牙科與口腔健康科學“，

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研究文章
正畸患者牙周病原體的口腔微生物流行情況

大衛•喬利凱莉想知道Ecsile常卡爾·金斯利＊

內華達大學，拉斯維加斯，牙科醫學院，內華達州，美國

*通訊作者:卡爾·金斯利，內華達大學，拉斯維加斯，牙科醫學院，美國內華達州，電話:+702-774-2625;電子郵件:Karl.Kingsley@unlv.edu


摘要

背景:口腔微生物菌群的變化在正畸治療期間是常見的，盡管一些證據表明這些變化可能會延續一段時間後。雖然許多研究篩查了齲病病原體水平的變化，但越來越多的證據表明，這些患者的牙周病原體發生了顯著變化。雖然在這個以低收入為主的牙科學校為基礎的正畸診所進行了幾項研究，對齲病病原體進行了篩查，但迄今為止還沒有對牙周病原體進行多生物篩查。

摘要目的:本研究的目的是完成一項回顧性、橫斷麵研究，對唾液樣本進行篩選有核梭杆菌，密螺旋體，而且Porphyromonas gingivalis在正畸和非正畸患者中(n=125)。

方法:使用之前收集的唾液樣本，DNA被分離出來，並使用PCR對每個感興趣的病原體進行特異性引物篩選。兩組(正畸、非正畸)患病率的差異采用卡方分析。

結果:這項分析揭示了這些病原體存在於近一半的正畸患者樣本和超過一半的非正畸樣本中。這些數據還表明，女性的患病率高於男性，而非正畸樣本的總體患病率更高。這可能與較高的平均年齡、較大的身體質量指數(BMI)、較大的牙周袋深(PPD)和蛀牙缺失填充(DMFT)分數有關。

結論:這些發現表明，非常需要計劃和實施一項前瞻性研究，以確定這些病原體在患者群體中開始正畸治療時的基線患病率，以及這些水平如何隨時間變化。這可能為口腔健康科學家和當地流行病學家提供更多相關的臨床信息，以確定最脆弱的人群，以及采取幹預措施的最佳方法和時機，以預防與牙周病相關的不良口腔健康結果和長期後果。

關鍵字

牙周病原體;正畸治療;唾液檢測

簡介

雖然許多關於正畸治療期間口腔微生物變化的研究都集中在致齲病原體上[1,2]，但很少有研究仔細檢查了其他口腔菌群的變化，包括牙周病原體[3,4]。研究表明，正畸治療可改變口腔微生物群，可直接或間接改變口腔微生物組成，從而大大增加患齲病和牙周病的可能性[5-7]。最近的證據表明，正畸治療期間微生物的改變可能會超過治療的持續時間，並影響長期的口腔健康結果[8-10]。

許多研究表明，口腔生物膜和齦下縫隙中的潛在牙周病原體水平處於正常的基線範圍，如果內穩態被破壞，可能會引發疾病[11,12]。這些病原體包括梭菌屬nucleatum(FN),梅毒denticola(TD),Porphyromonas gingivalis(PG)-慢性和持續性牙周炎的主要病因[12,13]。盡管現代材料和正畸技術近年來改善了口腔健康結果，但目前所有的治療都與許多患者牙周病原體水平在一定程度上的升高有關[14,15]。

近年來，涉及唾液生物標誌物的新診斷方法提高了監測口腔和牙周病的能力[16,17]。這些進展促進了研究正畸治療期間唾液篩查口腔微生物變化的研究[18,19]。事實上，這一學派的研究已經利用唾液生物標誌物來篩查正畸臨床患者中的齲源性病原體變化——盡管尚未嚐試在這一患者群體中大規模篩查牙周病原體水平[20-22]。

我們的研究告訴我們，由於大量低收入和少數民族患者在接受高質量醫療保健方麵可能麵臨更大的障礙和挑戰，正畸患者的口腔健康狀況可能值得特別關注，特別是在這個牙科學校診所。這些致齲病原體的高流行率，加上障礙增加和獲得護理的機會減少，可能解釋了這些觀察結果中的一些，盡管口腔微生物菌群內的全部變化仍不完整。這些數據是當前研究目標的基礎，目的是篩選來自該牙科學校患者診所的正畸患者和非正畸患者，確定特定牙周病原體如FN、TD和PG的相對患病率。

