文摘

背景:放線菌是其中一個主要屬口腔。口腔放線菌種類發揮核心作用在生物膜形成的初始階段牙齒;然而,目前市麵上的有限的信息個別物種的分布在不同的網站或臨床條件。此外,一個合適的方法尚未被開發來識別口腔放線菌種類,因為這些微生物表型和基因之間的相似性。

摘要目的:放線菌naeslundii, a . odontolyticus a .口的a . georgiae a . gerencseriae a . graevenitzii a . dentalis a . johnsonii israelii,答:meyeri在屬放線菌被視為正常的人類口腔嗎放線菌物種。本研究的目的是設計引物來確定口服放線菌使用多重PCR的物種。

方法:聚合酶鏈反應(PCR)引物設計基於16 s rDNA基因的部分序列代表的口腔放線菌物種。的16 s rDNA基因代表口頭放線菌物種從DNA數據獲得央行(Bank of Japan),並進行多重序列比對分析CLUSTAL W項目。引物選擇口服之間的同源性放線菌物種和它們各自的16 s rRNA序列證實了爆炸搜索。

結果:這些引物能夠區分口服放線菌物種和不顯示大口腔細菌或其他代表放線菌物種。此外,我們開發了一個多重PCR方法識別和區分口語的能力放線菌物種(例如,a . naeslundii a . johnsonii a .口的a . odontolyticus a . israelii a . georgiae a . dentalis a . graevenitzii a . gerencseriae和答:meyeri)隻使用兩個PCR每個樣品管。

結論:目前的結果表明,我們的多路複用與這些引物PCR方法有助於識別代表口頭放線菌物種。這種方法很容易,因為使用強大的Amp DNA聚合酶Ver.2(豆類)意味著DNA提取可能避免,和物種識別使用這種方法隻需要大約2個小時。因此,文中所述方法將允許口頭的患病率放線菌物種及其參與口腔感染完全澄清了在未來的研究。

關鍵字

屬放線菌;多重PCR;口腔;16 s rDNA

介紹

盡管屬放線菌已經描述了在1919年,許多新物種最近被發現了。屬放線菌目前包括47種2亞種(http://www.bacterio.net/actinomyces.html)。放線菌由革蘭氏陽性、厭氧、耐氧的non-spore-forming, non-motile多形性棒與不同程度的分支。放線菌物種經常發現作為正常的微生態成員,尤其是人類的口腔;然而,他們也在感染病因代理人,如古典放線菌病,人類咬的傷口和膿腫在不同的身體部位,眼部感染,口腔、生殖器,尿路感染[1,2]。這些微生物在臨床標本的檢測非常重要,因為它可能會影響病人的預後和管理;然而,困難與傳統生化鑒定方法相關聯。

十個物種(例如,放線菌naeslundii, a . odontolyticus a .口的a . georgiae a . gerencseriae a . graevenitzii a . dentalis a . johnsonii israelii,答:meyeri在放線菌屬)被視為正常的人類口腔細菌[3]。他們分布在不同的口語網站和他們的角色在常見的口腔疾病,特別是牙周疾病,仍然是有爭議的。先前的研究在無菌的成功誘導破壞性牙周炎齧齒類動物答:naeslundii[4],暗示這些生物在牙周疾病的潛在作用。然而,這些微生物在高水平的不活躍的病變也被報道[5]。最近的研究顯示放線菌在超越物種非常普遍和sub-gingival斑塊在成人牙周炎[6]和牙齦炎[7]。因此,數據的作用放線菌物種在牙周疾病是模棱兩可的。除了牙周疾病,這些微生物與根麵齲的發病機製和難治性根尖周的放射菌病[8]。因此,這些微生物的精確檢測和物種形成是澄清的潛在致病的先決條件和可能的治療幹預措施對上述疾病實體。

準確的識別和枚舉放線菌物種需要為了澄清他們的角色在口腔生態和牙科疾病。盡管傳統生化檢測,用於識別放線菌物種,它們通常不精確由於表型變化顯示這些細菌。盡管幾個目標基因的序列分析是最可靠的方法,它是昂貴的,費力、耗時。因此,一個簡單的和更可靠的檢驗鑒定口服放線菌物種需要。本研究的目的是設計引物對口語的識別放線菌使用多重PCR的物種。

