摘要

背景:通過微穿孔膜的細胞遷移可能有助於管理牙周缺損與周圍再生元件的隔離，這是由使用閉塞膜引導組織再生引起的問題。膜的宏觀穿孔會影響其機械性能，並消除其作為牙齦上皮細胞和細胞外基質成分的屏障的作用。

材料與方法:將人牙齦間充質幹細胞(GMSCs)分別接種於現成孔徑為0.4和3微米的膠原包被聚四氟乙烯(PTFE)轉孔和現成孔徑為8微米的聚碳酸酯轉孔的上腔。下腔培養基中加入胎牛血清(FBS)與對照組為普通介質。下隔室計數遷移細胞。掃描電子顯微鏡成像的穿孔跨井膜的下表麵。

結果:人牙齦間充質幹細胞在FBS趨化組比對照組遷移更明顯。8微米穿孔膜組與3微米和0.4微米組相比，細胞遷移有統計學意義。掃描電子顯微鏡圖像證實細胞通過穿孔遷移。

結論:本研究結果表明，0.4、3和8微米的膜微穿孔是適合人類牙齦間充質幹細胞向趨化介質遷移的孔徑，並且在陰性對照中對細胞遷移具有閉塞性，不影響膜的力學性能或閉塞性，可用於開發具有選擇性細胞遷移能力的GTR膜。

關鍵字

導向組織膜;牙齦間充質幹細胞;牙周再生;引導組織再生;牙周袋

簡介

盡管牙周組織[1]具有固有的再生能力，但牙周器官的完全再生仍難以實現。常規牙周治療通常導致肉芽組織和長連接上皮的修複，這意味著功能的喪失[2]。

2009年Zhang等從人牙齦組織[3]中分離並鑒定了間充質幹細胞(MSCs)。Tomar等人比較了人類牙齦來源的間充質幹細胞(GMSCs)與骨髓來源的細胞，並證明了它們在許多方麵的優勢[4]。這種在牙齦結締組織中具有多能性的細胞的存在，促使引導組織再生(GTR)膜對其閉塞性進行必要的修飾，從而使牙周傷口不受這些細胞的影響[5]。

Mardas等[6]比較了帶有300微米穿孔的可滲透聚四氟乙烯膜膠囊中的骨形成，以控製含有脫礦冷凍幹燥異體骨移植物(DBM)的閉塞膜膠囊，其中在可滲透和閉塞膠囊中形成了相似數量的骨。研究人員得出結論，未分化間充質細胞侵入牙周傷口區域是不必要的。

臨床上，Gamal和Iacono[7-9]比較了傳統的閉塞性屏障膜與穿孔的膠原膜。兩種膜的囊袋深度均有統計學意義上的減少，臨床附著和臨床骨水平均有增加，穿孔膜組比閉塞膜組改善更大。

在不破壞膜閉塞性的情況下，有選擇性地允許間充質幹細胞通過GTR膜遷移的最佳穿孔直徑尚未被探索。在這項研究中，我們對三種穿孔直徑進行了實驗，其中兩種直徑之前從未對GMSCs通過穿孔膜的運動動力學進行過評估。

在Bhattacharya等人的一項研究中，口腔角質形成細胞顯示了通過8微米穿孔聚碳酸酯膜[10]遷移的能力。這些數據表明，穿孔大於8微米的膜可能允許牙齦上皮細胞侵入牙周缺損。

據我們所知，這項研究將是科學文獻中第一個證明GMSCs響應趨化劑通過孔徑小至3微米和0.4微米的孔徑遷移的能力，並證明在沒有趨化因子的情況下，8微米的穿孔膜對細胞遷移是閉塞的。這一發現揭示了使用合適的趨化劑使某些細胞係從周圍組織遷移到牙周缺損的可能性。

