摘要

脂肪源性幹細胞(ADSCs)具有巨大的組織工程應用潛力，有可能被引入口腔黏膜組織工程用於尿道成形術。本研究旨在通過在小腸粘膜下層(SIS)上播種口腔角質形成細胞(ok)和脂肪源性幹細胞(ADSCs)構建組織工程口腔黏膜。2018年8月至2019年10月，在我院實驗室進行觀察性研究，建立組織工程口腔黏膜。SIS從豬小腸中獲得，ok和ADSCs從犬源中獲得並培養和擴增在體外．將兩種細胞係分別種在SIS的兩個表麵，細胞-支架複合移植物在空氣液麵培養1周。SIS表現為多孔膜，HE染色未發現細胞。用OK-SIS培養的模型隻形成薄而疏鬆的上皮細胞。而OK-SIS-ADSC培養的模型更厚、密度更大。ADSC與OK共培養在SIS上生長良好，OK形成多層上皮。因此，利用ADSCs、ok和SIS構建組織工程口腔黏膜移植是可行的。ADSCs有助於形成較厚的上皮細胞。

關鍵字

組織工程;脂肪來源幹細胞;口腔角質細胞;尿道成形術

簡介

複雜尿道狹窄或尿道缺損的治療一直是臨床泌尿外科的難題之一，組織工程似乎是尿道成形術的最佳選擇。脫細胞基質和細胞種子結構物已用於尿道狹窄的臨床治療[1-3]，ok種子的脫細胞基質在動物尿道成形術研究[4]中被證明效果良好。另一項研究表明，脂肪源性幹細胞(ADSCs)在缺血條件下促進血管生成，分泌血管生成和抗凋亡細胞因子，表達血管生成的標誌物，並可分化為內皮細胞[5]。因此，在組織工程中引入ADSCs可能會加速移植物的血管生成過程。在我們之前的研究中，我們發現ADSCs的存在可以激活口腔角質形成細胞(oral keratinocytes, ok)的增殖和遷移速率。因此，在本研究中，我們將ok和ADSCs培養到脫細胞小腸粘膜下層(acellular small bowel sub黏膜，SIS)上，獲得一種新型的用於尿道成形術的組織工程組織。

材料與方法

這是一項觀察性研究，試圖通過在小腸粘膜下層(SIS)上播種口腔角質形成細胞(ok)和脂肪來源幹細胞(ADSCs)來製造組織工程的口腔黏膜。2018年8月至2019年10月，我們在我院實驗室完成了這項研究。

支架製備

豬小腸組織取自最近犧牲的重達70公斤的白豬。直接刮取小腸粘膜和肌層，得到SIS組織。為了誘導細胞裂解，分離的基質使用1% Triton X100(Sigma)和0.1% (v/v)氫氧化銨在37℃下攪拌14天。HE染色用於確定是否所有細胞都被從支架上移除。然後對支架進行冷凍幹燥、包裝和Co輻照⁶⁰以35kgy的劑量消毒。獲得的SIS支架在使用前保存在4°C。

口腔角質細胞(OK)培養

整個動物實驗方案在研究開始前由我們機構的動物護理和使用委員會批準。取1隻1.5歲比格犬下唇3 cm × 1 cm頰黏膜，瑞芬太尼和異丙酚靜脈麻醉，用4-0絲線縫合傷口。術後靜脈注射抗生素4天以預防感染。然後將粘膜轉移到無菌磷酸鹽緩衝液(PBS)中，使用改良的皮膚角質形成細胞萊茵瓦爾德和格林方法[6]分離培養口腔角質形成細胞。用0.2U/ml disase II酶消化頰黏膜，取真皮。然後將胰蛋白酶化後的口腔角質形成細胞從表皮中分離出來，並在Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium(DMEM, Gibco, USA)中以1:1的比例添加10%胎牛血清(FCS)和無角質形成細胞血清培養基(KSFM, Gibco, USA)，以絲裂黴素(i3T3)抑製的3T3小鼠成纖維細胞的飼養層上接種。將部分ok接種到空組織培養皿中，在KSFM培養基中培養，進行比較。為了擴大，每3天對ok進行培養和重新喂食，直到它們融合85-95%。用disase II去除殘留的i3T3細胞，用0.2U/ml胰蛋白酶分離角質形成細胞。

