紅血球

簡介

在過去的二十年中，關於不同富血小板膜(PRF)在口腔外科和種植牙科中的臨床應用的報告數量有所增加。關於口腔瘺的治療、粘稠骨的製備、拔牙後窩愈合等也有很多文章[1- 6]。術後管理的組成部分是每天用洗必泰-雙luconate (CHX)衝洗2 - 3次，持續30秒，殺死或減少致病菌數量，以防止術後感染[2,4,6]。有時，患者不顧醫生的建議，由於術後口腔異味或味道不好，在家裏更頻繁地使用漱口水。漱口水可以改善健康的口腔微生物群，然而，頻繁使用漱口水會破壞它[7,8]。CHX對牙齦成纖維細胞活力、膠原蛋白合成和傷口愈合[9]有有害影響。

毫無疑問，口腔中的液體(唾液、飲料、漱口水等)通過縫線孔與植入的PRF膜有短期或長期的直接接觸，這取決於上皮化和傷口閉合的速度。如果PRF膜不能與口腔完全分離，就有接觸的機會。此外，即使某些手術技術在PRF膜植入後仍使傷口開放，邊緣未主要閉合[2,5]。

富含血小板產品的主要效果是基於自體細胞如白細胞(LCs)、血小板(PLs)和幹細胞的再生特性理論。它們會釋放細胞因子和生長因子2-3周在體外，在骨和軟組織再生中起著至關重要的作用[10]。

PRF是一種特殊的個體細胞混合物，包裹在新生的纖維蛋白凝塊中，後來充當自動支架。纖維蛋白網絡對液體是可滲透的，所以這些細胞非常脆弱，漱口水的有害物質會損傷或破壞細胞的活力。活細胞的減少減少了細胞因子和生長因子的釋放，從而限製了最佳局部組織形態發生的機會。盡管PRF膜與術後漱口水衝洗在臨床應用中有許多成功的臨床報道，但失敗的病例很少，這迫使我們研究可能的原因。其中一個可能的原因是術後漱口水的影響。

Mosmann首先描述的MTT活性測定方法是基於在活細胞[11]中使用線粒體酶將黃色四唑鹽，3-(4,5-二甲基噻唑2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)轉化為紫色的甲醛色素。該方法已廣泛應用於化學敏感性、免疫學中的細胞刺激、細胞毒性、真菌、蠕蟲和細胞研究[12-19]。

在固體組織上發表的研究很少，而且沒有一項研究對PRF膜進行了檢測[16,18,20]。

由於參與非常脆弱的呼吸鏈的線粒體酶的活性是細胞生存所必需的，這種酶活性的評估可以用作細胞活力的替代標記。線粒體酶活性將下降，並最終停止在致命損傷細胞。隨著自溶的推進，呼吸鏈中的線粒體酶(如琥珀酸脫氫酶和細胞色素氧化酶)的活性在24至36小時內接近於零[21-23]。線粒體酶產生的甲醛色素不溶於水，但用合適的有機溶劑提取後，可以用分光光度計測定其濃度。最大吸光度為@563 nm通過分光光度計(Jenway 6300，英國)。稱重後，樣品在24孔板中孵育過夜，37℃，1ml乙二醇單甲醚(甲基纖維素溶液，Sigma)，以提取甲醛。所產生的顏色密度與線粒體酶活性成正比，反映細胞活力，而不管細胞周期狀態。

這項研究的主要目的是調查漱口水對F-PRF活力的影響，並將MTT活力測定應用於富血小板產品的研究。

材料與方法

治療30秒後進行活力測定

從一名誌願獻血者那裏收集了12管血液，並將其放入不含抗凝劑的9毫升液泡管中(Gerner BioOne，德國)。折疊的F-PRF膜由50毫升血漿製成，如先前報道的[24]。它還包含許多信用證和信用證。