從這項研究中獲得的數據將用於開發GTR膜的功能，從僅僅是一個機械屏障，到更適合於組織工程的設備，用於細胞歸巢技術中的過濾細胞。

主要目的是研究GMSCs通過微直徑孔向趨化因子的遷移潛力與以普通培養基陰性對照為基礎，進一步研究利用不同的趨化因子吸引具有特定標記的特殊細胞株到牙周傷口。

材料與方法

采集人體牙齦組織樣本

取3例健康成年患者(34歲、30歲和43歲)的牙齦組織活檢(3 × 2 × 2mm)。健康的牙齦由上皮細胞和下麵的結締組織組成，在美國紐約長島石溪大學牙周護理診所的冠延長手術中收獲。

該研究於2014年10月8日由石溪大學和艾因沙姆斯大學的人體研究委員會批準，批準號為[575741-1]。經參與受試者口頭同意;他們被告知在幹細胞實驗室研究中使用他們丟棄的組織。

牙齦樣本被運送到紐約石溪大學的生物工程和幹細胞實驗室。根據Mitrano等人報道的培養技術，在富含10%胎牛血清(FBS)和1%青黴素/鏈黴素和兩性黴素的α-MEM中進行α-MEM。

牙齦間充質幹細胞的培養

牙齦組織樣本在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中衝洗多次，並使用手術刀片去除上皮細胞。結締組織標本被切片並使用大約1 × 2 mm的15號手術刀片切碎成小塊。將切碎的結締組織標本收集在10 mL試管中，然後用McCoy的改良培養基消化:在2 mg/mL的disase II (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)中在4℃過夜，然後在2 mg/mL的膠原酶IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)中在4℃[12]中消化40分鍾。通過添加含有10% FBS (Gibco, Invitrogen Life Technologies, MA, USA)的Dulbecco’s MEM培養基、青黴素/鏈黴素(G100單位/mL, 100µg/mL)和Amphotericin (Fungizone 0.25µg/mL)抑製消化反應。

消化後的組織通過40 μm細胞過濾器(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)過濾，獲得單細胞懸液，然後在10 mL試管中以1200 rpm / 200rpc離心10分鍾。將獲得的細胞球連續移液懸浮在培養基中，收集並以60個細胞/cm的濃度播種²在10cm組織培養皿中選擇單細胞來源的菌落，α-MEM 1X (Gibco, Invitrogen Life Technologies)，添加10% FBS (Hyclone Laboratories, Inc.， Logan, UT, USA)， 50 U/ml青黴素G和50 μg/ml鏈黴素，2.5 μg/ml兩性黴素B (Fungizone)，在37°C, 5% CO的潮濕氣氛中₂．24小時後，清洗細胞，然後加入新鮮培養基;每3天飼喂一次細胞，直至實驗結束。

牙齦間充質幹細胞的傳代培養

牙齦間充質幹細胞在細胞增殖過程中的監測;當原代細胞培養達到90%合流時進行傳代，標記為傳代0，隨後傳代進行相應標記。

種群加倍試驗

采用種群加倍試驗[13]評價細胞增殖能力;GMSCs按5 × 10播種^3.細胞/厘米²在24孔板中，膨脹至約90%合流，用0.05%胰蛋白酶/EDTA分離;然後計數細胞。GMSCs以5 × 10補種^3.細胞/厘米²在24孔板的另一個孔中培養，直到細胞達到體外衰老。在每個傳代中進行細胞計數，並使用以下公式計算種群加倍:log₂最終單元格號/log₂播種細胞數。

GMSCs的最終群體倍增值表示為連續三個傳代中每個傳代獲得的群體倍增值之和。

GMSC的塑性粘附、菌落形成能力和表麵標記的表達

倒置光鏡下觀察五代牙齦間充質幹細胞(GMSCs)，細胞聚集，集落大於50個。對細胞形狀和測量進行了形態計量學分析，其中第一個單細胞在4天後顯示出塑料粘附，7天後顯示出不規則的紡錘形，如成纖維細胞形態。

菌落形成單元實驗，重複[14]3次。新鮮消化的牙齦組織以每盤1000個細胞的數量在P10板中接種，在含有10% FBS的α-MEM中培養，並補充在潮濕的氣氛中(37°C, 5% CO₂)．培養基每周更換兩次。14 d後，用PBS衝洗菌落兩次，4%多聚甲醛溶液固定，蘇木精和伊紅染色計數菌落。