脂肪源性幹細胞(ADSC)培養

從上圖同隻Beagle的腹股溝皮下環上，經右側腹股溝區縱切3cm，取下約3cm × 2cm × 1cm的脂肪組織，采收後間斷用3-0絲線縫合。脂肪組織轉移到無菌PBS中。用眼剪切除可見小血管，剩餘組織切成小塊，用0.1%膠原酶I (Worthington, USA)在37℃下消化1小時，不間斷搖晃。脂肪源性幹細胞(ADSCs)經過濾和離心後獲得。分離的ADSCs在37℃、5% CO、添加10% FBS的DMEM中培養₂[7]。當達到80-90%合流時，分離的細胞進行胰蛋白酶化，計數，並以10的密度進行傳代培養⁵細胞/ 100毫米。

ok和ADSCs的觀察和鑒定

用免疫熒光染色法鑒定培養的P3 ok。采用小鼠細胞角蛋白AE1/AE3單克隆抗體(SigmaAldrich)檢測細胞角蛋白AE1/AE3的表達;該抗體還用於流式細胞術檢測ok的純度。

利用BD生物科學公司(Franklin Lakes, NJ, and USA)提供的CD34, CD44, CD45, CD90, CD105和CD106抗體，流式細胞術鑒定培養的P5 ADSCs。

細胞播種

播種前，SIS在無菌生理鹽水中浸泡15分鍾再水化，然後在無菌PBS中浸泡48小時，再在DMEM中添加10% FBS浸泡48小時。在第5個細胞傳代處收集ADSCs，以3 × 10的密度將高濃度細胞懸液播種到SIS上⁶/厘米²，然後在37℃，5% CO孵育4小時₂在添加足夠的培養基之前，用於細胞粘附。adsc種子的SIS培養4天(期間每天更換培養基)，轉移到浸入DMEM的不鏽鋼絲網上，有細胞的表麵麵對絲網，無種子的表麵恰好在空氣液麵。收集P3 ok，以3×10的密度播種到非播種表麵⁶/厘米²．同樣，在加入KSFM之前，將化合物孵育4小時以使細胞粘附。化合物在混合培養基(DMEM:KSFM=1:1)中培養，每天更換，在空氣液位下培養7天，然後分析。此外，在沒有ADSCs的情況下，將第三代ok以相似的密度播種到SIS上進行比較。

結果

口部傷口不影響比格犬的食物消耗，腹股溝傷口也不影響動物的活動能力。口腔傷口愈合6天後，腹股溝傷口愈合10天後，無任何感染跡象。

去除細胞後，SIS呈現為多孔膜。HE(圖1A)和Masson(圖1B)隨機染色，脫細胞效果一致，未見細胞。通過Masson染色(圖1B)，我們發現SIS由均勻的膠原纖維組成。

圖1:A. SIS HE染色;B. SIS Masson染色;C.歐克斯表現出典型的鵝卵石狀形態;D.沒有i3T3給料層，P2 ok老化，出現多種形狀和尺寸;E.免疫熒光染色驗證ok中細胞角蛋白AE1/AE3的表達。細胞核Hoechst染色;F. ADSCs呈梭狀，呈紡錘形。

i3T3給料層上的ok呈多邊形，呈典型的鵝卵石狀形態(圖1C)。8 d後，培養板覆蓋率達到90%，細胞可傳代8代。第3段ok的總量為5 × 10⁷在SIS上以3 × 10的密度播種即可⁶/厘米²．在沒有i3T3給料層的情況下，大約2周後ok才覆蓋90%的培養板;這些細胞在老化前隻能傳代2代，並且具有多種形狀和大小(圖1D)。免疫熒光染色顯示細胞角蛋白AE1/AE3在3代ok中表達(圖1E)，流式細胞術結果顯示細胞角蛋白AE1/AE3在3代ok中的表達率為90.25%。

經過近7天的培養，ADSC種群覆蓋了培養皿的90%左右;這些細胞呈梭形，呈梭形形態(圖1F)，可傳代10代，無衰老跡象。流式細胞術分析顯示，ADSCs中CD90(95.53%)、CD34(40.20%)、CD44(97.42%)、CD105(65.25%)表達，CD45(2.13%)、CD106(2.05%)無明顯表達。

