牙科與口腔健康科學“，

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研究文章
褪黑素對人成骨細胞的劑量相關效應體外Via納米級硫酸鈣的控製釋放

AW巴龍M普林格爾D阮R Dziak＊

美國紐約州布法羅市布法羅大學牙科醫學院口腔生物學係

*通訊作者:R Dziak，美國紐約州布法羅市布法羅大學牙科醫學院口腔生物學係，電話:716 8293827;電子郵件:rdziak@buffalo.edu


摘要

作品簡介:工程生物可降解支架用於骨缺損的骨再生是一種有吸引力的選擇，從活組織中獲取移植物。硫酸鈣基支架可以製造成具有與新骨生長相稱的降解剖麵。然而，對硫酸鈣生物力學強度的擔憂限製了它在填充小骨缺損方麵的應用。納米級硫酸鈣具有增強的物理性質，並能成功促進臨界大小顱麵骨缺損的骨再生。先前的研究表明，這種生物陶瓷也可以適應可持續的生長因子傳遞到骨細胞在體外．最近，褪黑素作為重組人蛋白的一種潛在替代品，用於增強合成骨支架的成骨誘導潛力，受到了人們的關注。但其臨床療效可能受其對骨細胞刺激作用劑量相關變化的限製。因此，將褪黑素加入納米級硫酸鈣中可能會產生一種新的支架係統，具有臨床應用於骨再生醫學的潛力。

材料與方法:通過測量細胞活力和堿性磷酸酶活性來檢測褪黑素對人成骨細胞的劑量相關成骨效應。納米級硫酸鈣釋放的褪黑激素的生物活性是通過測量植入支架的細胞的活力來評估的。然後製備含有不同劑量褪黑素的支架，並對每組的釋放譜進行表征。

結果與結論:暴露於微量摩爾濃度褪黑素的人骨細胞可增加細胞活力和堿性磷酸酶活性。在納米級硫酸鈣中加入褪黑素可以增加植入支架的細胞的活力。因此，從支架中釋放的褪黑素保留了其生物活性。釋放研究表明，納米級硫酸鈣可以隨著時間的推移持續釋放褪黑素。釋放曲線受褪黑素含量的影響。這項研究提供了進一步的證據，支持納米級硫酸鈣作為一種可調支架的潛在用途，能夠提供大量刺激骨骼生長的褪黑素。

關鍵字

納米級硫酸鈣;骨再生;Osteoinduction;褪黑素;控製釋放;人類成骨細胞

縮寫

ncs納米級硫酸鈣;CS-Calcium硫酸;Mel-Melatonin;hobs -人成骨細胞;ALP-Alkaline磷酸酶


簡介

全世界每年進行超過200萬例手術，植骨是在牙科、骨科和神經外科等各種醫學領域增強骨再生的最常見方法。骨移植的目的是作為腳手架結構支持新的血管生成和骨生長在傷口部位。臨床上，外科醫生仍然認為自體移植是骨移植手術的“金標準”。然而，這些移植結構容易引起各種並發症，如供體部位發病、血腫形成和恢複期延長[1-2]。盡管同種異體移植物的使用有所增加，但這些移植物會造成疾病轉移和引發不良免疫反應的風險。為了避免從活組織中獲得移植物的一些特征限製，近幾十年來，市場上出現了大量FDA批準的骨移植物替代品[1- 3]。大多數這些合成結構物都很硬，但很脆，缺乏內在的成骨誘導和成骨特性，隻有骨傳導[1]。

理想的骨再生合成支架應具有完全的生物可吸收性，並具有與傷口部位新骨形成相稱的降解率。此外，支架應能有效刺激周圍骨膜的骨前細胞趨化，並促進其向成骨細胞表型[4]分化。為了實現這一目標，一種流行的策略是將成骨生長因子設計到合成支架係統的三維結構中[5-8]。生長因子與細胞表麵或細胞核受體結合。這種配體-受體結合調節信號級聯的激活和/或抑製，調節蛋白質生產和基因轉錄。目前在骨組織工程中使用的許多成骨因子都是利用重組DNA技術合成的。迄今為止，隻有三種重組人骨生成因子獲得了FDA批準用於人類:rhBMP-2、rhBMP-7和rhPDGF-BB[4]。然而，高昂的生產成本和有限的商業可用性使其臨床使用的程度變得模糊。它們的生物半衰期也很短。例如，rhPDGF-BB的生物半衰期約為2分鍾在活的有機體內[9]。由於這些缺陷，一些臨床醫生已經轉向使用富血小板血漿(PRP)，這是一種更經濟實惠的成骨因子的自體來源[10,11]。