牙齦間充質幹細胞的表型鑒定

大約1 × 10⁵分別用2 μg/ml異硫氰酸熒光素- (FITC-)標記的人CD73及其同型小鼠單克隆抗體、同種藻藍蛋白- (APC-)標記的CD90及其同型小鼠單克隆抗體、藻紅素- (PE-)標記的CD146及其同型小鼠單克隆抗體(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)和Alexa 555山羊抗小鼠單抗(DAKO, Carpinteria, CA, USA)孵育細胞;對照組為Alexa 555山羊抗小鼠，不含小鼠一級抗體。使用造血幹細胞標記物和小鼠單克隆抗體對抗CD14、CD34和CD45 (eBioscience, San Diego, CA, USA)在4°C中半小時。細胞經過兩次離心和重懸洗滌後，在美國紐約石溪大學醫院使用BD LSRFortessa細胞分析儀(BD Biosciences)對細胞進行流式細胞術分析。

在體外GMSCs的分化能力

以8 × 10的劑量接種牙齦間充質幹細胞(GMSCs)^3.每厘米細胞數²在六孔板中，並在成骨培養基[15]、成脂培養基[16]和成軟骨培養基中培養(Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。在28天內，每周更換兩次培養基;PBS洗孔兩次，4%多聚甲醛固定細胞。礦物沉積通過2%茜素紅、油滴油紅O和軟骨糖蛋白阿利新藍(西格瑪化學公司，聖路易斯，密蘇裏州，美國)孵卵進行鑒定。

MTT細胞增殖試驗

細胞在分光光度計管中接種500 μ l α-MEM (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，富集10%胎牛血清(Hyclone Laboratories, Inc.， Logan, UT, USA)。對照組采用無細胞培養基。試管用100 μ l MTT試劑(Trevigen Inc.， Gaithersburg, MD, USA)在37℃下孵育4小時，直到紫色晶體析出;然後抽吸介質，每管中加入1000 μ l DMSO使甲醛染料溶解。最後，用分光光度計在595 nm波長處用吸光度法定量MTT對甲馬甲的還原程度，其與標本內活細胞數量成正比;這個實驗一式三份。MTT評分由對照讀數減去GMSCs MTT染色的分光光度計讀數計算。

牙齦間充質幹細胞Transwell遷移實驗

在跨孔趨化室[17]中進行細胞遷移實驗，將細胞分為三組。第一組包括穿孔聚碳酸酯膜，孔徑為8微米(6.5毫米直徑;康寧生命科學，康寧，紐約，美國)。第二組和第三組包括穿孔的膠原塗層聚四氟乙烯膜(直徑12毫米;Corning Life Sciences, Corning, NY, USA)，孔徑為3 μ m和0.4 μ m，作為12孔聚苯乙烯板的嵌件。用含0.05%胰蛋白酶/EDTA的PBS收集細胞，再懸浮於無血清α MEM中。在上腔的transwell插入物中裝入10,000個無血清α-MEM細胞;下腔含量因各組類型而異:在對照組中，下腔使用無fbs的α-MEM，在趨化性組中沒有趨化因子，α-MEM補充10%胎牛血清(Hyclone Laboratories, Inc.， Logan, UT, USA)作為趨化因子。在插入板上培養的細胞在37°C, 5% CO的潮濕氣氛中培養₂)二十四小時;然後吸氣上下腔的培養基，用PBS清洗插入物兩次，用棉簽去除膜上部的細胞。遷移到下側的細胞用4%多聚甲醛(PFA)固定2分鍾，用PBS洗滌兩次，100%甲醇滲透20分鍾，用80%乙醇中1%結晶紫染色(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)，再用PBS洗滌兩次。

剪斷跨孔膜從嵌件上取下，用筆在膜的下側做標記以作識別，每組共6張膜。在5個不同的代表性視野下，使用40倍放大的倒置光學顯微鏡對遷移細胞進行計數，並計算每個插入的平均值進行統計分析;這個實驗一式三份。

