牙科與口腔健康科學“，

全文

研究文章
從無齲和齲齒活躍個體中分離的菌斑菌發酵糖的最終pH值，經過頻繁的糖和尿素衝洗

海達爾哈桑貢納Dahlen＊Anette Carlen

瑞典哥德堡大學Sahlgrenska學院口腔微生物學與免疫學係

*通訊作者:Gunnar Dahlén，瑞典哥德堡大學Sahlgrenska學院口腔微生物和免疫學係，電話:+ 46-31-7863262;電子郵件:gunnar.dahlen@odontologi.gu.se


總結

本初步研究的目的是評估牙菌斑對酸性和堿性的適應可能會不同地影響牙釉質的假設在體外從無齲(CF)和有齲(CA)個體分離的耐酸菌斑細菌從糖中形成酸。從10個CF和10個CA個體中，分別在10%蔗糖和0.25%尿素溶液每日衝洗5次/天一周之前和之後，獲得了128株pH為5.2的細菌分離株。對分離株進行表型鑒定，並用於微量滴度板試驗，以評估蔗糖、葡萄糖、果糖和乳糖細菌發酵後的pH值< 5,5 -6和>6。在衝洗前後，非變形鏈球菌鏈球菌而且鏈球菌oralis為CF組的特征美國緩和的乳酸菌和乳酸菌在CA組最為常見。從糖到pH <5的分離物中形成酸的比例在糖漂洗後CF組中最大程度地增加，而在尿素漂洗後CA組中最大程度地減少(盡管沒有統計學意義)。這些發現符合一個普遍的觀點，即齲病活躍個體中的斑塊細菌適應酸性環境，因此在開始時比無齲個體具有更高的形成酸和保護性氨的能力。這種模式在四種糖中是一致的，但需要更高的統計冪來證明每種糖的統計顯著性。

關鍵字

酸形成;Supragingival斑塊;齲齒;尿素;糖;表型


簡介

齲齒是一種多因素疾病，由糖形成的細菌酸和ph中和堿的形成是調節牙齒生物膜生態係統[2]的重要因素。一個酸化超過堿化的不平衡生態係統可能會導致牙齒表麵的脫礦[3]。然而，通過唾液緩衝係統和口腔微生物[4]從尿素和精氨酸中產生堿(氨)可以恢複平衡。

據報道，與齲齒活動者相比，無齲齒患者的脲酶水平[5]和脲酶活性[3]高3倍，多項研究表明無齲齒患者的齦上斑塊ph值更高[5-7]。進一步認識到，較高的齲齒風險與口腔細菌[3]的低堿性生成能力有關。

幾個在體外研究表明，牙菌斑細菌可以適應低pH值，因為經常接觸糖[8]。的在活的有機體內斑塊細菌對酸性和堿性環境的適應性也有報道[6,9,10]。如果分別從有齲和無齲個體中分離出細菌，關於細菌對堿性的適應性及其對酸性和堿性環境的適應能力的發表信息很少。

在Hassan H等人的研究中，糖發酵對齦上菌斑pH值的影響在活的有機體內在無齲和有齲的個體中，分別用糖和尿素頻繁衝洗一周，觀察菌斑菌群對酸和堿的適應情況。對酸的適應對那些沒有齲齒(無齲齒)的斑塊ph值有最顯著的影響。對堿的適應導致齲齒患者(活動性齲齒)的斑塊ph值略有增加。

從該研究中假設，如果菌斑細菌分別從無齲和有齲的個體中分離出來，菌斑細菌在酸堿適應後形成酸的最終pH值會有所不同。這項初步研究的目的是評估(在體外)無齲個體和有齲個體的耐酸齦上菌斑細菌對糖發酵後最終pH值的適應。

