摘要

由於膀胱癌每年的發病率不斷上升，越來越需要開發新的治療策略。2018年，世界癌症研究基金會和其他組織報告稱，全球有大約55萬例膀胱癌新發病例。據進一步估計，全世界每年有20萬人死於膀胱癌。有多種治療方案。然而，許多(如果不是全部的話)仍然是次優的。在過去的幾年裏，雖然首選的化療方案已經改變，但膀胱癌醫療器械領域的進展很少。冷凍消融術現在正被評估為治療膀胱癌的一種新選擇。雖然一些研究表明冷凍消融對膀胱癌的治療很有希望，但由於缺乏摧毀膀胱癌所需的劑量(最低致死溫度)的基本信息，限製了其作為主要治療方案的使用。對膀胱壁穿孔和其他副作用的擔憂也減緩了應用。

為了詳細研究冷凍對膀胱癌的影響，研究人員在體外評估了兩種人膀胱癌細胞係scer和UMUC3。scar是一種肌肉浸潤性膀胱癌的基礎亞型，UMUC3是一種中間移行細胞癌，兩者都很難治療，但據報道對大多數常規治療都有反應。將scer和UMUC3細胞暴露在-10至-25°C的冷凍溫度範圍內，並與未冷凍的對照組進行比較。數據顯示，單一的5分鍾冷凍至-10°C不會影響細胞活力，而-15°C和-20°C會導致冷凍後1天的活力顯著降低至<20%。然而，這些種群在文化中得以恢複。在-25°C冷凍一次後，發現細胞活力完全喪失。應用重複(兩次)冷凍導致細胞在-20°C完全死亡。除單獨冷凍外，還進行了調查輔助低劑量(1 μ M)順鉑預處理(30分鍾和24小時)聯合冷凍的影響的研究。30分鍾順鉑預處理和輕度(-15°C)冷凍聯合使用可導致細胞完全死亡。這表明亞臨床劑量的順鉑與冷凍聯合使用時可能具有協同作用。

總之，這些在體外結果表明，冷凍至-20至25°C的溫度範圍內會導致高度的膀胱癌細胞破壞。此外，這些數據描述了一種治療膀胱癌的潛在聯合化療/冷凍治療策略。

介紹

開發治療局部膀胱癌和轉移性膀胱癌的新策略和醫療設備是無可爭辯的需要。世界癌症研究基金會等報告稱，2018年全球有大約55萬例膀胱癌新發病例，預計2019年全球將有20萬人死於膀胱癌[1-5]。此外，膀胱癌是所有癌症中每位患者一生治療費用最高的。雖然在女性中不太常見，但在男性中是第四大常見癌症。大約一半的新診斷病例是非侵襲性癌症包含在膀胱壁的內層。約33%的病例在診斷時為局部進展，肌肉侵犯已擴散到膀胱深層，其餘病例為轉移性膀胱癌[7]。根據美國癌症協會的數據，膀胱癌的存活率因SEER分期而異:局部(69%);原位獨自一人(95%);地區(35%);遙遠的(5%);77%的SEER期合並[5]。

膀胱癌的治療取決於級別和階段。低級別、早期非侵入性癌症可以通過經尿道切除(TURBT)和膀胱內治療相結合成功治療，其中通過化療或免疫療法將藥物注射到膀胱中長達兩小時[8]。癌症已深入膀胱壁或轉移到膀胱外，治療方法包括放療、全身化療和/或根治性膀胱切除術。順鉑、5-氟尿嘧啶、絲裂黴素和吉西他濱是最常用的化療藥物，通常與放療或不放療聯合使用。目前存在多種治療方案，但已報道了一些問題，包括治療費用高、患者不適、並發症、治療不完整、程序侵入性和療效差等。

