牙科與口腔健康科學“，

全文

阿侖膦酸鈉對人肺泡成骨細胞的影響:與血小板源性生長因子的相互作用

勞拉·巴爾1，安娜·莫塔1，格林伯格的旋律1，沙特Almojaly2，迷迭香Dziak1 *，

1美國布法羅大學口腔醫學院口腔生物學係
 2美國費薩爾國王專科醫院和研究中心牙科科

*通訊作者:羅斯瑪麗·迪亞克，布法羅大學口腔生物學係，紐約州立大學布法羅，美國紐約州，14214;電話號碼:716-829-3827;傳真:716-829-3942;電子郵件:rdziak@buffalo.edu

摘要

作品簡介:雙磷酸鹽因其對骨重塑的抑製作用而被廣泛應用於骨病的治療。盡管雙磷酸鹽直接作用於破骨細胞已被證實，但越來越多的證據表明它們也可能作用於成骨細胞。報道的這些藥物對成骨細胞的影響與越來越多的研究相矛盾，這些研究表明，在不同濃度和不同類型的雙磷酸鹽下，成骨細胞分化和骨形成活性是不同的。慢性使用雙膦酸鹽可引起頜骨骨壞死等副作用。為了更好地開發減少這些不良影響的方法，進一步了解雙磷酸鹽對成骨細胞的影響及其內源性調節因子的調節是很重要的。

材料與方法:用雙膦酸鹽、阿侖膦酸鹽、血小板源性生長因子以及阿侖膦酸鹽和血小板源性生長因子聯合處理人肺泡成骨細胞培養物。在24小時至17天的時間內，用線粒體酶測定法評估細胞活性，用堿性磷酸酶和礦化分光光度法測定細胞分化。

結果與結論:用阿侖膦酸鈉(10-8 M)處理成骨細胞對細胞活性和分化標誌物產生小而顯著的影響，這些影響隨培養時間的變化而變化。血小板來源的生長因子對這些相同參數的影響與阿侖膦酸鹽聯合孵育保持一致，這表明這種生長因子可能在最大限度地減少藥物的負麵副作用方麵具有治療作用。這些數據支持了血小板生長因子富集血漿用於雙膦酸鹽誘導的頜骨骨壞死的潛在臨床應用。

關鍵字

Alendronate;磷酸鹽;成骨細胞;血小板源性生長因子;骨壞死

縮寫:

英國石油(BP):二磷酸鹽;“腎上腺腦白質退化症”:Alendronate;PDGF:血小板衍生生長因子;雙膦酸鹽相關頜骨骨壞死

簡介

雙磷酸鹽(Bisphosphonates, BPs)是一種廣泛用於治療骨質疏鬆症、Paget’s病、惡性腫瘤相關高鈣血症、多發性骨髓瘤及炎症性疾病伴隨的骨轉移和骨丟失等骨病的藥物[1-6]。

眾所周知，bps通過直接作用於破骨細胞(主要骨吸收細胞類型[7])對骨重塑具有抑製作用。然而，由於有很多證據表明，成骨細胞(主要的骨形成細胞類型)也參與了破骨細胞形成的調節，因此BPs的作用可能不僅僅局限於破骨細胞。成骨細胞通過產生核因子(NF)-ĸB配體(RANKL)[8]參與破骨細胞的調節。成骨細胞也被廣泛證明產生骨保護素(OPG)，一種RANKL的可溶性受體，它作為一個誘餌競爭性地抑製RANKL與RANK的結合並抑製RANK的激活，從而降低破骨細胞的激活[9]。與這些研究一致的是，有研究表明BPs可以抑製成骨細胞RANKL的表達，增加OPG的表達[10,11]。

盡管這些結果表明成骨細胞通過RANKL信號參與了BPs的抗吸收作用[10,11]，但正如最近的一篇綜述[12]所述，這些藥物對成骨細胞的其他作用尚未得到一致的觀察。有人認為，成骨細胞研究中相互矛盾的結果可能是由於所研究的雙膦酸鹽、其有效濃度以及成骨細胞類型[12]。例如，已注意到BPs對成骨細胞發生標記物的積極影響，濃度從109到10- 6M，但在較高濃度時具有抑製作用[13-22]。最近的一項關於阿侖膦酸鈉(ALD)的研究表明，這種BP通過參與破骨細胞和成骨細胞之間交叉對話的ephrinB1-EphB通路間接影響成骨細胞。這項對大鼠骨髓細胞的研究提供了體外證據，證明ALD直接作用於破骨細胞前體，然後再作用於成骨細胞前體，抑製成骨細胞分化和相關的骨形成活動[23]。