材料與方法
人類被試

方案提交“來自UNLV- sdm患者人群的口腔微生物回顧性調查”(OPRS#762911-1)於2015年8月3日由UNLV生物醫學IRB批準。唾液樣本最初是從符合條件的患者的方便樣本中收集並適當存檔的。排除標準包括選擇不參與的患者，7歲或以下的患者，以及成年口腔癌患者。2013年5月，研究完整性和保護研究(人類)受試者辦公室(OPRS#1305-4466M)批準了原研究“UNLV牙科醫學院兒童和成人臨床人群唾液中口腔微生物的流行率”。本項目將回顧性檢查其中一些樣本(n=125)。

唾液收集方案

雖然這是一項回顧性研究，但最初的方案涉及臨床唾液收集。在收集樣本時，每個樣本都被分配了一個隨機生成的唯一的、不重複的號碼，以保護患者的機密性並防止研究偏差。

病人的人口統計

除了唾液收集，還從每位患者身上獲得了一些人口統計學數據。這包括性別、年齡和自我報告的種族或民族，以及一些生物特征數據，包括身高和體重等身體質量指數(BMI)參數，以及蛀牙、缺牙或補牙(DMFT)和牙周袋深度(PPD)的一些臨床觀察。

細胞計數和DNA分離

收集唾液後，每個樣本都保持冷卻(用冰)直到加工。如前所述，所有樣品均使用標準樣品(500 μ L)和Amersham生物科學公司(英國白金漢郡)的Genomic Prep DNA分離試劑盒進行處理[20-22]。DNA的質量和數量使用260/280 nm的吸光度讀數來確定。

PCR:聚合酶鏈反應

為了篩選感興趣的病原體(FN, TD或PG)，使用Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, USA)的exACTGene完全PCR試劑盒和TD, FN, PG和人酶(對照)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物使用標準量的分離DNA，這些引物由SeqWright (Houston, Texas, USA)製造。

TD引物(正向);5 ' -TAATACCGAATGTGCTCATTTACAT-3 '

TD引物(反向);5 ' -CTGCCATATCTCTTGTCATTGCTCTT-3 '

FN引物(正向);5 ' -CGCAGAAGGTGAAAGTCCTGTAT-3 '

FN底漆(反向);5 ' -TGGTCCTCACTGATTCACACAGA-3 '

PG引物(正向);5 ' -TACCCATCGTCGCCTTGGT-3 '

PG引物(反向);5 ' -CGGACTAAAACCGCATACACTTG-3 '

GAPDH引物(正向);5 ' -ATCTTCCAGGAGCGAGATCC 3 '

GAPDH引物(反向);5 ' -ACCACTGACACGTTGGCAGT-3 '

每個PCR反應都有相同的設置，使用標準化的DNA量(1µg)。基本參數為94°C變性3分鍾，然後30個擴增循環，包括94°C變性20秒，在不同溫度(根據引物序列)退火60秒，72°C擴展30秒，最後在72°C擴展5分鍾。使用Kodak Gel Logic 100成像係統和1D圖像分析軟件(Eastman Kodak: Rochester, New York, USA)進行凝膠電泳，使用Reliant瓊脂糖凝膠(Lonza: Rockland, Maine, USA)並使用溴化乙酯進行紫外照明。

DNA標準:GAPDH

使用現有的人類細胞係HGF-1創建DNA標準，以確定相對端點或RE-PCR比較所需的最小細胞數量。這些DNA可用於確定PCR條件，也稱為最小循環閾值(minimum cycle threshold，簡稱CT)，即顯示已知數量的PCR擴增DNA所需的最小PCR循環數，以及最大循環飽和點(maximum cycle saturation point，簡稱CS)，如之前的工作[20-22]所述。使用該標準和方法，CT被確定為20個周期(C20)，在35個周期(C35)觀察飽和度。

DNA標準:PG

牙齦卟啉單胞菌或PG購自ATCC (FDC-381;馬納薩斯，弗吉尼亞州)，如前所述[20,21]。使用過夜生長懸浮液，吸光度讀數在650 nm，光密度(OD)讀數為0。8個，大約10個7CFU /毫升。將該懸浮液稀釋以產生5.0 × 10的細胞數6, 105, 104和103.CFU/mL，代表唾液微生物濃度，與疾病風險對應，範圍從106CFU/mL為高危值103.CFU/mL，代表正常或平均風險。PG的閾值或CT需要25個周期(C25)，飽和度為45個周期(C45)。結合GAPD和PG實驗數據，CT分別為C20和C25, CS分別為C35和C45[20,25,26]。基於這些信息，RE-PCR在C30範圍內使用中間循環進行，C30在兩種生物的檢測限(CT)和飽和限(CS)之間。