雖然浸潤性膀胱癌患者根治性膀胱切除術後使用的新輔助化療(如甲氨蝶呤、長春堿、阿黴素和順鉑到現在的吉西他濱和順鉑)已經取得了進展和轉變[9,10]，但在治療膀胱癌的消融方法方麵進展很少。冷凍消融是一種成熟的實體腫瘤消融方法，在前列腺癌[11]的治療中提供與其他方式相當的無病生存率，也用於腎癌、肝癌和乳腺癌[12-14]。冷凍消融從組織中提取熱量，並創造一個動態的熱環境，在這個環境中，最接近冷凍探頭的超低溫會誘導細胞破裂。從探針表麵向徑向延伸的較溫暖的亞冰點等溫線會導致一個完全壞死區，其次是一個過渡區，其特征為壞死、凋亡和活細胞，這是由冰晶形成、缺氧、pH、離子變化、能量剝奪、自由基形成等因素共同作用造成的[15,16]。溫度暴露在-25°C至0°C範圍內(取決於癌症類型)是這種異質細胞死亡和存活的過渡帶的特征。因此，這一過渡區域顯示癌症複發的可能性增加在活的有機體內因此，這是使用增敏劑的組合策略的主要目標，目標是協同增加細胞死亡，同時減少對長時間冷凍[16]的需求。

作為一種微創方式，冷凍消融術是治療淺表或肌肉浸潤性膀胱癌的一種有吸引力的選擇。已發表的多項研究表明，冷凍消融能夠在不損害膀胱結構的情況下通過膀胱壁進行冷凍[17-20]。雖然顯示出希望，但使用冷凍療法治療膀胱癌在臨床上仍然有限。這部分是由於缺乏與膀胱癌細胞對冷凍反應相關的數據，包括確保致死率所需的最低溫度和暴露時間(劑量)，對膀胱壁穿孔的擔憂，很少有膀胱鏡兼容的冷凍設備，延長的手術時間，成本和靶向轉移性疾病的能力，這些限製了廣泛應用。本研究的目的是研究兩種不同膀胱癌細胞係的冷凍敏感性，作為建立膀胱癌冷凍消融劑量參數的第一步。選擇scer和UMUC3細胞係，scer是一種鱗狀細胞癌(SCC)，代表一種侵襲性基底肌侵襲性膀胱癌(MIBC)，而UMUC3是一種移行細胞癌(TCC)，代表一種中至高風險癌症。對兩種膀胱癌變體進行分析是因為研究表明，相似癌症(組織類型)的不同階段和分子配置對類似治療的反應不同[21]。

除了冷凍消融的潛力外，許多研究已經證明了輔助策略的益處，包括冷凍聯合使用各種化療和營養藥物，以增加各種癌症類型的癌細胞死亡[22-25]。在膀胱癌治療領域，研究表明熱療(熱和冷凍)單獨或聯合化療/放療是治療不可切除的pT4b膀胱癌以及其他膀胱癌和輸尿管癌[26]的有效方法。雖然輔助研究有限，但它們仍然顯示了這種方法的潛力。因此，在本研究中，我們還研究了低劑量(亞臨床)順鉑聯合輕度冷凍治療對膀胱癌細胞破壞的影響。選擇順鉑進行聯合研究，因為它在臨床上經常用於治療膀胱癌，無論是單獨使用還是與其他化療藥物聯合使用。順鉑治療膀胱癌的臨床劑量為35 ~ 100 mg/m²9[3.1µM]。考慮到高劑量化療會引起有害的副作用並影響患者的生活質量，在本研究中，我們選擇調查低劑量順鉑[1至1.75µM(例如11至19 mg/ M)]的影響²)]結合冷凍，作為限製藥物暴露相關副作用的潛在途徑。我們的假設是，低劑量順鉑預處理會使膀胱癌細胞變得敏感，因此當結合輕度冷凍(-15°C)時，在藥物或單獨冷凍產生最小或沒有影響的條件下，可以實現細胞的完全破壞。

這在體外該研究旨在作為膀胱癌對冷凍敏感性的第一步調查，並評估亞臨床劑量順鉑與冷凍聯合使用的潛在益處。本文詳細的結果表明，將膀胱癌細胞暴露在>-25°C的單一冷凍事件中，會導致細胞完全破壞而無法恢複。重複冷凍或兩次冷凍可使最低致死溫度升高至>-20°C。此外，低劑量順鉑和單次冷凍暴露聯合使用可使最低致死溫度升高至-15°C。