將膜切成20片均勻的薄片，分成4組(每組5片)。1組(G1)為陰性對照組，不進行任何治療。在第2組(G2)中，將切片在室溫下浸泡在0.2%氯己定-二葡萄糖酸鹽(Chorsodyl®，GSK, UK)中30秒。在第3組(G3)中，將片片浸泡在李斯德林®6合1 (Johnson & Johnson Consumer Inc.， USA)中，在第4組(G4)中，將片片浸泡在Elmex®Sensitive Plus (Colgate-Palmolive, Poland)中，室溫30秒。所有漱口水都不含酒精。處理後，將F-PRF片在PBS中清洗10秒以去除漱口水。

隨後進行活力測定以評估膜的細胞活力。製作新鮮的MTT (Sigma, USA)溶液，同時將粉末溶解在PBS中，並在4°C保存。F-PRF片分別在500 μ l 0.1% MTT中37°C孵育1小時於24孔板中。將樣品轉移到蒸餾水中1分鍾，反應停止。

絕對生存力指數表示為光吸光度@563 nm/mg F-PRF/ml Cellosolve，但在圖1中轉換為相對百分比，新鮮30秒對照組(G1)的平均值設置為100%。采用非配對雙樣本t檢驗比較四組生存力指標的差異。

圖1:漱口水處理F-PRF膜後的活力結果。

3天後進行生存力測定

在CO2培養箱的細胞培養條件下(Heracell 150，德國)孵育72小時後，還評估了來自12管血液的其他20個F-PRF膜片。樣品在1ml Dulbecco 's Minimal Essential Medium (DMEM)中，加入0.1%胰蛋白酶(Sigma, USA)和0.4 mg/ml EDTA, 37℃，5% CO中孵育₂在一個24單元孔板。這種條件模擬生理條件，包括用組織培養基(Dulbecco 's Minimal Essential medium - dmem)喂養細胞和蛋白質水解酶(胰蛋白酶)的不利影響。每天用新的DMEM替換含有胰蛋白酶的DMEM。

每天將15個樣本(3組，G2-4)以相同的方式浸泡在漱口水中，每天兩次，每12小時一次(共7次)。處理後，將F-PRF片在PBS中清洗10秒以去除漱口水。

在漱口期間，F-PRF碎片被保存在培養箱中。對照組(G1, 5片)不使用漱口水，但遵循相同的程序。培養3天後進行活力測定。

結果

細胞活力指數如圖1所示。即使在30秒的漱口水處理後，也有明顯的下降，特別是G2 (CHX)，下降了22%。在李斯德林(G3)和Elmex (G4)的情況下，生存力下降較為溫和，但仍達到15-19%。G1組與治療組比較差異有統計學意義(p<0.01)。

3天後，李斯德林組和洗必泰組檢測到50%的存活率下降。Elmex治療效果更好(56%的生存能力)。30秒後和72小時後，對照組(G1)和治療組(G2- 4)的生存力結果有顯著差異(p<0.001)。3個治療組(G2-4)間差異無統計學意義(p<0.001)。

討論

任何PRF膜的細胞成分的活力對於滿意的組織和骨再生是至關重要的。PRF是細胞混合物與固體組織之間的一種過渡過程。最多的細胞是PLs和lc，但也可以發現紅細胞(rbc)和一些幹細胞。在線粒體缺失的情況下，紅細胞在本實驗中不起重要作用。F-PRF“活力”是不同細胞混合活力指標的結果。PLs是新陳代謝最活躍的無核“細胞”。PLs有5-8個線粒體，除LCs[25]外，它們在F-PRF中具有顯著的活力指數。在氧化磷酸化過程中，PLs和淋巴細胞耗氧率最高，單核細胞耗氧率中等，中性粒細胞以糖酵解[26]為主。MTT法以氧化磷酸化酶活性為主，多反映活性PLs和淋巴細胞數量，中性粒細胞數量較少。