目前，褪黑素(Mel)作為一種主要由鬆果腺合成和分泌的神經內分泌激素，用於改善骨缺損的骨再生的治療劑已引起了人們的興趣[12-15]。除了鬆果體，Mel的合成也發生在身體的其他部位，包括:眼睛、皮膚、腸道、性腺和骨髓[16-17]。因此，它對身體的影響是千差萬別的。在再生醫學方麵，臨床前研究表明Mel可以改善牙周及顱麵骨缺損的骨填充質量[14-15]。此外,幾在體外研究表明Mel可以促進各種人成骨細胞係的增殖和誘導成骨分化[18- 25]。與重組人生長因子相比，Mel具有以下優勢:其生產成本低，易於臨床使用;其體積小，不易變性;其生物半衰期長(~60分鍾)，使其臨床應用對技術不那麼敏感。

Mel除了被提議用於再生醫學之外，還作為一種有前景的治療輔助劑受到了關注，可以減少骨癌患者骨骨折和骨溶解的發生率[26]。然而，當在體外另一項研究表明，暴露於毫摩爾濃度的Mel會抑製MG-63人骨肉瘤細胞的增殖在體外研究表明，暴露於毫摩爾濃度的Mel可促進成骨前MC3T3 E1細胞凋亡[27-28]。因此，骨腫瘤患者的全身Mel給藥容易被狹窄的治療窗口所混淆，從而發現具有最佳治療效果的劑量在體外可能毒性太大而不安全在活的有機體內．

內源性Mel常以納摩爾濃度存在於血漿中[29]。幾個在體外研究強調暴露於微摩爾濃度的Mel可導致正常人類成骨細胞(hob)活力增加[18- 24]。優化Mel對骨再生的治療效果的一種可能的方法是將其納入可調節藥物釋放的移植材料中。然而，雖然已經開發了大量能夠持續給藥的骨支架係統，但隻有少數研究考慮將Mel加載到這些3D結構中[30-33]。

納米級硫酸鈣(nCS)是一種新型的物理性能增強的支架體係[34]。與常規醫用級硫酸鈣(CS)相比，nCS具有指數級增加的細胞附著表麵積和成骨生長因子吸附[34]。這一特性使nCS對生長因子含量的裝載能力增加，從而增加了藥劑的生物利用度。它還允許它適應可控的生長因子釋放[7,34]。在體外研究表明，加載生長因子的nCS支架可提高hob和間充質幹細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)的活力[6-7,34]。最近，一項犬類臨床前研究表明，nCS支架可以促進臨界尺寸下頜骨缺損[35]的骨再生。

本研究的目的是確定nCS支架是否可以通過釋放被認為與治療相關的藥物量來適應Mel的可持續遞送在體外．首先，確定了使人成骨細胞的活力和堿性磷酸酶(ALP)活性最大化的Mel濃度的具體範圍。之所以這樣做，是因為據報道Mel對骨細胞活力和骨分化的影響取決於所使用的藥物濃度和檢測的特定細胞類型[36]。其次，我們評估了從nCS/Mel支架中釋放的Mel是否具有生物活性。最後，我們描述了nCS/Mel支架隨時間的釋放動力學。

材料與方法

通過將凍幹褪黑素粉(Sigma Aldrich，美國)溶解在5%乙醇(v/v)和PBS (Gibco，美國)中製備一係列Mel原液。使用的所有其他化學品和試劑均從Sigma-Aldrich購買，除非另有說明。