材料和方法

菌株和文化條件

下麵的菌株是本研究中使用:答:naeslundii寫明ATCC 12104,答:口的寫明ATCC 27044,答:johnsoniiJCM·16129答:odontolyticus寫明ATCC 17929,答:israelii寫明ATCC 12102,答:georgiaeDSM 6843,答:dentalisDSM 19115,答:graevenitziiDSM 15540,答:gerencseriaeJCM·12963答:meyeri寫明ATCC 35568,答:viscosus寫明ATCC 15987,鏈球菌oralis寫明ATCC 10557,唾液鏈球菌JCM·5707美國anginosus寫明ATCC 11391,變異鏈球菌國家反恐怖主義中心的10449年,美國sobrinus寫明ATCC 33478,羅氏菌屬dentocariosaJCM·3067羅氏菌屬mucilaginosaJCM·10910棒狀杆菌屬matruchotii寫明ATCC 14266,c .硬質寫明ATCC 33449,奈瑟氏菌屬新鑄的盧比寫明ATCC 29256,Aggregatibacter actinomycetemcomitans寫明ATCC 33384,金黃色葡萄球菌JCM 2874,美國epidermidis寫明ATCC 2414。這些菌株被維護,培養他們在腦心浸液瓊脂(BHI;Difco實驗室、底特律,密歇根州)補充酵母提取物(BHIY)為1%。細菌培養在BHIY肉湯37°C 24 h在厭氧條件下(85% N₂,10% H₂,5%的公司₂)放線菌屬的成員和其他大氣二氧化碳5%代表口腔細菌。

種特異的引物設計十口服放線菌物種

在目前的研究中,十口放線菌物種分為兩組進行多重PCR方法。A組包括a . naeslundii a . johnsonii a .口的a . odontolyticus和a . israelii和B組組成a . georgiae a . dentalis a . graevenitzii a . gerencseriae和答:meyeri。細菌細胞在BHIY肉湯培養24小時,和1 ml樣品被收集在微型離心管和resuspended密度1.0麥克法蘭標準(大約107 colonyforming單位(CFU) /毫升)在1毫升無菌蒸餾水。總共3.6μl暫停然後用作PCR模板。PCR的檢測極限是評估連續稀釋已知數量的細菌細胞在無菌蒸餾水,然後讓每個懸浮聚合酶鏈反應。每個引物的複合PCR混合物包含0.2μM每組,2×10μl強大的Amp緩衝Ver.2(豆類生物有限公司、誌賀、日本),0.4μl強大的Amp DNA聚合酶(豆類)和5μl模板的最後一卷20μl。DNA進行PCR反應的熱循環(應用生物係統公司2720熱循環;美國應用生物係統公司,CA)。PCR條件包括初始變性在98°C 2分鍾步,緊隨其後的是30個循環組成的98°C 10年代和70°C 1分鍾。PCR產品2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析可視化的電泳前1×Tris-borate-EDTA 2%瓊脂糖凝膠與溴化乙錠染色。100 - bp DNA梯(豆類生物醫學、誌賀、日本)作為分子標記大小。

結果引物設計

二十個特定引物覆蓋上遊地區的16 s rDNA序列口服放線菌物種屬於組A和B在本研究設計(圖1、2)。的具體正向引物組被指定為MAJF答:johnsonii,MAORF答:口的,MANF答:naeslundii,MAODF答:odontolyticus,MAIFA.israelii,而具體的反向引物被指定為MAJR答:johnsonii,MAORR答:口的,MANR答:naeslundii,MAODR答:odontolyticus,其餘的答:israelii。的擴增子尺寸a . johnsonii a .口的a . naeslundii odontolyticus,答:israelii是136個基點,294個基點,413個基點,622個基點和907個基點。B組的具體正向引物被指定為年齡答:georgiae,ADF答:dentalis,AGERF答:gerencseriae,AGRF答:graevenitzii,AMF答:meyeri,而具體的反向引物被指定為AGEOR答:georgiae,美國存托憑證答:dentalis,AGERR答:gerencseriae,AGRR答:graevenitzii,AMR答:meyeri。的擴增子尺寸a . georgiae a . dentalis a . gerencseriae graevenitzi我和答:meyeri是328個基點,464個基點,583個基點,837個基點和942個基點。