盡管慢性使用bp與非典型股骨骨折和頜骨骨壞死等副作用有關，但這些藥物仍然廣泛使用，因為它們對骨折和相關骨痛的管理通常具有積極的治療作用。ALD通常是預防骨質疏鬆性骨折的一線治療選擇，但與其他口服BPs[24]相比，它可能具有更高的非典型股骨骨折和頜骨骨壞死的風險。為了製定策略，以盡量減少BPs的負麵影響，有必要更好地了解這些藥物的作用機製。為此，我們研究了ALD對牙槽骨標本成骨細胞原代培養的影響，重點是在血小板衍生生長因子(PDGF)存在時對反應的改變。這些反應的治療意義在BP誘導頜骨骨壞死(BRONJ)被討論。

材料與方法

阿侖膦酸鈉(ALD)是從Sigma -Aldrich(聖路易斯，密蘇裏州)購買的。這裏使用的血小板衍生生長因子(PDGF)是人重組PDGF- bb。除非另有說明，本試劑和所有其他試劑也從Sigma-Aldrich購買。

使用先前描述的[25]條件從牙槽骨標本中獲得人成骨細胞。這些本該被丟棄的標本的使用是根據布法羅大學人類受試者機構審查委員會的指導方針進行的。

礦化分析

成骨細胞以每孔3萬個細胞的濃度接種於24孔組織培養板中。細胞與ALD (108M)， PDGF (108M)或兩種製劑的組合，對照無添加劑，在α -最小必需培養基(MEM, Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY)中添加熱激活的10%胎牛血清，1% l -穀氨酰胺，青黴素G，硫酸鏈黴素和兩性黴素B, 37℃，5% CO2．在大多數實驗中，每兩天更換培養基和處理溶液進行培養。總潛伏期從10-21天不等。

礦化用比色茜素紅法定量，該法采用Gregory等[26]的方案，測量與細胞培養相關的鈣礦物含量。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)衝洗細胞單層並固定

用70%乙醇冷凍一小時。在加入40mM茜素紅S (ARS)之前，用高純淨水衝洗單層膜，pH為4.2。所有染料被吸收到單層膜後，每個孔用純淨水衝洗5次，用PBS衝洗1次。盤子的溫度是零下20度0在染料提取之前。采用氯化十六烷基吡啶(CPC)萃取進行脫色。通過添加CPC (10% w/v, pH 7.0)去除單分子膜中的ARS。然後將培養皿在室溫下輕輕搖晃1小時。在550 nm[26]處測定CPC萃取物的吸光度。

堿性磷酸酶活性

將人成骨細胞與上述ALD和PDGFas孵育24-72小時，並使用之前詳細描述的對硝基苯酚磷酸鹽法分析ALP活性作為成骨細胞分化的指標，並根據相關的總細胞蛋白[27]進行數據標準化。

四氮唑鹽(MTT)測定:該試驗用於評估成骨細胞活性。原代人成骨細胞與ALD、PDGF或上述藥物的組合孵育不同時間。在實驗期(24,48或72小時)結束時，向細胞中加入MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四溴化銨試劑4小時，並按先前詳細描述[28]進行測定。

結果與討論

圖1顯示了ALD (108M)對成骨細胞活性的影響隨孵育時間的變化而變化，24小時後與對照組相比略有降低，但顯著降低，48小時後無影響，且影響較小，但72小時後顯著增加。在所有這些時間段，PDGF (108M)，與對照組相比，產生了活性的增加，而這些pdgf誘導的增加在與ALD聯合培養的細胞中沒有改變(108米)。

圖1:MTT細胞活性在孵育24小時後，與對照相比，阿侖膦酸鈉產生了小而顯著的細胞活性降低，阿侖膦酸鹽和PDGF共孵育的水平顯著高於單獨阿侖膦酸鹽，而與單獨PDGF無顯著差異。48小時後，與對照組PDGF和阿侖膦酸鹽聯合使用相比，單獨使用阿侖膦酸鹽沒有任何影響，但仍表現出PDGF誘導的升高。與阿侖膦酸鹽共孵育72小時後，觀察到PDGF誘導的升高沒有顯著改變。數值為每組n=4個樣本時的平均值+/- SEM: * =與對照組顯著不同;** =與單獨使用阿侖膦酸鈉顯著不同;= p<0.05方差分析。