細胞和細胞培養

主要的hob從ScienCell公司(美國)購買，生長在75厘米2塑料培養瓶(Falcon, USA)，含有MEM-α (Gibco)，補充10%胎牛血清(FBS)和1%抗真菌溶液。用適當體積的MEM溶劑從原液中稀釋等分，製備富集Mel的培養基。除非另有說明，所有用於細胞培養維護的材料均購自Gibco。培養在加5% CO的加濕培養箱中保持37°C2．每2 ~ 3天更新一次培養基，直至細胞融合。第1至4代細胞用於實驗。

MTT細胞活力測定

24小時采用MTT[3(4,5二甲基噻唑2基)2,5二苯四溴化銨]法檢測Mel對HOB細胞活力的劑量依賴效應。所選擇的Mel濃度基於以往報道的數據[18,24]。在MEM中培養的hob不含Mel作為對照。將細胞接種於96孔板(Costar, USA)，並在貧Mel或富Mel培養基(10 μM、50 μM或100 μM)中培養。24 h時，每孔加入13 μL MTT試劑，再孵育4 h。然後，在每個孔中加入130µL的二甲基亞碸(DMSO)，並將板孵育20分鍾。在微孔板閱讀器(Flex Station 3 Multi - Mode microplate reader, USA)中，通過540 nm的吸光度測量每個樣品的光密度(OD)。

堿性磷酸酶活性測定

在48時用ALP法評價Mel對hob成骨分化的影響。將細胞接種於96孔板(Costar)中，並在貧Mel或富Mel培養基(10 μM、50 μM或100 μM)中培養。48小時孵育期後，取出每孔中的培養基，用濃度為1% (v/v) Triton X-100 (Avantor Performance Materials, USA)的105 μL替代。然後在4°C下保存1小時。每孔加入50 μL氨基甲基丙醇(AMP) + 50 μL ρNpp試劑，孵育30 min。通過測定酶促無色的ρ硝基苯磷酸(ρNpp)轉化為黃色的ρ硝基苯酚(ρNp)的程度來評估細胞ALP水平。在每孔中加入50 μL 0.5 N NaOH停止液終止反應。每個樣品的OD是通過在405 nm處的微孔板閱讀器中的吸光度來測量的。

nCS的製備

納米級硫酸鈣是根據Park和同事[34]概述的程序製備的。按照既定方案，8.0 g醫用級CS (CaSO4.2H2O;99.9%純度)溶解於4.0 L蒸餾水中。然後將均質溶液分配到小燒瓶中，在-196°C的液氮中冷凍。采用低溫真空法，將二水合物的CS轉化為二水合物的nCS。然後將所得的白色粉末在常規烤箱中在130至150°C的溫度下加熱，以生成水合nCS。去除後，粉狀產品進行消毒通過發光放電處理(GDT)。這有助於產生nCS的組成，不容易再水化，在室溫下更穩定。

nCS/Mel支架的製造

製備nCS/Mel片形式的支架:將100 mg nCS粉單獨與100 μL PBS混合，或與100 μL含不同量Mel的等份混合。然後將所得的可塑白色膏體沉積在聚乙烯醇矽氧烷模具中，並在室溫下放置約2.5小時。一旦充分硬化，完整的圓盤從模具中取出，並在室溫下保存在消毒的玻璃容器中。每個圓盤寬5mm，厚3mm，幹質量0.08 g。

生物活性研究

一旦腳手架係統被證明是適應可持續的藥物輸送，就有必要確定釋放的製劑是否保持生物活性。為了達到這一目的，在37°c下用nCS/Mel支架孵育hobs 48小時後使用MTT法測定細胞活力。在本實驗中，用未經處理的nCS支架播種的hob作為對照。治療組由含有~5.0 μg Mel的nCS/ Mel支架的hob組成。48小時，按照前麵提到的相同方案進行MTT檢測。