微穿孔膜的掃描電子顯微鏡

膜通過浸泡脫水，每個10分鍾，連續稀釋乙醇:50,70,80,90和100%。然後在一個封閉的盒子裏-80°C孵育過夜，塗上飛濺的黃金(SPI-Module;結構探針公司，西切斯特，PA，美國)，最後在石溪大學工程學院掃描電子顯微鏡檢查。

統計分析

采用頻率表和直方圖檢查收集數據的正態性;采用Shapiro-Wilk檢驗和Kolmogorov-Smirnov檢驗計算平均值、中位數和標準差。對正態分布數據采用t檢驗、方差分析、Tukey事後檢驗，對非參數數據采用Kruskal-Wallis檢驗、Mann-Whitney檢驗並進行Bonferroni校正。使用SPSS version 22 for Windows (IBM Corp.， Armonk, NY, USA)設置顯著性水平atp≤0.05。

結果

菌落形成單位測定

表1顯示了3個實驗的GMSCs菌落的均值和標準差，在P10培養皿中培養14天後，呈典型的成纖維細胞形態在體外培養。

偏差類型	實驗1	實驗2	實驗3
SD	8	5	3.
的意思是	17	11	22

表1:菌落形成單元實驗的均值和標準差。

種群加倍試驗

表2顯示了3個實驗的GMSCs增殖能力，表現出較高的分裂性，3個實驗的數值接近。

實驗	通道1	通道2	通過3	總計
實驗1	1.807	1.541	1.328	4.676
實驗2	1.417	1.449	1.439	4.305
實驗3	1.391	1.351	1.369	4.111

表2:三次實驗的種群加倍測定結果和每次實驗的總測定結果。

流式細胞儀檢測msc標記物的表達

流式細胞術分析了第5代牙齦組織培養細胞的特征。圖1為表達標記物的熒光強度;CD105-Alexa 555為99%，CD73- FITC為98.1%，CD90-APC為99.9%，CD 146-PE為17.2%，對間充質幹細胞的3個主要標誌物表現出非常高的信號，而細胞缺乏造血標誌物CD14、CD34和CD45的表達。

圖1:使用GMSC表麵標記物的流式細胞儀顯示熒光強度的a圖。
b -菌落形成單位檢測的代表圖像。

在體外多譜係分化能力

茜素紅染色細胞顯示染色的鈣沉積為橙紅色聚集物。用阿利新藍染色在成軟骨培養基中培養的細胞顯示成軟骨糖蛋白為藍色，用油紅染色在成脂肪培養基中培養的細胞顯示細胞內有紅色的油滴。使用相同的染色劑和在常規培養基中培養的相似細胞係，沒有檢測到細胞分化沉積的跡象。圖1顯示了在分化培養基中培養的細胞的代表性圖像及其相應的陰性對照。

MTT試驗

表3顯示了GMSCs在第5段與普通培養基的分光光度計讀數，三個實驗的得分之間沒有顯著差異。

實驗	業務	控製	麻省理工
實驗1	2.604	0.951	1.653
實驗2	2.345	0.943	1.402
實驗3	2.404	1.291	1.113

表3:三次實驗中GMSCs MTT染色與普通培養基的分光光度計評分比較。

GMSCs通過顯微穿孔膜遷移

8微米穿孔聚碳酸酯膜:表4展示了GMSCs遷移到FBS化學吸引介質的總平均值與平媒陰性對照，24小時後孵育，在三次實驗中。數據呈非參數分布，采用Mann-Whitney檢驗進行統計分析，差異具有高度顯著性(p<0.001)。

8微米聚碳酸酯
實驗	的邊後衛化學引誘物	控製
實驗1	21.8	0.6
實驗2	21	0.2
實驗3	19.4	1．8

表4:每8微米穿孔膜的平均遷移細胞計數值。

0.4微米和3微米穿孔膠原膜:表5和表6展示了GMSCs作為趨化劑遷移到FBS的總平均值與以普通培養基為陰性對照，孵育24小時後，分別通過3 μ m和0.4 μ m孔徑進行了三次實驗。數據呈非參數分布，采用Mann-Whitney檢驗進行統計分析，差異有統計學意義(p<0.05)，如圖2、表5、6所示。