分離i3T3細胞培養的第5代ADSCs和第3代ok，以3 × 106 /cm的密度分別接種於SIS的兩個表麵²對於每個細胞係。複合移植物與ok種子表麵在空氣液麵向上培養1周。通過掃描電鏡，我們發現ADSCs(圖2)和ok(圖3)都與SIS緊密粘附。兩株細胞係均向外伸展偽足，並相互連接。通過隨機HE染色，我們發現OK-SIS培養的模型隻形成了薄而疏鬆的上皮(圖4A)。而OK-SISADSC培養的模型更厚、密度更大(圖4B)。ADSC與OK共培養在SIS上生長良好，OK形成多層上皮。

圖2:掃描電鏡顯示，ok在SIS上存活良好。

圖3:掃描電鏡顯示ADSCs在SIS上存活良好。

討論

不同原因引起的尿道狹窄或缺損是泌尿外科常見的情況，在很多情況下需要進行尿道置換成形術。雖然近年來出現了許多尿道成形術的手術方法，但複雜的尿道狹窄或缺損仍然是泌尿外科手術中最具挑戰性的問題。頰部、舌部、膀胱和結腸黏膜以及生殖器或生殖器外皮膚是尿道成形術中使用的主要成分，尤其是前兩者。然而，有限數量的自體供體組織限製了這些類型的重建。此外，在長期隨訪中仍會出現口腔疼痛、腫脹、麻木、緊繃、運動缺陷等並發症[8-10]。

組織工程將生命科學的原理和方法與工程學相結合，開發出一種修複受損組織和替換整個組織結構的方法。在過去十年中，使用含有細胞的可生物降解材料進行泌尿生殖係統重建越來越普遍[2,3,11]。

本研究的目的是對組織工程口腔黏膜(TEOM)的OKs、ADSCs和SIS的構建進行初步評估。我們分離出犬OKs和ADSCs，進行培養和擴增在體外，並將兩種細胞係分別播種於無菌豬SIS的兩側，建立TEOM模型。我們的目標是為尿道成形術提供定製的替代組織。

本研究中使用的細胞培養技術證明是可靠的。播種到i3T3細胞飼養層的ok增殖能力強，獲得足夠數量的優質ok相對簡單。ADSCs也表現出較強的增殖能力，我們獲得了足夠數量的細胞進行播種。經過21天的培養和擴增，我們得到大約5 × 10⁷好的，第三段，大約是2 × 10⁸通道5的ADSCs。如果所有培養的細胞都用於製備TEBM，就有可能構建一個3厘米× 5厘米的條帶。如果需要更大的條帶，繼續培養和擴大兩種細胞係將產生足夠的數量。在我們的研究中，i3T3上的ok可以傳代6代，ADSCs可以傳代10代以上;因此，獲得足夠數量的ok和ADSCs是現實的。

合適的支架生物材料是開發用於尿道成形術的組織工程材料的主要挑戰。這種生物材料必須具有生物相容性，以減少植入後的任何炎症或異物反應;它還應促進細胞粘附、增殖、遷移和分化，以促進和促進新組織的發育。此外，一旦植入，它應該在新組織成熟後自動降解。SIS具有所有這些特性，它以前被用於泌尿外科的尿道成形術。在我們的研究中，我們成功地將豬小腸粘膜下層脫去，以獲得SIS。SIS保留在相對完整的細胞外基質支持框架上，用抗原去除細胞成分，使免疫反應介導的炎症無法誘導。此外，SIS具有多孔結構，含有豐富的膠原纖維，這是細胞粘附和生長的結果。我們通過掃描電鏡發現，ADSCs和ok在SIS上都生長良好，且兩株細胞株都在偽足外周延伸並相互連接(圖2,3)。