材料與方法

細胞培養

膀胱癌細胞，SCC(鱗狀細胞癌);ATCC HTB-3)和UMUC3(移行細胞癌;ATCC CRL 1749)，在T-75瓶(Cell Treat, Shirley, MA, USA)中EMEM (ATCC 30-2003)中培養，並添加10%胎牛血清(Peak Serum, PS bf -3)和1%青黴素/鏈黴素(Lonza)。使用TrypLE Express (Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY)提取細胞，離心並鍍入Costar條帶孔板(Corning, Tewksbury, MA, USA)，每孔10,000個細胞，實驗前培養2天。

順鉑治療

順鉑(順-二氯二胺鉑(II)， SigmaAldrich #479306，聖路易斯，密蘇裏州)在每次使用前在無菌水中新鮮製備，並稀釋至最終亞臨床濃度為1µM (11.6 mg/ M)²)或1.75 μ M (19.5 mg/ M²)。樣品在冷凍前暴露於單次應用順鉑24小時或30分鍾。

凍結協議

Costar 8孔樣品條(75 μ L介質/孔)在冷凍循環浴(Neslab/Thermo Scientific, Waltham, MA)中暴露於-10°C， -15°C， -20°C或-25°C的冷凍溫度中5分鍾。冷凍前30分鍾，抽吸培養基，每孔換取75µL合適的培養基。條帶被放入鋁塊中，其中含有一層薄薄的乙醇塗層，以促進在浴槽內與每口井的完全接觸和熱交換。為了防止過冷，在-2°C使用液氮蒸汽開始冰形核。使用T型熱電偶(Omega HH806AU, Omega, Stamford CT)每隔1秒記錄樣品溫度。對於單次冷凍條件，樣品在冷凍浴中保持總時間5分鍾，在層流罩下在室溫下被動解凍10分鍾，然後放置在37℃進行回收和評估。對於重複(兩次)冷凍條件，樣品保持5分鍾，被動解凍10分鍾，然後再次冷凍5分鍾(5/10/5協議)。第二次冷凍間隔後，樣品在室溫下被動解凍10分鍾，然後置於37°C中進行回收和評估。

可行性評估

利用代謝活性指標alamarBlue (Invitrogen, Carlsbad CA)評估細胞活力。原液alamarBlue在Hank’s平衡鹽溶液(HBSS, Corning/Mediatech)中1:20稀釋，並在37°C下應用於樣品60分鍾(±1分鍾)。使用TECAN Infinite平板閱讀器(激發530nm，發射590nm, TECAN奧地利GmBH, Grodig，奧地利)獲得原始熒光單元，並使用Microsoft Excel進行分析。原始熒光單位轉換為基於凍結前控製值(±SEM)的百分比。評估在恢複的第1、3、5和7天進行。每種條件下至少進行3次實驗重複，其中7孔的實驗重複(n≥21)。采用單因素方差分析，以p < 0.01為顯著性閾值。

細胞死亡評估

采用Cell Event Green (ThermoFisher, C10423)和SytoxRed (ThermoFisher, S11380)評估細胞在冷凍後4小時、1天、3天和5天死亡的模式(分別為凋亡和壞死)和時間。細胞事件綠(caspase 3/7激活)用於評估凋亡受累，而Sytox紅表示壞死。樣品在37°C用5µM Cell Event在1X PBS中孵育30分鍾，然後用500 nM Sytox Red在37°C孵育15分鍾。樣品用3µg/mL Hoechst 33342 (Invitrogen, H3570)在1X PBS中反染，然後在1X PBS中洗滌5分鍾。然後使用Cell Insight CX5高含量篩選平台(ThermoFisher)，使用目標激活分析協議對樣品進行分析。每種條件至少進行3次重複實驗，3孔內重複實驗(n≥9)，采用單因素方差分析(單因素方差分析)分析差異是否有統計學意義。