統計分析

樣本量最初是使用DNA提取試劑盒中較低的估計DNA回收率(90%)來確定的，以提供最小的預期差異為0。10.得到p=0的統計冪。80，顯著性水平，α=0。05-最小樣本量(n=50)是必要的[27]。采用卡方分析來確定與患者人口統計學(性別、種族/民族)有關的分類數據的差異，以及組間TD、PG或FN的差異(基於性別、種族/民族)。

結果

唾液樣本根據患者最初招募的診所進行分組，包括正畸診所和(非正畸)主要患者診所(表1)。正畸樣本反映的總體分布與該診所人群的總體分布相似。例如，來自正畸診所(n=54)患者的樣本中女性(59.3%)多於男性(40.7%)，這與整個正畸診所的總體分布大致相似(p=0.1941)。此外，來自少數民族患者的樣本百分比(66.7%)反映了整個正畸診所的大致相同的百分比(64.9%)，沒有統計學意義(p=0.2330)。此外，這些少數族裔患者中絕大多數自認為是西班牙裔(n=28/36=77.8%)。

表1:患者樣本及臨床特征

從非正畸或主要患者診所收集的樣本在女性(50.7%)和男性(49.3%)中幾乎平均分布，這與他們在整個主要臨床人群中的百分比相似(49.4%，50.6%，p=0.4109)。大多數患者認為自己是少數民族或少數民族(60.6%)，這也與臨床患者的總體構成相似(59.2%，p=0.3677)。與正畸臨床樣本一樣，這些少數民族患者絕大多數是西班牙裔(n=34/43或79.1%)。

這些相應的患者樣本在篩選和分析之前進行DNA分離程序(表2)。這些數據顯示，回收率為98.4% (n=123/125)，與以往的研究相當[20,21,28,29]。DNA濃度平均為474.5 ng/uL，在正畸患者樣本中為578.5 ng/uL，在非正畸患者樣本中為393.2 ng/uL。DNA純度在1.61到2.0之間，允許通過PCR進行篩選，顯示了人類(GAPDH)和細菌(16S rRNA) DNA的存在。

表2:DNA的恢複和分離

如材料和方法部分所述，生成DNA標準是為了找到閾值和飽和PCR循環(CT, CS)，通常用於比較相對終點PCR中的相對起始DNA濃度(圖1A)。利用這些標準和方法，在C20和C25分別對GAPDH和PG進行了CT檢測，並分別在C35和C45進行了相應的CS檢測，隨後在C30完成了RE-PCR，結果均高於低檢出限(CT)，但仍低於飽和限(C35-C45)。

圖1:對人細胞(GAPDH)和細菌細胞(PG)分別測定了DNA標準和定量分析PCR周期閾值(CT)或檢測限(detection limit)和周期飽和度(CS)，得出了C25 ~ C35之間的最佳篩選周期。PCR信號帶強度(SBI)與起始細胞數(R2>0.97)在C30，這將允許從篩選的唾液樣本開始細胞數的近似值。PG (p . gingivalis）;甘油醛-3-磷酸脫氫酶

標準化細胞數稀釋106, 105, 104和103.細胞/mL(人)或CFU/mL(細菌)進行相應處理。這些數字近似於證明唾液微生物濃度與疾病風險相關性的研究[20,25,26]:

106CFU/mL為高危;

105CFU/mL為高危;

104CFU/mL為中度危險;

< 103.CFU/mL表示風險正常或平均

製備這些係列稀釋液以建立GAPDH和PG的PCR標準曲線(圖1B)。這些數據表明，在第30個周期(C30)的信號帶強度(SBI)與起始細胞數幾乎完全相關2=0.9945)和GAPDH (R2= 0.9797)。