脂肪組織來源於胚胎中胚層前體，含有多能分化為間充質組織的祖細胞，如軟骨細胞、骨細胞、心肌細胞、神經元和平滑肌細胞[12]。這些祖細胞被稱為脂肪來源幹細胞(ADSCs)。ADSCs的收獲比任何其他類型的成體幹細胞都要容易，脂肪組織中幹細胞的豐度是相同體積骨髓[13]中幹細胞的100- 1000倍。有報道表明ADSCs具有免疫特權在體外而且在活的有機體內[14]，使它們能夠作為同種異體移植的通用供體細胞。在之前的報道[15]中，ADSCs表現出傷口愈合和抗氧化作用，這歸因於生長因子的產生和分泌，如bFGF, KGF, TGF-β， HGF和VEGF。通過旁分泌機製，這些生長因子可刺激膠原合成和真皮成纖維細胞的遷移，並激活真皮成纖維細胞和角質形成細胞，從而加速血管化，從而加速動物模型中的傷口愈合[16]。也有報道表明ADSCs可以加速用於修複皮膚缺損[17]的組織工程移植物的血管化。因此，我們預計ADSCs可能通過激活口腔黏膜組織中的角質形成細胞來加速新黏膜的形成，並加速組織工程口腔黏膜的血管化。

由於ADSCs與成纖維細胞均為梭狀，呈紡錘狀形態，因此僅憑培養形態很難將其與成纖維細胞區分開來。在本研究中，流式細胞儀分析表明，犬源性ADSCs表達高水平的幹細胞相關抗原(CD90、CD44、CD34和CD105)，但不表達CD45或CD106。我們的結果與之前的報道[18]相似，表明我們的ADSCs群體是間充質幹細胞。

與尿道上皮細胞類似，口腔角質形成細胞(ok)被認為是覆蓋上皮，具有適應潮濕環境的厚上皮，易於采集。因此，組織工程口腔黏膜在尿道成形術中具有廣闊的應用前景。在本實驗室的動物實驗中，將植於膀胱脫細胞基質上的ok構建的組織工程口腔黏膜用於尿道成形術[4]。也有報道組織工程口腔黏膜在泌尿外科臨床用於尿道成形術，盡管結果並不令人滿意[2]。

在本研究中，我們成功地分離並擴展了ok在體外．ok呈多邊形，表現出典型的鵝卵石狀形態(圖1C)。流式細胞術和免疫熒光染色(圖1E)顯示細胞角蛋白AE1/AE3的表達，支持了我們實際上分離並擴增了角質形成細胞的說法。

在我們實驗室前期的研究中[4,7]，我們將ok種在生物材料支架上，然後將複合移植物在氣液平麵培養1周，構建組織工程口腔黏膜移植物。作為完全分化的細胞，OKs在i3T3細胞的喂養層上培養和擴增，如果沒有這一層，OKs將迅速老化。因為ok是在斷頭台上播種的，後來才被使用在活的有機體內對於尿道成形術，它們可能在離開i3T3供體層後迅速老化，這可能會減緩新粘膜的形成。在我們之前的研究中，我們發現ADSCs的存在可以激活ok:在與ADSCs共培養的環境中，ok的增殖增加，遷移增強。因此，在本研究中，我們在SIS的一個表麵播種ok，在另一個表麵播種ADSCs，形成三維培養環境[19]。此外，我們在SIS上隻播種ok作為對照。在空氣液麵培養1周後，對細胞-移植物複合移植物進行分析。HE染色顯示OK-SIS- adsc複合移植物表麵形成了上皮細胞，且OK-SIS- adsc複合移植物的上皮細胞厚度較OK-SIS複合移植物厚(圖4)，而且前者的上皮細胞形態優於後者，這可能與ADSCs的功能有關，因為單位麵積上OK-SIS複合移植物的數量相等，並且這種功能可以持續在活的有機體內．

圖4:不同細胞支架結構形成的上皮細胞:A. OK-SIS;OK-SIS-ADSC。

在本研究中，我們成功地用ADSCs、ok和SIS構建了組織工程口腔黏膜。我們的結果表明ADSCs的存在有助於上皮細胞的形成在體外．未來，我們將在動物實驗中使用這種OK-SIS-ADSC複合移植物進行尿道成形術。

結論

在SIS上植入OKs和ADSCs構建組織工程口腔黏膜移植是可行的。ADSCs的存在有利於新上皮細胞的形成。

權益聲明書

作者確認他們沒有利益衝突。

參考文獻

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條信息

文章類型:研究文章

引用:張強，田玉軍，丁濤，馮德華(2021)構建組織工程口腔黏膜的初步研究。國際口腔健康雜誌7(5):dx.doi.org/10.16966/2378-7090.377

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出版的曆史:

收到日期:2021年8月4日

接受日期:2021年8月11日

發表日期:2021年8月19日