結果

膀胱癌細胞單次冷凍暴露反應

為了確定膀胱癌的最低致死溫度，將sscarer和UMUC3細胞分別在-10°C、-15°C、-20°C或-25°C冷凍5分鍾，解凍，允許在培養中恢複，並評估初始細胞活力(24小時)以及7天內的恢複。對scer樣本的分析顯示，暴露於-10°C單次冷凍後，死亡率最低(圖1A)。暴露於-15°C導致scer在冷凍後第1天存活率顯著下降至16%(±1.0)。然而，發現存活的細胞在第7天迅速恢複到84%(±2.2)。暴露於-20°C導致scer存活率進一步降低至凍結後1天的2%(±0.1)。在解凍後7天的分析間隔內觀察到低但顯著的再生水平(D7=7%(±0.8)vs. D1=2%(±0.2);P < 0.01)。當scar細胞在-25°C單次冷凍處理時，觀察到細胞在第1天完全死亡，在7天的恢複期內沒有發現再生(D1存活率=0.2%(±0.01)，D7=0%(±0.1)，p> 0.5)。

圖1:評估膀胱癌細胞活力和恢複後的單一凍結事件。
scer (A)細胞分別在-10、-15、-20和-25°C冷凍5分鍾，並在治療後7天內評估存活情況。數據表明，暴露於-25°C後，細胞完全死亡而沒有恢複，而-15°C和-20°C暴露導致大量細胞死亡，然後在培養中恢複。

使用UMUC3細胞係(TCC)的研究得出了與sscarer研究相似的結果。在-10°C的單次冷凍中，細胞死亡率最低，-15°C導致第1天存活率為22.8%(±0.3)，到第7天存活率增加到97.5%(±1.1)(圖1B)。暴露於-20°C導致第1天存活率進一步下降，第7天恢複水平較低(D1=3.2%(±0.2)vs. D7=17.3%(±0.7);P<0.01)，而暴露在-25°C時，細胞完全死亡，沒有恢複。這些實驗的結果表明，對於單個冷凍發作，膀胱癌(SCC和TCC)的最低致死溫度為-25°C。

圖1 b:評估膀胱癌細胞活力和恢複後的單一凍結事件。
UMUC3 (B)細胞分別在-10、-15、-20和-25°C冷凍5分鍾，並在治療後7天內評估存活情況。數據表明，暴露於-25°C後，細胞完全死亡而沒有恢複，而-15°C和-20°C暴露導致大量細胞死亡，然後在培養中恢複。

膀胱癌細胞重複(雙)冷凍暴露反應

在確定-25°C對scar和UMUC3細胞完全致死後，進行了研究，以評估重複(兩次)冷凍暴露對細胞活力和恢複的影響。為此，將樣品暴露在-10°C、-15°C和-20°C重複冷凍。重複冷凍暴露(兩次5分鍾冷凍)至-10°C產生的結果與單次冷凍暴露在scar或UMUC3細胞中觀察到的最小細胞死亡相似(圖2)。在UMUC3樣本中，存活率最初下降至67.9%(±2.6)。然而，這些樣品在第5天恢複到控製水平。與單次冷凍暴露相比，在-15°C重複冷凍導致scer和UMUC3樣品在冷凍後第1天的細胞死亡顯著增加(重複與單次= scer: 2.8%(±0.3)vs. 16%(±1)，P<0.01;UMUC3: 4.7%(±0.3)vs. 22.8%(±0.3)，P<0.01。重複-15°C的樣品發現，在7天的恢複間隔內，回收率約為20% (D7: sper: 19.1%(±3.7);UMUC3: 21.5%(±1.3))。雖然這種恢複輕微，但與兩種細胞類型的第1天存活率相比，這種恢複是顯著的(兩種細胞類型的D1 vs D7 P<0.01)。重複暴露於-20°C導致兩種細胞類型的細胞完全破壞，在7天評估間隔內沒有恢複。 The results from the double freeze experiments suggested that the repeat exposure results in an elevation of the minimal lethal temperature to around -20°C.