材料與方法
菌株

該研究包括先前在pH為5.2的瓊脂板[11]上培養齦上近端斑塊樣本後獲得的共128株細菌分離株。菌斑樣本取自10個無齲(CF)和10個有齲(CA)的年輕個體(15-21歲)，分別在適應期前後一周，每日用10%蔗糖和0.25%尿素溶液衝洗5次/天。為了分離，分別收集不同形態的菌落，在血瓊脂上培養以控製純度，然後在-80°C的珠上保存。分離珠的分離物在血瓊脂上培養(血瓊脂底2號CM 271;Oxoid，貝辛斯托克，英國，5%去纖維馬血和0,5%乳酸鈉)，在90% N的氣氛中2和10% CO2分別在選擇性唾液炎(MS)瓊脂(Acumedia, Neogen Corp.， USA)、唾液炎杆菌(MSB)瓊脂[12]和Rogosa SL (RSL)瓊脂(Acumedia)上生長後，根據革蘭氏染色和特征菌落形態進行鑒定，以鑒定各種鏈球菌和乳酸菌。最終使用API係統(API 20 Strep, Biomerieux, Marcy l´Etoile, France)確認了鏈球菌分離株的物種鑒定。

在血瓊脂上培養過夜後，將菌落接種於腦心輸液湯(BHI, Acumedia)中進行發酵試驗。在對數階段收集細菌，以3500轉/分的速度離心5分鍾，並用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)衝洗兩次以消除培養基。用PBS稀釋洗淨的細菌，使其在分光光度計中測量的光密度(OD)為1 (650 nm)，對應於109個細胞/ml。

測試溶液和pH值指示器

發酵試驗中使用的糖是經過無菌過濾的2%蔗糖(Difco, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)、葡萄糖(Difco)、果糖(Merck, Darmstadt, Germany)和乳糖(Merck)的水溶液。使用的pH指示劑溴甲酚紫色(Svenska Finkemikalier，瑞典)是在0.3%的水溶液中製備的，根據製造商的說明，pH值<5.2時為黃色，pH值>6.8時為紫色。

發酵試驗

微量滴度板(96 MicroWell™plate unclon™;Nunc, Roskilde，丹麥)被用於試驗，其執行如前所述[13,14]。所有的糖都是重複測試的。在每孔中加入BHI肉湯50 μl、糖50 μl、菌液10 μl和指示物液10 μl。用PBS代替細菌懸液作為對照。用實驗室塑料箔覆蓋這些板，並在10% CO的氣氛中在36°C中培養2N + 90%2．在孵育24小時後拍攝並保存用於登記顏色的照片，以記錄在同一場合下所有測試的顏色變化。試驗由兩名不知道分離物類型、分離物來源(CA或CF)或試驗周期(適應酸/堿之前/之後)的審查員進行並單獨評估。還使用pH棒測試了代表不同顏色的孔，得出的結論是，可以清楚地識別代表pH區間<5(黃色)、5-6(黃色到紫色之間的顏色)和> -6(紫色)的顏色。

統計分析

采用SAS 9.1.3 (SAS Institute Inc, NC, USA)和Pearson 's Chi分析了適應前後組間細菌和組內糖酸形成差異的顯著性2以及。

結果

共分離出68株鏈球菌，37口鏈球菌4變形鏈球菌,3.鏈球菌肝病雜誌3唾液鏈球菌和13乳酸菌spp．被確定。非變形鏈球菌。美國緩和的而且美國oralis在CA和CF個體的嗜酸菌株中占主導地位，在128株菌株中分別占53%和29%(表1)。值得注意的是，這些鏈球菌不占主導地位的唯一情況是酸適應(AAA)後的CA組(14株菌株中有4株)。此外,乳酸菌在(BAA/ BBA)和(AAA/ABA)適應期前和(AAA/ABA)適應期後，僅在該組中發現了sp .;變異鏈球菌，年代肝病雜誌,唾液鏈球菌，則更加零星地分離出來。這一結果在CF和CA個體之間有顯著差異(p<0.05，適應酸前和適應酸後p<0.01)。

細菌種類 CF CA CF CA
BAA * (n = 20) AAA # (n = 20) BAA * (n = 20) AAA #
(n = 14)		 BBA *
(n = 19)		 阿壩
(n = 14)		 BBA *
(n = 10)		 阿壩
(n = 11)
Streptococcusmitis 10 8 10 4 10 11 7 8
Streptococcusoralis 10 12 3. 0 9 3. 0 0
Streptococcusmutans 0 0 2 1 0 0 1 0
Streptococcussanguinis 0 0 1 2 0 0 0 0
Streptococcussalivarius 0 0 0 3. 0 0 0 0
乳酸菌。 0 0 4 4 0 0 2 3.