圖2:成骨誘導培養基中GMSCs鈣沉積的a -茜素紅染色
b .在α-MEM和10% FBS中培養的GMSCs的同一染色，顯示無鈣沉積。
C-Oil在成脂分化培養基中培養的GMSCs內油滴的紅色染色。
d -在含10% FBS的α-MEM中培養的GMSCs同樣染色，無油滴。
在軟骨誘導培養基中培養的GMSCs E-Alcian Blue染色，可見軟骨糖蛋白的藍色染色。
f -同樣的GMSCs染色在含10% FBS的α-MEM中培養，未見軟骨糖蛋白。

3微米膠原塗層聚四氟乙烯
實驗	的邊後衛化學引誘物	控製
實驗1	5	0.4
實驗2	7.4	0.6
實驗3	3.8	1．8

表5:每3µm穿孔膜的平均遷移細胞計數值。

0.4微米膠原塗層聚四氟乙烯
實驗	的邊後衛化學引誘物	控製
實驗1	1．8	0
實驗2	1	0.2
實驗3	1．8	0.2

表6:每0.4微米穿孔膜的平均遷移細胞計數值。

直徑8µm穿孔膜組細胞遷移值最高，直徑3µm穿孔膜組次之，直徑0.4µm穿孔膜組細胞遷移值最小。數據呈非參數分布，通過Mann-Whitney檢驗比較三個趨化實驗組的遷移細胞計數，除第一組(孔徑8µm)與第三組(孔徑0.4µm)差異顯著外，第一組與第二組、第二組與第三組間遷移細胞計數差異均有統計學意義，見表7和圖3。

圖3:a晶紫染的GMSCs通過3µm直徑的膠原膜穿孔遷移，FBS趨化組，10X，比尺:100µm。
b -穿孔膠原膜結晶紫染色，陰性對照組，未見細胞遷移。
C-Crystal紫色染色的GMSCs通過直徑0.4µm的穿孔膠原膜、FBS趨化組和10X遷移，比尺:100µm。
d - C圖更高的放大倍率，顯示單個幹細胞經結晶紫染色通過0.4µm孔徑遷移，40X，比例尺:20µm。
計數細胞遷移到3 μ m穿孔膠原蛋白塗層膜的下隔室的e樣本圖像。

直徑	的邊後衛化學引誘物	控製	意義
聚碳酸酯(8µm)	20.7 * *	0.8	p≤0.001
膠原蛋白塗層聚四氟乙烯(3µm)	5.3 * *	0.93	p≤0.001
膠原蛋白塗層聚四氟乙烯(0.4µm)	1.53 *	0.4	p≤0.05

表7:通過8、3和0.4 μ m穿孔膜的平均遷移細胞計數的比較及其意義。
*差異有統計學意義。
*差異有統計學意義。

掃描電子顯微鏡

所有實驗的掃描電鏡分析顯示，多麵體成纖維細胞形態與長細胞質擴展的GMSCs通過穿孔膜遷移。在直徑為0.4µm的穿孔膠原塗層PTFE膜中，遷移細胞的數量非常有限，其中一張圖像中隻能看到遷移細胞的尖端(圖4)，這證明細胞實際上是通過膜而不是通過任何其他方式。

圖4:比較GMSCs通過不同微穿孔膜遷移的柱狀圖(藍色:FBS趨化組;橙色:陰性對照組;0.4u Col: 0.4µm孔徑，穿孔膠原包被膜;3u Col:孔徑3µm，穿孔膠原蛋白包被膜;8u PC:孔徑8µm，穿孔聚碳酸酯膜)。

通過聚碳酸酯膜的GMSCs看起來形狀更平坦，並分布在膜表麵;相反，通過膠原蛋白塗層的PTFE膜的細胞看起來更像球根狀，並且被限製在膠原蛋白鏈中。這表明，在細胞遷移的不同材料上，GMSCs的形態看起來是不同的，圖5。