圖2:堿性磷酸酶研究24小時後，與對照組相比，阿侖膦酸鈉使堿性磷酸酶活性顯著增加。PDGF單獨產生類似的效果，但與阿侖膦酸鹽聯合使用時，這種效果顯著降低。48小時後，與所有組相比，阿侖膦酸鈉顯著降低堿性磷酸酶水平。PDGF和阿侖膦酸鹽聯合使用較單獨使用阿侖膦酸鹽顯著增加堿性磷酸酶。72小時後。阿侖膦酸鹽或PDGF均未觀察到顯著作用。數值為每組n=4個樣本時的平均值+/- SEM: * =與對照組顯著不同;** =與單獨使用阿侖膦酸鈉顯著不同;= p<0.05方差分析

ALD和PDGF對ALP活性的影響也有時間依賴性。圖2顯示ALD孵育24小時後(108M)成骨細胞分化的早期標記物有小而顯著的增加。PDGF (108M)與對照組相比產生了類似的增長。然而，在這個時期，與這兩種藥劑的組合孵育，每個在108M，與對照相比，對ALP活性沒有影響。與ALD孵育48年後，與對照組相比，ALP顯著降低。雖然PDGF單獨作用108與對照相比，M或與ALP聯合使用沒有顯著增加，但明顯大於ALD單獨使用。72小時後，與對照組相比，任何治療組對ALP活性均無顯著影響。

圖3顯示與ALD孵育10天(108M)導致與對照組相比，人成骨細胞培養物中的礦化顯著降低。在同一時期，PDGF (108M)處理的細胞礦化顯著增加。當細胞與兩種藥劑分別以108在10天期間，ALD治療沒有顯著改變pdgf誘導的礦化增加。ald誘導的成骨細胞礦化減少在孵育長達17天時被注意到(數據未顯示)。圖4所示的結果表明，ALD可能不需要在整個病程中都存在，就可以在這個細胞係統中實現礦化的顯著降低。與ALD孵育(108M) 7天，然後去除含有藥物的培養基，用新鮮培養基替代，再孵育5天，結果與對照組相比，與ALD孵育整個12天期間的細胞相似。當PDGF (108M)添加到去除ALD的培養物中，在隨後的7天潛伏期內礦化顯著增加。

雖然目前有幾種bp用於骨骼相關疾病的治療管理，但在本研究中，由於幾個原因，ALD對人類肺泡成骨細胞的影響是重點。ALD通常是口服抗骨質疏鬆治療[24]的主要選擇，有數據表明，與其他口服BPs(如利塞膦酸鹽、伊班膦酸鹽、伊替膦酸鹽和氯膦酸鹽[24])相比，ALD的不良骨骼副作用，如頜骨骨壞死和非典型股骨骨折可能更高。

對骨骼產生不良副作用的潛在機製尚不清楚，但有報道稱，與口服的其他BPs相比，ALD對組織具有更強的親和力，同時具有更明顯的骨轉換降低和更強的抗血管生成作用[29,30]。本文報道的結果與越來越多的研究結果一致，這些研究表明ALD可以對成骨細胞產生直接影響，並且這些影響會隨著培養時間和各種相關因素的變化而變化。本文的研究主要集中在ALD和PDGF之間可能的相互作用，因為有證據表明PDGF可能在BP誘導的頜骨[31]骨壞死的愈合過程中具有一定的治療價值。

圖3:礦化研究在孵育10天後，與對照組相比，阿侖膦酸鈉礦化顯著降低。與PDGF孵育同一時期產生顯著增加，與阿侖膦酸鹽共孵育不改變。數值為每組n= 4個樣本的平均值+/- SEM: * =與對照組相比下降;**=與對照組以及單獨阿侖膦酸鈉相比增加;p < 0.05方差分析

圖4:無阿侖膦酸鈉期礦化研究在孵育12天後，阿侖膦酸鈉組礦化顯著降低。五天的阿侖膦酸鹽無藥期(假期)與整個期間的阿侖膦酸鹽相比，對礦化沒有顯著影響。在無阿侖膦酸鹽(假期)期間，PDGF治療組與無添加PDGF的阿侖膦酸鹽5天治療組相比，礦化顯著增加。取值為每組n= 4個樣本時的均值+/- SEM: * =差異顯著;p < 0.05方差分析

PDGF存在於骨基質中，不僅由血小板合成，還由單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞和成骨細胞[32]合成。生長因子分子是一種二聚體，可由四種不同的多肽鏈(a,B, C, D)製成。從這些鏈的不同可能組合來看，PDGF-BB似乎是骨骼中生物活性最強的，並已被證明與成骨細胞結合具有最高的親和力[33,34]。它已被證明在骨折部位產生，並存在於骨折修複的早期階段[35]。在大鼠模型中，全身給藥PDGF不僅可以防止卵巢切除術引起的骨丟失，還可以保持整個骨骼的骨強度。在該動物模型中，PDGF和阿侖膦酸鈉聯合給藥導致骨密度水平高於單獨使用任何一種藥物。這些數據表明，即使存在雙膦酸鹽，PDGF也可能有效地對骨骼產生合成代謝作用，並可能抑製骨重塑活動[36]。