表1:從無齲個體(CF)和有齲個體(CA)中分別獲得酸適應前(BAA)和堿適應後(AAA)、堿適應前(BBA)和堿適應後(ABA)菌株。
*表明酸堿適應前CF與CA個體分離菌種類型差異有統計學意義(p<0.05) (Chi2測試)。
#表明酸適應後CF與CA個體分離菌種類型差異有統計學意義(p<0.01) (Chi2測試)。

圖1顯示了CF和CA個體分別在(BAA)和(AAA)對蔗糖、葡萄糖、果糖和乳糖進行酸適應(圖1A和圖1B)之前(BAA)和(AAA)之後(圖1A和圖1B)能形成pH <5或pH - 6之間的酸的分離株的比例(%)。這種模式在所有糖中都是一致的，在兩組(CF和CA)中形成酸與pH <5的分離物的比例都增加了，在CF組中增加的程度最高，但對每種糖來說都不足以達到統計顯著性。在兩個適應期之前，CA組的比例高於CF組。在適應堿後，CF組在pH <5時蔗糖和葡萄糖的%分離物略有下降(圖1C)，而CA組則更為一致和清晰(圖1D)，盡管兩組中任何一種糖的%分離物都不明顯。由於使用了不可比較的單位(四種不同的糖)，兩組之間沒有進行統計分析。

圖1:糖發酵後不同pH區間< 5,5 -6和>6之間細菌分離株的分布(%)。
細菌分別從無齲(圖A)和有齲(圖B)個體中(BAA)和酸適應(AAA)前後分離，從無齲(圖C)和有齲(圖D)個體中(BBA)和堿適應(ABA)前後分離。由於使用了不可比較的單位(四種不同的糖)，無法在兩組之間進行統計分析。

討論

目前的單盲在體外研究評估了對酸堿的適應對耐酸斑塊菌在糖發酵後降低pH值能力的影響。在ph5瓊脂[11]上培養無齲(CF)和有齲(CA)年輕個體的菌斑樣本後，分離出細菌。

在適應酸堿前後，CF個體均以非變形鏈球菌為特征鏈球菌而且鏈球菌oralis，此前報道在酸性環境可控的無齲生物膜生態中經常發現[15,16]。CA組的特點是產酸和酸尿乳酸菌較多變形鏈球菌在酸性環境中茁壯成長的鏈球菌[17,18]。

在酸適應後，特別是CF組中形成酸到pH <5的菌株比例增加，這表明非突變型鏈球菌已經適應了新環境，變得更產酸。這與生態斑塊假說(ecological plaque hypothesis)相一致[16,17,19]，該假說認為糖的頻繁接觸可能會引發生物膜生態的轉變，有利於更多的產酸和酸尿表型的細菌。

酸適應對CA組的影響較小，pH <5時形成酸的菌株比例增加較少。相反，堿適應後形成酸到pH <5的菌株比例的降低在CA菌株中最為明顯。這些發現可能是由於與CF細菌相比，CA細菌具有更高的耐酸性以及更高的代謝尿素和產生氨的能力。因此，在適應期之前，CA分離株比CF分離株更容易形成酸和堿。這與CA組在兩個適應期之前從糖中分離出的酸的比例較高相吻合(圖1)。所有實驗組和所有糖的總體模式都是一致的(圖1A-1D)，盡管每種糖都沒有達到統計學意義。

在最初的研究[11]中，獲得細菌的個體數量太少，對於每一種測試的糖，兩組之間沒有統計上的顯著差異，這是本研究的一個局限性。

結果是在體外研究證實了在活的有機體內酸適應前後齦上近端斑塊ph值的變化。Stephan曲線顯示CF組比CA組[11]的ph值下降幅度更大。相反，CA組在堿適應後ph值增加在活的有機體內這證實了形成酸的細菌比例的下降，可以將pH值降低到<5在體外．

結論

總之，研究結果表明，在酸性適應後，無齲個體發酵糖的能力最大程度上提高了環境pH值(<5)，而在堿性適應後，有齲的個體發酵糖的能力下降了。

相互競爭的利益

任何作者都沒有潛在的利益衝突。作者單獨負責本文的內容和寫作。

倫理批準

之前的研究獲得了細菌分離物[11]，該研究得到了瑞典哥德堡大學倫理委員會的批準(Dnr 282-10)。

確認

我們感謝Fanny Bjondahl小姐和Richard Olofsson先生執行發酵程序，感謝Susanne Blomqvist夫人在微生物處理和分析方麵提供出色的技術援助和指導。