在DNA分離後，所有樣本都進行了篩檢f . nucleatum(FN),t . denticola(TD)和p . gingivalis(PG)達到或高於預先確定的疾病風險水平(>103.CFU/mL)與之前基於唾液PCR篩選研究的結果一致(圖2)[20-22]。這些數據顯示，在所有樣品中，FN、TD和PG分別在52%、41.6%和48%的樣品中處於或高於這些預定水平。更具體地說，正畸樣本中FN、TD和PG的患病率(46.3%、38.9%、44.4%)明顯低於對照組和非正畸樣本(56.3%、43.7%、50.7%)。

圖2:利用之前建立的DNA標準，確定>的PCR周期閾值檢測標準4CFU/mL，近一半的樣品被發現含有FN, PG和TD。更詳細的分析顯示，正畸樣本的FN患病率(p<0.01)和PG患病率(p<0.05)顯著低於非正畸樣本，TD患病率也顯著低於非正畸樣本(p=0.07)。FN(f . nucleatum),道明(t . denticola)；PG(P.gingivalis)；χ2(Chi平方)d.f.(自由度)

為了確定正畸和非正畸臨床樣本之間FN、TD和PG患病率的差異是否由其他因素引起，我們進行了更詳細的分析，以評估性別/性別的任何可能影響(圖3)。盡管在所有正畸樣本中發現了牙周病原體患病率顯著降低的普遍模式，但特別是在男性正畸患者中，FN患病率顯著高於預期(p<0.01)。此外，盡管在非正畸(對照組)樣本中觀察到牙周病原體的患病率較高，但性別/性別特異性模式也很明顯，女性表現出明顯高於男性的所有牙周病原體水平，但FN和PG的水平在比例上要高得多(p<0.01)。然而，在種族或民族類別之間沒有觀察到顯著差異。

圖3:將正畸樣本按性別分選為女性和男性的PCR篩查分析顯示，除男性正畸患者比例顯著較高外，整體上病原體患病率較低(p<0.01)。非正畸(對照)樣本的分析也顯示出性別特異性模式，女性表現出病原體流行的比例顯著高於男性(p<0.01)。FN (f . nucleatum),道明(t . denticola)；PG(P.gingivalis)；χ2(Chi平方)d.f.(自由度)

對每個患者樣本的附加人口統計學和健康數據也進行了分析和回顧(表3)。這些信息包括患者年齡、體重指數(BMI)、牙周袋深度(PPD)和蛀牙、缺牙和補牙(DMFT)評分，這些評分按診所(正畸或主要診所)分組，然後按性別和種族分類。該分析顯示，正畸樣本患者的平均年齡(24.4歲)明顯低於非正畸樣本患者的平均年齡(28.3歲)。雖然在正畸樣本中沒有發現男性和女性或少數民族和非少數民族的年齡差異，但與非正畸樣本有更大的差異。此外，非正畸樣本的平均BMI(29.3)也顯著高於正畸樣本(25.7)，僅在性別或種族和民族之間觀察到微小差異。

表3:研究樣本人口學和健康參數分析
*為有統計學意義(p<0.05);BMI(身體質量指數);PPD(牙周袋深度);齲缺補牙;T(雙尾檢驗T統計量的臨界值);SE(標準誤差)

有趣的是，PPD在非正畸樣本中(4.11)比正畸樣本(3.12)大得多，兩者差異很大。更具體地說，正畸樣本中的男性PPD(4.67)比女性(2.66)大得多，而少數民族的PPD(3.67)比白人(2.21)大得多。在非正畸樣本中沒有觀察到這些差異。正如預期的那樣，正畸樣本的DMFT得分顯著不同，與非正畸樣本(23.56)相比，正畸樣本的DMFT得分較低(10.75)，而兩家診所的少數族裔的DMFT得分較高。

最後，將本研究的PCR篩查結果與同時收集的健康參數進行分析比較(表4)。由於正畸和非正畸樣本之間的大多數健康參數存在顯著差異，本分析可能揭示這些額外變量與PCR篩查結果之間的關係。例如，雖然正畸組和非正畸組在FN和PG患病率方麵存在顯著差異，但這些差異似乎與這兩組的總體年齡或平均BMI沒有顯著相關。然而，在臨床口腔健康參數測量和牙周病原體檢測之間存在一些顯著的相關性，例如PPD與TD患病率之間的相關性，以及總體DMFT平均值與FN、TD和PG患病率之間的相關性。