F-PRF膜的主要優點之一是細胞分布均勻。生存力測試證實了這一點，因為不同實驗組的標準偏差(SD)並不太高，這意味著與L-PRF膜相比，每個樣品包含的細胞數量相似，細胞分布呈帶狀且不均勻[27]。

MTT法是一種廉價、簡單、可靠的方法，不需要費力的處理。它為F-PRF生存力測試提供了適當的定量結果。該方法適用於任何富血小板產物活力調查，以測試任何藥物對細胞活力的影響，並能顯示可預測的局部組織形態發生的潛力。

在漱口30秒後，F-PRF細胞的活力下降，盡管有細胞培養條件，但在治療3天後，下降幅度很大。特別是洗必泰對細胞活力有負麵影響，但李斯德林和Elmex的結果相似，但差異不顯著。在蛋白水解酶的存在下，F-PRF膜的解體在第一周相當緩慢，但在第2周加速^nd本周早些時候報道[24]。樣品無法承受漱口水和酶處理的雙重嚴酷。72小時後，G1對照組僅失去了9%的活力，因此差異(9% vs ~50%)是漱口水處理的結果。

傳統的術後手術目標(殺死致病菌)和再生牙科原則(保持再生細胞活力)之間存在一定的壓力。我們必須在這兩個方麵找到平衡，以便牙科醫生在PRF手術中對細胞水平有適當的方法和思考。更好的細胞存活機會意味著更好的組織再生。盡管有報道成功地在上頜骨使用PRF膜，而不進行初次傷口閉合和術後洗必定衝洗，但漱口水確實存在潛在的有害影響[2,6]。

口腔下部的接觸時間可能較長，因此單獨使用PRF膜或黏骨進行下頜骨再生的風險可能較高。理想的衝洗溶液可以防止術後感染，但不會對細胞和健康的微生物組產生不利影響。

結論

PRF完整的血小板、白細胞和幹細胞在局部骨增強中發揮關鍵作用，釋放細胞因子和生長因子。術後常規使用漱口水特別是CHX可降低PRF細胞活力。30秒的漱口水處理使新鮮的F-PRF活力顯著降低15- 21%。經72小時(2 × 30秒/天)處理後，活力損失約50%。建議在PRF手術後至少5-7天內將PRF膜與口服液隔離，並使用較溫和的漱口水。

的在體外F-PRF活力試驗結果與臨床條件下的結果可能不相同。與胰蛋白酶結合的組織培養條件模仿了口腔唾液的效果，但需要進一步的研究來確定理想的條件。

聲明

道德認可和同意聲明

在知情同意的情況下采集血液樣本。實驗符合吉吉爾地區研究與倫理委員會的倫理標準。批準日期:18^th2021年1月。身份證號碼:2/2021

發表同意書

不適用

數據和材料的可用性

本研究中使用和/或分析的數據集可根據合理要求從通訊作者處獲得。

相互競爭的利益

作者宣稱他們之間沒有利益衝突。

資金

不適用

作者的貢獻

LC設計實驗，采用生存力分析，並對數據進行解釋。

ÁB參與了放血和PRF膜的製備。

ZTB和RG參與研究設計，查找相關文獻，設定研究的臨床結果。

DC進行生存力測定。

JK是撰寫手稿和尋找最佳實驗室技術要求的主要貢獻者。

所有作者都閱讀並批準了最終的手稿。

確認

我們非常感謝John Kowalchuk在編輯手稿時的支持。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Csönge L, Bozsik A, Bagi ZT, Gyuris R, Csönge DK，等。(2021)警告:漱口水對折疊富血小板纖維蛋白(F-PRF)膜活力的負麵影響。國際口腔健康雜誌8(1):dx.doi.org/10.16966/2378-7090.385

版權:©2021 Csönge L，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可的條款發布，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是要注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2021年11月29日

接受日期:2021年12月9日

發表日期:2021年12月16日