圖1:位置和序列特異性引物的16 s rDNA A組口腔放線菌種類。每個引物的核苷酸序列已被強調。

圖2:種特異性引物的位置和序列16 s rDNA B組口服放線菌物種。每個引物的核苷酸序列已被強調。

多重聚合酶鏈反應

檢出限:我們的多重PCR方法識別口腔放線菌物種成功放大預期大小為每個物種的DNA片段(圖3,圖4)。檢出限是評估在滴定細菌細胞的存在,與PCR檢測的敏感性5×10³和5×10⁵CFU / PCR模板(3.6μl)答:johnsonii16129年與應變JCM特殊引物組,答:口的寫明ATCC 27044年,特殊引物組與應變答:naeslundii寫明ATCC 12104年,特殊引物組與應變答:odontolyticus寫明ATCC 17929年,特殊引物組與應變答:israelii寫明ATCC 12102年,特殊引物組與應變答:georgiae6843年特殊引物組與應變DSM答:dentalis19115年特殊引物組與應變DSM答:gerencseriae12963年與應變JCM特殊引物組,答:graevenitzii特殊引物組應變DSM 15540,答:meyeri特殊引物組應變寫明ATCC 35568(數據未顯示)。

圖3:多重PCR試驗檢測A組口服放線菌物種。
引物混合物包含MAJF, MAJR、MAORF MAORR, MANF, MANR, MAODF, MAODR MAIF,其餘的。
道:1,答:johnsoniiJCM 16129;2,答:口的寫明ATCC 27044;3,答:naeslundii寫明ATCC 12104;4,答:odontolyticus寫明ATCC 17929;5,答:israelii寫明ATCC 12102;6,答:georgiaeDSM 6843;7,答:dentalisDSM 19115;8日,答:gerencseriaeJCM 12963;9日,答:graevenitziiDSM 15540;10日,答:meyeri寫明ATCC 35568;11日,答:viscosus寫明ATCC 15987;12日,鏈球菌oralis寫明ATCC 10557;13日,唾液鏈球菌JCM 5707;14日,美國anginosus寫明ATCC 11391;15日,變異鏈球菌國家反恐怖主義中心的10449;16日,美國sobrinus寫明ATCC 33478;17日,羅氏菌屬dentocariosaJCM 3067;18日,r . mucilaginosaJCM 10910;19日,棒狀杆菌屬matruchotii寫明ATCC 14266;20.c .硬質寫明ATCC 33449;21日,奈瑟氏菌屬新鑄的盧比寫明ATCC 29256;22日,Aggregatibacter actinomycetemcomitans寫明ATCC 33384;23日,金黃色葡萄球菌JCM 28744;24日,美國epidermidis寫明ATCC 2414。米,分子大小標記(100 - bp DNA梯)。

圖4:多重PCR試驗檢測B組口服放線菌物種。
引物混合物包含年齡,AGEOR、ADF、ADR, AGERF, AGERR, AGRF, AGRR, AMF, AMR。
道:1,答:johnsoniiJCM 16129;2,答:口的寫明ATCC 27044;3,答:naeslundii寫明ATCC 12104;4,答:odontolyticus寫明ATCC 17929;5,答:israelii寫明ATCC 12102;6,答:georgiaeDSM 6843;7,答:dentalisDSM 19115;8日,答:gerencseriaeJCM 12963;9日,答:graevenitziiDSM 15540;10日,答:meyeri寫明ATCC 35568;11日,答:viscosus寫明ATCC 15987;12日,鏈球菌oralis寫明ATCC 10557;13日,唾液鏈球菌JCM 5707;14日,美國anginosus寫明ATCC 11391;15日,變異鏈球菌國家反恐怖主義中心的10449;16日,美國sobrinus寫明ATCC 33478;17日,羅氏菌屬dentocariosaJCM 3067;18日,r . mucilaginosaJCM 10910;19日,棒狀杆菌屬matruchotii寫明ATCC 14266;20.c .硬質寫明ATCC 33449;21日,奈瑟氏菌屬新鑄的盧比寫明ATCC 29256;22日,Aggregatibacter actinomycetemcomitans寫明ATCC 33384;23日,金黃色葡萄球菌JCM 28744;24日,美國epidermidis寫明ATCC 2414。米,分子大小標記(100 - bp DNA梯)。