表4:健康參數和篩查結果分析
*為有統計學意義(p<0.05);FN(f . nucleatum),道明(t . denticola)；PG (P.gingivalis);年(年);BMI(身體質量指數);PPD(牙周袋深度);齲缺補牙;χ2(Chi平方)d.f.(自由度)

討論

本研究的目的是確定正畸患者中特定牙周病原體的口腔微生物負擔，以便與非正畸對照組進行比較。正如最近的證據所表明的那樣，許多關於正畸患者口腔微生物菌群變化的研究主要集中在致齲病原體上，而很少有研究檢查了與特定牙周病原體相關的潛在變化，例如dentticola, F. nucleatum和P. ginginvalis——尤其是在成年患者中。雖然本研究使用了以前收集的唾液樣本，而不是更具體的臨床相關牙齦溝液(GCF)，但這些方法與以前對該患者群體的回顧性研究[20-22]和其他最近發表的利用現有唾液庫的工作一致[7,16,18]。這項研究的結果清楚地表明，在正畸患者和非正畸患者的樣本之間發現了可觀察到的差異。

不同於以往對該正畸患者診所的研究，該研究表明口腔齲病病原體的患病率要高得多[20,22]，本研究的結果發現，與主要患者診所相比，該患者樣本中的牙周病原體水平顯著降低。對這些觀察結果的一個潛在解釋可能是，在主要臨床人群中，非常低收入的首次牙科就診比例過高，這可能與經過多次篩查、衛生和隨訪預約的正畸患者有很大不同[20,22-24]。此外，目前的研究樣本量(n=125)比之前評估的任何研究都要大(範圍從n=52到n=75)，這可能也影響了這些發現。有趣的是，該學派的最新研究發現，在近一半的正畸樣本中，主要是齲源性和一種牙周病原體(PG)，這與當前研究[22]的結果大致相當。然而，先前研究的非正畸樣本顯示，隻有約25%的PG處於或高於疾病風險水平，這遠遠低於當前研究的結果，這表明需要更多的研究來進一步闡明這些結果的不同性質。

本研究有一些局限性，在評估結果和結論時也必須考慮到這些局限性。回顧性研究設計可能通過招募團隊的選擇偏倚或其他混雜因素(如患者參與或自我選擇偏倚)對結果產生顯著影響[20-22]。此外，僅在一次患者就診和時間點收集這些樣本表明，不能就這種類型的橫斷麵研究中牙周病原體流行率的觀察得出時間上的結論。由於關於每個患者樣本的信息有限，因此沒有試圖標準化患者在正畸治療中接受治療的時間，這可能進一步限製了從這些結果中得出的總體結論。

由於這些組之間觀察到的顯著差異，未來對該人群的研究應具有前瞻性，在治療開始前收集每個患者的臨床樣本，並在正畸托槽放置後的不同時間點采集相應的樣本。這可能有助於解開這些可能的混淆變量[30]。這種前瞻性的多時間點分析還允許將正畸治療持續時間作為分析[31]的另一個潛在變量。還可以同時收集其他感興趣的數據，包括臨床衛生評估和口腔衛生和飲食模式的調查，以更準確地確定這些組內和組間隨時間推移差異的性質[3,32]。最後，一項前瞻性研究將允許從唾液中提取的臨床樣本與從牙齦溝液(GCF)中提取的樣本進行比較，以及直接從牙齒表麵或正畸托槽近端各個部位提取的樣本，這將允許對這些觀察到的現象進行更可靠的分析[33,34]。

盡管存在這些局限性，但這些研究結果首次詳細描述了牙周病原體在這一患者群體中的流行情況，以及與各種健康和人口因素的潛在聯係。這些發現表明，非常有必要計劃和實施一項前瞻性研究，以確定這些患者開始正畸治療時PG、FN和TD的基線患病率，以及這些水平如何隨時間變化。這可能為口腔健康科學家和當地流行病學家提供更多相關的臨床信息，以確定最脆弱的人群，以及采取幹預措施的最佳方法和時機，以預防與急性牙周病相關的不良口腔健康結果和長期後果。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:joley D, Wonder K, Chang E, Kingsley K(2016)正畸患者牙周病原體的口腔微生物流行情況。國際口腔健康雜誌2(6):doi http://dx.doi.org/10.16966/2378-7090.210

版權:©2016 Jolley D, et al。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可的條款發布，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是要注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2016年5月2日

  • 接受日期:2016年6月21日

  • 發表日期:2016年6月27日