參考文獻

  1. Pitts NB, Zero DT, Marsh PD, Ekstrand K, Weintraub JA，等(2017)齲齒。Nat Rev Dis Primers 3:17030。［Ref。］
  2. 陳曉輝，陳曉輝，陳曉輝，等。(2014)精氨酸對口腔生物膜群落的影響。Mol口腔微生物29:45-54。［Ref。］
  3. 薩馬納亞克L，鬆原VH(2017)正常口腔菌群與口腔生態係統。登特診所北上午61:199-215。［Ref。］
  4. 高橋N(2015)口腔微生物組代謝:來自“他們是誰?”到“他們在做什麼?”《中華人民共和國學報》，第94卷第1628-1637頁。［Ref。］
  5. Aranibar Quiroz EM, Lingström P, Birkhed D(2003)短期蔗糖暴露對不同水平變形鏈球菌個體斑塊酸性和致齲菌群的影響。齲齒決議37:51-57。［Ref。］
  6. Lingström P, van Ruyven FO, van Houte J, Kent R(2000)牙菌斑pH值與早期牙釉質齲和牙菌斑菌群的關係。J Dent Res 79: 770-777。［Ref。］
  7. Appelgren L, Dahlén A, Eriksson C, Suksuart N, Dahlén G(2014)低齲人群兒童和成人牙菌斑pH值與溶尿活性的關係。齒科學報72:194-201。［Ref。］
  8. 謝曉明，楊曉明，楊曉明，Svensäter楊曉明(2017)口腔生物膜的耐酸性能研究在活的有機體內．BMC微生物17:165。［Ref。］
  9. Kilian M, Chapple IL, Hannig M, Marsh PD, me尿酸V等(2016)口腔微生物群——口腔保健專業人員的更新。Br Dent J 221: 657-666。［Ref。］
  10. 高橋，李誌剛，李誌剛(2016)牙本質與牙根齲的生態學研究。齲齒決議50:422-431。［Ref。］
  11. Hassan H, Lingström P, Carlén A(2015)無齲和有齲的年輕人頻繁用蔗糖和尿素溶液衝洗前後牙菌斑pH值。齲齒決議49:18-25。［Ref。］
  12. 金·奧格，喬丹·HV，範·豪特J (1973)變形鏈球菌．Arch口腔生物學18:1357-1364。［Ref。］
  13. Hasslöf P, Hedberg M, Twetman S, Stecksén-Blicks C(2010)商業益生菌乳酸菌對口腔變形鏈球菌和念珠菌的生長抑製作用——an在體外研究。BMC口腔健康10:18。［Ref。］
  14. Almståhl A, Rudbäck H, Basic A, Carlén A, Alstad T(2017)從糖和糖醇中產生酸的能力乳酸菌收集與放射治療有關的分離株。Arch口腔生物學84:82-88。［Ref。］
  15. 劉軍，王建軍，王立軍，王立軍(2013)牙菌斑菌群與疾病的關係。PLoS One 8: e58487。［Ref。］
  16. 高橋N, Nyvad B(2011)細菌在齲病過程中的作用:生態學視角。中國機械工程學報，27(4):344 - 344。［Ref。］
  17. 馬什PD(1994)牙菌斑的微生物生態學及其在健康和疾病中的意義。Adv Dent Res 8: 263-271。［Ref。］
  18. Kleinberg I(2002)一種混合細菌生態學方法來理解口腔細菌在齲齒病因中的作用:一種替代方法變形鏈球菌以及特定的空斑假說。重症重症口腔生物醫學13:108-125。［Ref。］
  19. Ten Cate JM(2006)生物膜，牙菌斑微生物學的一種新方法。中華口腔醫學雜誌94:1-9。［Ref。］

下載臨時PDF

PDF

條信息

文章類型:研究文章

引用:Hassan H, Dahlén G, Carlén A(2020)從無齲和齲活性個體中分離的菌斑細菌發酵糖後的最終pH值。國際口腔健康雜誌6(3):dx.doi.org/10.16966/2378-7090.319

版權:©2020 Hassan H, et al.。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可的條款發布，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是要注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2020年12月12日

  • 接受日期:2020年3月5日

  • 發表日期:2020年3月12日