圖5:圖A至C為穿孔的膠原包被膜下表麵0.4µm孔徑的掃描電鏡，GMSCs在膜膠原鏈中遷移，FBS趨化組。圖D - F顯示穿孔後膠原包被膜下表麵孔徑為3µm的掃描電鏡，GMSCs通過膠原鏈遷移，FBS趨化組。圖G至I為8微米多孔聚碳酸酯膜下表麵的SEM, FBS趨化組;我們可以注意到GMSCs通過毛孔遷移(箭頭)。

討論與結論

由於多能細胞數量和血管供應有限，臨界大小的牙周骨缺損再生能力下降;這導致其被更具增殖性的組織如牙齦上皮或高血管結締組織[18]侵襲。GTR的目的是阻止牙齦上皮和結締組織沿牙槽壁遷移，為血凝塊的穩定創造空間，讓具有再生能力的牙周韌帶細胞入侵，實現牙周組織再生[18]。

穿孔GTR膜的概念最早由Reddi等人在1987年[19]提出，脫礦骨異體移植物通過其骨形態發生蛋白，通過趨化作用刺激未分化間充質細胞的遷移，並促進其增殖和分化為成軟骨細胞，然後是成骨細胞。提示在GTR中使用閉塞性屏障膜可能會阻止未分化的間充質細胞從附近組織遷移到屏障保護區域，從而降低脫礦骨基質(DMB)[19]的骨誘導作用。

在Mardas等人的一項研究中，認為其結果的主要原因是DBM對間充質幹細胞具有化學引誘性的假設，但缺乏足夠的證據，此外DBM的孔徑過大，對成體幹細胞無選擇性;此外，作者沒有解釋骨細胞如何通過閉塞囊[6]侵入DBM移植物。

Gamal等人最近的一項研究建議孔徑為0.2、0.4和0.7 mm。他們對成纖維細胞和GMSCs的混合細胞群進行了遷移實驗;通過掃描電鏡，他們報告了Matrigel®Matrix (Cornig Scientific)通過宏觀穿孔膜的擠壓。在他們的研究中沒有陰性對照。

在目前的研究中，一個試點在體外實驗以FBS為趨化劑，通過宏觀穿孔(400 μ m、700 μ m和1 mm孔徑)transwell模型測試GMSCs的遷移與普通介質作為陰性對照。膜失去了屏障作用，實驗開始一小時後，由於重力作用，上腔的細胞全部下沉到下腔的底部，趨化組和陰性對照組均未發現附著在膠原膜上的細胞，這可以解釋為什麼Gamal等人最近的研究沒有陰性對照組。

SEM分析表明，GMSCs從不同直徑的膜孔中擠出。在趨化劑組中，GMSCs具有成纖維細胞樣形態，細胞質過程在膜孔內延伸;另一方麵，陰性對照實驗的下隔室沒有細胞遷移的跡象，這證明在沒有趨化劑的情況下細胞膜對細胞是閉塞的。

比較本研究中使用的兩種膜材料上的細胞形態，可以檢測到細胞形態特征的差異。聚碳酸酯膜上的GMSCs形態較平，偽足較多，部分偽足細長，而膠原膜上的GMSCs表麵較粗糙，趨於膠原鏈形狀。

在本研究的範圍內，我們可以得出結論，直徑為0.4、3和8微米的微穿孔膜適用於GMSCs的遷移，可以使用合適的趨化劑用於細胞歸巢技術，而不會降低膜對不需要的細胞的屏障效應或影響膜的機械性能。需要更多的研究來測試不同的趨化劑來吸引混合細胞群中的某些細胞係。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Al Bahrawy M, Gamal A, Ghaffar KA, Iacono V (2018)在體外牙齦間充質幹細胞通過微穿孔膜的遷移動力學。國際口腔健康雜誌4(4):dx.doi.org/10.16966/2378-7090.272

版權:©2018 Al Bahrawy M, et Al。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可的條款發布，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是要注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2018年9月14日

接受日期:2018年9月28日

發表日期:2018年10月4日