釋放研究

對nCS支架與不同毫摩爾濃度的Mel混合進行了釋放研究。治療組的支架分別為nCS/2.5 mM Mel、nCS/5 mM Mel或nCS/10 mM Mel。校準曲線(y=0.0011x+0.0045;R2=0.9987)是通過在254 nm處用吸光度測量稀釋後的Mel樣品的光密度得到的。Mel吸收波長的選擇基於先前的報告[37]。根據校準曲線，在四個預定時間點(1,3,24和48小時)定量測定從支架中釋放的Mel量。在本實驗中，nCS/Mel支架(5 mm寬，3 mm厚，幹質量0.08 g)分別放置在96孔板的不同孔中，懸浮在200 μL PBS中。在每個時間點，收集介質並用等體積的PBS替換。從每個樣品中收集的介質存儲在一個單獨的微型離心管中。在48小時，每個樣品中存在的Mel量在254 nm處的微孔板閱讀器中通過吸光度定量。 Initial amounts loaded and cumulative amounts of Mel released from the nCS/Mel scaffolds are expressed in micrograms (μg). The amounts of Mel released were calculated as a percentage of the cumulative amount of Mel released at the specified time interval divided by the initial amount of Mel loaded into the nCS discs in μg.

另一項釋放研究是將nCS支架與微量摩爾濃度的Mel混合。在本實驗中，隻在三個預定時間點(24、48和72小時)收集培養基。設對照組和兩個處理組:nCS/10 μM-Mel和nCS/100 μM-Mel。在72小時，每個支架(5毫米寬，3毫米厚，幹質量為0.08的圓盤)釋放的Mel累積量用ELISA試劑盒(Enzo Life Sciences, USA)和酶標儀定量。從nCS/Mel支架中加載的初始量和釋放的Mel累積量以納克(ng)表示。由於該檢測方法的檢測範圍在0.08 50 ng/mL之間，因此根據製造商的方案對實驗樣品進行了相應的稀釋。釋放的Mel量計算為在指定時間間隔內釋放的Mel累積量的百分比乘以相應的稀釋度，再除以加載到nCS光盤中的初始量，單位為ng。

數據統計分析

結果以均數±標準差(SD)表示。所有統計計算均使用Microsoft®Excel軟件(Microsoft Corporation, USA)進行。所有數據比較和評估采用單向方差分析(ANOVA)。p值≤0.05時，接受統計學意義。

結果與討論

一些作者報道Mel可以增強成骨細胞的成骨潛能在體外而且在活的有機體內(15歲至25歲38-41]。然而，Mel對骨形成的治療作用似乎與劑量有關。多項研究表明，Mel的成骨作用在微摩爾濃度下最為強勁[18,21,24]。一個在體外研究發現Mel對人成骨細胞(HOBs)的增殖作用在50 ~ 100 μM[17]之間達到最大。同樣,另一個在體外研究表明，Mel在50 ~ 200 μM[20]濃度的培養基中可顯著提高hob的活性。因此，假設暴露於微摩爾濃度的Mel會刺激hob的生存能力增加。10 μM的Mel處理對細胞活力有最大的刺激作用(圖1)。另一方麵，雖然50 μM和100 μM的Mel處理的hob相對於對照組表現出更高的活力，但在統計學上，它們相對於10 μM的Mel處理的細胞沒有表現出更高的活力。我們的發現與其他關於Mel對骨細胞活力影響的劑量相關變化的報道一致[18,21]。在我們的研究中，高濃度(50 μM和100 μM)的Mel處理的hob可能已經經曆了最大的Mel增殖效應，並進一步分化。例如，當細胞進一步分化時，通常會發生增殖減弱的情況。

圖1:用hob在富含mel的培養基中孵育24小時進行MTT檢測;*=與對照組和所有其他治療組顯著不同;#=與對照組和在10 μM Mel中孵育的HOBs有顯著差異;n = 8;p < 0.05方差分析。