代表口腔細菌的鑒定:作為代表口腔細菌,一些棒狀杆菌,鏈球菌羅氏菌屬,腦膜炎,Aggregatibacter,葡萄球菌受到使用設計PCR引物。然而,沒有產生任何的擴增子代表口腔細菌(圖3,圖4)。

討論和結論

放線菌是其中一個主要屬口腔。2個月時,嬰兒已經殖民的三分之一放線菌[9]。放線菌物種發揮核心作用在生物膜形成的初始階段牙齒(即。,dental plaque) both above (supragingival) and below (subgingival) the gum line [10]. Ten species (i.e.,a . naeslundii a . odontolyticus a .口的a . georgiae a . gerencseriae a . graevenitzii a . dentalis a . johnsonii israelii,答:meyeri)屬放線菌被視為正常的人類口腔細菌[3]。

放線菌物種主要是與cervicofacial放射菌病、口腔或腦膿腫、齲齒、根管感染和牙周炎(11 - 13)。這些微生物似乎比預期發揮更重要作用的發病機理中放射性骨壞死,bisphosphonaterelated骨壞死的下巴(14 - 16),並可能導致致命的感染如縱隔炎[17]。因此,快速和可靠的識別方法對這些微生物已經變得越來越重要。

的分離和鑒定放線菌使用傳統的方法往往是困難和耗時。為了描述使用先前的研究進行了表型(18 - 20)和分子(21、22)方法。大多數可用的商業標識包不包括大多數的新物種的數據庫。

PCR方法是一種分子技術,允許物種驗證在基因水平,並具有高靈敏度和特異性細菌物種。它也是有用的探測和識別的真菌[23]。此外,它可以有效地、準確地檢測特定的微生物在臨床樣本,無論他們是活著還是死了。同樣,它可能是一個創新的方法檢測微生物難以使用傳統微生物技術文化。細菌基因組的16 s rDNA地區提供了一個理想的目標物種識別使用PCR [16]。此外,複合pcr是一種快速的工具,允許同時放大的多個目標DNA序列在一個單一的反應,從而節省時間和試劑[24]。另一方麵,Hirotaki等。[25],我們(26、27)開發出複合pcr,它允許一個序列的擴增DNA的目標在一個包含複數種特異的引物反應,細菌物種鑒定。之前的研究使用不同的分子鑒別和區分方法放線菌從口腔樣本後厭氧培養,包括PCR-RFLP染色體DNA指紋圖譜,16 s rRNA基因測序並使用通用引物或oligonucletide oligonucleotide-DNA雜交探針[13 - 30]。田等人報道迅速和敏感PCR-dipstick DNA色譜分析可以通過眼睛閱讀的多路複用和半定量分析牙菌斑細菌包括放線菌物種[31]。

在網上方法有助於在設計引物,有各種各樣的程序可用於PCR引物設計[32]。在目前的研究中,我們已經提到意味著設計特異性引物,對口語的識別放線菌物種使用PCR方法。這些引物能夠區分口服放線菌物種和不顯示大口腔細菌或其他代表放線菌物種。此外,我們開發了一個多重PCR方法識別和區分口語的能力放線菌物種(例如,a . naeslundii a . johnsonii a .口的a . odontolyticus a . israelii a . georgiae a . dentalis a . graevenitzii gerencseriae,答:meyeri)隻使用兩個PCR每個樣品管。

我們的多重PCR方法是很容易的,因為使用強大的Amp DNA聚合酶Ver.2(豆類)意味著DNA提取可能避免,和物種識別使用這種方法隻需要大約2個小時。因此,文中所述方法將允許口頭的患病率放線菌物種及其參與口腔感染完全澄清了在未來的研究。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:小林T, Uchibori年代,Tsuzukibashi O, Uezato C, Goto H, et al。(2018)引物設計的十大口腔放線菌物種使用多重PCR的識別。Int J影響口腔健康4 (1):dx.doi.org/10.16966/2378 - 7090.249

版權:小林©2018 T,等。這是一個開放分布式根據條Creative Commons歸因執照,允許無限製的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被認為提供了原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2018年2月28日(

接受日期:2018年3月14日

發表日期:2018年3月23日