圖2:反複冷凍對膀胱癌細胞活力和恢複的影響。scer和UMUC3細胞分別在-10、-15、-20和-25°C冷凍兩次5分鍾(5/10/5)，並在治療後7天內評估存活情況。數據表明，在-20°C的雙重冷凍會導致膀胱癌細胞完全死亡，沒有恢複。兩次冷凍至-15°C導致細胞存活率顯著下降。然而，在7天的評估間隔內注意到低水平的恢複。

輔助順鉑和冷凍治療的影響

隨著對sscarer和UMUC3細胞破壞的最小致死溫度的確定以及重複冷凍時該溫度的升高，我們探索了低劑量順鉑預處理和冷凍聯合使用進一步增加細胞死亡的方法。考慮到暴露於-15°C後存活率顯著下降，隨後在7天的間隔內種群恢複，我們選擇研究順鉑和-15°C冷凍的組合。scer和UMUC3樣品在冷凍前暴露於低劑量順鉑24小時。順鉑劑量為1µM用於scar細胞，1µM和1.75µM用於UMUC3細胞。選擇這些劑量是因為劑量反應研究顯示，在7天評估期內，對細胞存活或恢複的負麵影響很小或沒有(數據未顯示)。scer細胞暴露於1 μ M順鉑中24小時，然後在-15°C (C/-15)單獨冷凍，與單獨-15°C冷凍(-15)樣品相比，細胞死亡增加(C/-15: 10.5%(±0.8)vs. -15: 16%(±1.1);P<0.01)(圖3A)。雖然在冷凍後第1天存活率顯著下降，如在-15°C僅冷凍條件下，發現順鉑/-15°C樣品在7天間隔內恢複，但恢複程度遠低於僅冷凍樣品(D7: C/-15: 33%(±5.4)vs. -15: 84%(±2.2);P < 0.01)。由於在順鉑±15°C樣品中注意到回收率，因此進行了實驗，檢查在-15°C (-15R)重複冷凍結合順鉑預處理(C/-15R)的影響。 These studies revealed similar day 1 survival to repeat freeze alone at -15°C (C/-15R: 4.4% (±1.4) vs. -15R: 2.8% (±0.3), P=0.3). Interestingly, SCaBER samples exposed to cisplatin and repeat -15°C freezing did not recover over the 7 day assessment period whereas the repeat freeze only samples did (D7: C/- 15R: 3.7% (±1.2) vs, -15R 19.1%(±7.2); P<0.01).

圖3:小劑量順鉑輔助預處理聯合冷凍對膀胱癌細胞存活的影響。用亞臨床劑量(1 μ M或1.75 μ M)順鉑對scer (A)和UMUC3 (B)細胞進行30分鍾的24小時預處理，然後在-15°C冷凍5分鍾。治療後7天內評估細胞存活和恢複情況。數據表明，順鉑30分鍾預處理和-15°C冷凍聯合使用可導致膀胱癌細胞完全死亡。雖然效果不如30分鍾預處理，但與單獨冷凍樣品相比，24小時順鉑預處理顯示冷凍後細胞恢複下降。

聯合研究使用順鉑24小時預處理，然後將UMUC3細胞係暴露於-15°C，得到與sscarer樣品相似的結果。UMUC3細胞單獨暴露於順鉑(1 μ M或1.75 μ M) 24小時後，細胞死亡率最低(圖3B)。當1 μ M順鉑處理後-15°C冷凍，與僅冷凍樣品相比，第1天細胞存活率略有下降(C/-15: 20%(±0.5)vs -15: 22.8%(±0.3);P = 0.006)。與第1天相似，第7天的分析顯示，與單獨冷凍相比，順鉑/冷凍聯合條件下的樣品回收率顯著降低(C/-15: 62.4%(±2)vs. -15: 97.5%(±1.1)，P<0.01)。1.75 μ M順鉑預處理24小時，然後冷凍至-15°C (C1.75/-15)，結果與1 μ M順鉑/冷凍和單獨冷凍樣品相似(C1.75/-15: 19.4%(±1.0)vs. C/-15: 20(±0.5)vs. -15: 22.8%(±0.3))。有趣的是，與1 μ M順鉑/冷凍樣品相比，在7天間隔內，順鉑增加到1.75 μ M導致細胞恢複進一步降低(D7: C1.75/-15: 34.7%(±2.4)vs. C/-15: 97.5%(±1.1);P < 0.01)。