通過測定hob在48小時內表現出的ALP活性水平來評估Mel的成骨誘導潛力。Mel在100 μM下孵育的hob表現出最高水平的ALP活性(圖2)。然而，較低濃度的Mel (10 μM和50 μM)處理的hob表現出明顯低於對照組的ALP活性。也就是說，其他研究報告觀察到，在~10 ~ 200 μM[21]的微摩爾Mel濃度範圍內，hob的ALP活性呈劑量依賴性增加。相反,一個在體外研究報告指出，誘導骨分化所需的最小Mel濃度是50 nM[22]，這表明在2天內MSCs中ALP活性增加。同樣地，另一個在體外研究發現，在成骨前MC3T3細胞[19]中，50 nM足以誘導骨分化——正如細胞內ALP mRNA轉錄的增加所表明的那樣。我們的發現可能部分歸因於hob表達的Mel受體類型的差異。

圖2:在富mel培養基中培養48小時，hob的ALP活性;*=與對照組和所有其他治療組顯著不同;#=與對照組和在10 μM Mel中孵育的HOBs有顯著差異;n = 8;p < 0.05方差分析。

骨細胞表達兩種不同的g蛋白偶聯跨膜Mel受體(MT1和MT2)和一種核Mel受體(RZR/ ROR)[43-45]。RZR/ROR表達可能通過Mel/ MT受體結合調控。先前的一項研究報道MT2受體脫敏與MSCs[20]中ALP活性峰值相關。證據還表明，RZR/ROR受體除了與跨膜Mel受體相比具有較低的配體結合親和力外，還可能參與調節骨標記蛋白(如ALP)基因轉錄的信號轉導途徑[46,47]。在我們的研究中，在10和50 μM濃度下富集Mel的培養基中可能含有足以刺激跨膜Mel受體的Mel，但不足以在48小時的孵育期內有效誘導RZR/ROR介導的ALP轉錄。這是由暴露於100 μM Mel的hob的ALP表達的相對大小所支持的與低濃度的Mel。對照組觀察到堿性磷酸酶水平升高與暴露於Mel 10和50 μM的hob可歸因於Mel對骨分化的劑量相關和時間依賴效應。

在本文中，我們已經證明了從nCS釋放的Mel在48小時後仍保持其生物活性。nCS/Mel支架接種的hob的活力增加證明了這一點與將hob植入未經處理的nCS支架(圖3)。這一點值得注意的是，其他研究正在構思開發支持局部和可持續Mel輸送的支架係統。其中一些化合物需要改變其表麵化學性質以支持Mel吸附[30,33]。理論上，這種分子修飾可以改變和/或損害釋放的Mel的生物活性。因此，使用nCS製備Mel負載腳手架係統的優點之一是，不需要修改其表麵化學性質來支持Mel吸附。

圖3:MTT法評價生物活性;數據表示在nCS或nCS/Mel支架上播種的hob的相對生存能力;*=與不含Mel的對照組差異顯著;n = 8;p < 0.05方差分析。

目前的研究結果進一步證明了nCS在適應局部和可持續生長因子傳遞方麵的潛力在體外．這種能力很重要，因為它允許Mel被專門輸送到傷口部位負責再生骨組織的細胞[48]。它也很重要，因為它允許更協調的細胞反應，如成骨細胞前體的增殖和分化。在調節可控釋放方麵，納米材料比傳統尺寸的合成結構具有許多優勢[34,49]。摘要發布概要文件nc /梅爾·梅爾的支架進行評估在兩個獨立的實驗中(圖4和5)。在第一個實驗中,紫外分光光度法用於測量梅爾釋放nc / Mel支架載荷~ 60至230μg(表1)。支架containing116μg和232μg梅爾的特點是釋放概況迸出初始(35%和65%),其次是穩定釋放階段3 - 24小時之間(圖4)。相比之下,含58 μg的支架在0 ~ 3小時內釋放量小於5%，在48小時內釋放量小於25%。此外，這些支架在整個實驗期間幾乎顯示線性釋放動力學。在第二個實驗中，使用ELISA試劑盒檢測負荷在230 - 2330 ng之間的nCS支架釋放的Mel量(表2)。對於兩個處理組，在72小時內釋放的Mel量小於10%(圖5)。在整個實驗期間，每組都表現出持續釋放的情況。與裝載58 μg Mel的支架相似，這兩個治療組都沒有發生爆發性釋放。綜上所述，這些發現表明nCS可以作為一種可調節的支架，以有利於骨再生的數量調節Mel的可控遞送。