研究表明，PDGF-BB刺激成骨細胞的趨化性和增殖，並增加這種細胞類型[33]的膠原合成。PDGF對堿性磷酸酶和礦化等分化參數的直接影響取決於暴露條件。一項專注於這些參數在體外表達的研究表明，短期暴露於PDGF會產生增加，而在較長時間的孵育中，這些參數會減少[34]。基於這些觀察，在幾項體內研究中看到的骨形成的增加似乎主要是由於成骨細胞[34]增殖作用的增加。本文的研究支持PDGF對堿性磷酸酯的時間效應，在最早的24小時測量時間段內增加，在較長時間(48或72小時)後減少或沒有顯著影響。同樣，PDGF對礦化的影響在孵育10天後增強，但在12天後觀察到下降。這裏觀察到的PDGF對細胞活性的刺激作用與持續一段時間內增殖的增加是一致的。尤其令人感興趣的是，在本研究中，ALD和PDGF的聯合使用在24和48小時的孵育後恢複了ALP誘導的成骨細胞活性下降。在礦化研究中，特別有趣的是，在7天孵育後，將ALD從成骨細胞培養物中去除5天後，PDGF的加入將降低的礦化標記物水平恢複到12天周期結束時的控製水平。這些結果與之前的一篇報道一致，即從BPinduced骨壞死患者中分離出的成骨細胞對PDGF的反應與從未使用BP[37]治療的患者的牙槽骨中分離出的細胞相似。

根據最近的綜述[38]，有許多關於PDGF在牙槽骨再生、牙周組織以及傷口愈合方麵的治療作用的報道[39-43]。局部應用PDGF-BB已被證明可以破壞血管的穩定，並導致愈合傷口[38]處新血管的生長。

由於PDGF已被證明具有促進骨和牙周組織修複和再生的多種作用，它應該是治療口腔壞死疾病的天然候選藥物，盡管它似乎還沒有在這方麵進行過直接測試。然而，已經有幾篇報道成功地使用含有相對高水平PDGF的富血小板血漿(PRP)以及其他生長因子治療BRONJ。Adornato等人[44]聯合骨切除和自體血小板源性生長因子治療了12例難治性BRONJ患者。6個月後，10例患者的粘膜和骨缺損完全恢複，其餘2例在愈合方麵有所改善。隨後，Mozzati et al.[45]報道了在切除壞死組織後骨缺損處應用PRP成功治療32例BRONJ (Marx IIB分級[46])。該組的一篇更新論文記錄了這些患者在7年隨訪後無並發症，需要100%的再幹預。此外，在Long et al.[48]的臨床綜述中，又有32例PRP治療BRONJ成功的報道。

人們認識到，臨床使用富血小板血漿(PRGF)比單獨使用PDGF具有優勢。PRP除含有PDGF外，還含有活化血小板釋放的多種生長因子，如轉化生長因子- β、內皮生長因子、血管內皮生長因子、胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子[49]等。

有研究報道，在癌症患者化療前給予雙膦酸鹽，如帕米膦酸鹽和唑來膦酸，可顯著降低PDGF以及血管內皮生長因子(VEGF)等血管生成因子[50,51]。對成骨細胞和破骨細胞有顯著影響的因子濃度的這種性質的降低會影響雙膦酸鹽對骨重塑的整體作用，並導致骨壞死狀態。因此，在BP誘導的骨壞死傷口局部應用PRP，可能通過增加受損部位PDGF濃度以及血管生成因子(如VEGF)的濃度，對骨和周圍組織的愈合具有顯著的積極作用，越來越多的臨床研究者報道了成功治療該疾病的病例報告[44-49,52,53]。盡管文獻中報道的此類病例數量迅速增加，但支持使用PRP治療BRONJ的病例對照隨機研究仍然缺乏。

結論

觀察到阿侖膦酸鈉對人肺泡成骨細胞活性、ALP和礦化的直接影響，隨培養條件的不同而有增有減。hrpdgf調節這些作用的方式與臨床報告中觀察到的富血小板血漿對BRONJ的治療作用一致。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:楊曉明，張曉明，張曉明，張曉明，等。(2015)阿侖膦酸鈉對人肺泡成骨細胞的影響。Int J Dent口腔健康，Volume1.2: http://dx.doi.org/10.16966/2378-7090.108

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出版的曆史:

  • 收到日期:2015年4月14日

  • 接受日期:2015年4月27日

  • 發表日期:2015年5月5日