圖4:經毫摩爾(mM)濃度梅爾處理的nCS盤釋放的累積量;每個數據點表示nCS光盤釋放的Mel (μg)相對於初始加載量的百分比;n = 8。

圖5:微摩爾(μM)濃度的Mel處理過的nCS盤的累積釋放量;每個數據點表示nCS光盤釋放的Mel (ng)相對於初始加載量的百分比;n = 8。

發布褪黑激素(μg)
Scaff歲的 0人力資源 1小時 3人力資源 24小時 48小時
nc / 2.5 mM-Mel 58.07 1.32±0.13 2.13±0.70 9.75±1.59 12.92±1.94
nc / 5 mM-Mel 116.14 36.53±2.72 41.94±2.54 65.63±4.56 67.73±4.71
nc / 10 mM-Mel 232.28 128.06±11.56 142.30±7.12 167.25±12.48 167.40±12.55

表1:首次發布實驗;采用紫外分光光度法采集數據;每個nCS盤在0小時時的Mel初始量以微克/支架表示;每個其他條目表示在指定的時間間隔內支架釋放的Mel的平均累積量。

釋放的褪黑素(ng)
支架 0人力資源 24小時 48小時 72年人力資源
nc / 10μM-Mel 232.28 3.72±0.24 9.06±0.64 14.63±0.34
nc / 100μM-Mel 2322.80 60.39±0.19 125.43±0.75 185.82±0.46

表2:二次發布實驗;使用ELISA試劑盒收集數據;每個nCS盤在0小時時的初始褪黑素量以納克/支架表示;每一項表示支架在特定時間釋放的Mel的平均累積量。

目前關於Mel負載支架的報道大多涉及利用β-磷酸三鈣或羥基磷灰石的變體的係統。據報道，磷酸鈣衍生物在合成骨移植中使用的一個局限性是其生物降解特性的不可預測性[1-2]。對於羥基磷灰石移植物，研究表明其相對較高的鈣磷比和晶體結構延長了吞噬細胞[50]對其的吸收。這導致剩餘的羥基磷灰石移植材料嵌入骨填充物中。這樣的嫁接殘留物的存在，反過來，通過降低其抗骨折[2]而降低了新骨的內在強度。

據報道，與磷酸鈣基體係相比，由CS製成的移植物具有更強的生物可吸收性。此外，它們可以被製造成具有可調的降解剖麵，可以密切匹配新骨形成的速率[51]。然而，關於其較弱的內部強度的報道意味著其使用應僅限於填充小的骨缺損[2,52]。另一方麵，與CS相比，納米級硫酸鈣具有更好的機械強度，並已被證明能夠成功地促進臨界大小顱麵骨缺損的骨形成，並具有良好的生物降解性，即使在較大的缺損中，它似乎也完全被吸收並被新骨所取代[34-35]。目前的研究強調了nCS作為植骨替代品的潛在用途，並就如何製造能夠大量釋放Mel以促進骨細胞活力和骨分化的nCS/Mel支架提供了有見解的建議。

結論

總之，這篇論文提供了支持褪黑素對骨細胞活力和骨分化影響的劑量相關變異的證據。從nCS/Mel支架中釋放的Mel在48小時內仍具有生物活性。此外，與其他Mel負載支架不同;nCS不需要改變其表麵化學性質以支持Mel吸附。本文還對nCS的Mel負載能力及其釋放動力學進行了研究。總的來說，我們的研究結果表明，nCS可能是一種功能性載體，用於交付Mel的數量能夠增強骨缺損的骨形成。


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條信息

文章類型:研究文章

引用:Barone AW, Pringle M, Nguyen D, Dziak R(2020)褪黑素對人成骨細胞的劑量相關作用體外Via納米級硫酸鈣的控製釋放。國際口腔健康雜誌6(4):dx.doi.org/10.16966/2378-7090.325

版權:©2020 Barone AW, et al.。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可的條款發布，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是要注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2020年4月27日

  • 接受日期:2020年5月7日

  • 發表日期:2020年5月14日