圖3 b:小劑量順鉑輔助預處理聯合冷凍對膀胱癌細胞存活的影響。用亞臨床劑量(1 μ M或1.75 μ M)順鉑對scer (A)和UMUC3 (B)細胞進行30分鍾的24小時預處理，然後在-15°C冷凍5分鍾。治療後7天內評估細胞存活和恢複情況。數據表明，順鉑30分鍾預處理和-15°C冷凍聯合使用可導致膀胱癌細胞完全死亡。雖然效果不如30分鍾預處理，但與單獨冷凍樣品相比，24小時順鉑預處理顯示冷凍後細胞恢複下降。

順鉑暴露時間間隔對細胞存活的影響

基於冷凍至-15°C前24小時暴露於低劑量順鉑的益處，我們調查了將冷凍前24小時暴露間隔縮短至30分鍾的影響。與24小時暴露一樣，對scer和UMUC3樣品單獨暴露30分鍾導致最小的細胞死亡(圖3A和3B;30分鍾)。在-15°C冷凍後，scer樣本暴露30分鍾後，其存活率與單獨冷凍樣品相似(17.9%(±1.8)vs. 16%(±1.1)，P>0.05)，與24小時前處理樣品相比，第1天的存活率增加(17.9%(±1.8)vs. 10.7%(±0.8);P = 0.008)。對7天恢複間隔的分析顯示，雖然30分鍾暴露順鉑樣品的初始生存期大於24小時暴露，但在7天間隔內，30分鍾暴露/-15°C樣品的生存期下降(D1: 17.9%(±1.8)vs. D7: 9.3%(±2.6);P < 0.01;圖3 a)。這與24小時暴露/-15°C的樣品顯著不同，後者被發現在7天恢複間隔內重新填充。對30分鍾順鉑暴露後在-15°C重複冷凍的影響進行分析，發現細胞存活率最低，在7天評估間隔內沒有恢複。 This was similar to the 24 hour cisplatin/-15°C repeat freeze condition yet differed from the -15°C alone samples.

UMUC3樣品在-15°C冷凍前暴露順鉑30分鍾的分析顯示了與scar樣品相似的結果。暴露於1 μ M順鉑30分鍾後冷凍，其第1天存活率與單獨冷凍和24小時順鉑/- 15°C樣品相似(分別為25.2%(±1.3)vs. 22.8%(±0.3)和20.1%(±0.5))(圖3B)。對7天恢複間隔的分析顯示，與scar樣品一樣，UMUC3樣品暴露於順鉑30分鍾，然後冷凍至-15°C，細胞存活出現平台期(D7: 31.5%(±2.7)vs. D1: 25.2%(±1.3)，P<0.01;圖3 b)。將順鉑濃度增加到1.75 μ M，暴露30分鍾，然後冷凍，結果與1 μ M樣品的第1天生存率相似(分別為25.0%(±1.4)vs. 25.28%(±1.3))。然而，在7天的評估間隔內，1.75 μ M順鉑/-15°C樣品的存活率下降，這與1 μ M組合樣品的平台期不同。在1µM和1.75µM 30分鍾順鉑/-15°C冷凍樣品的恢複間隔內，存活率的穩定/下降與24小時順鉑/-15°C組合或15°C單獨樣品的恢複間隔顯著不同，後者都被發現再生。

冷凍後細胞死亡模式的評估

在-15°C和順鉑預處理聯合使用後，scer細胞死亡增加，同時在5天恢複期內觀察到樣本活力下降，通過熒光圖像分析評估細胞死亡模式和時間。為此，將scer樣本冷凍至-15°C冷凍，並在冷凍後4小時、1天、3天和5天用Cell Event Green(細胞凋亡)和Sytox Red(壞死)進行分析(圖4)。定量圖像分析顯示，在整個評估期間，未處理對照組和順鉑對照組的壞死水平較低，細胞凋亡極少(圖4B)。解凍4小時後-15°C樣品分析顯示極少壞死和凋亡(分別為4.1%(±1.6)和2.4%(±0.7))。第1天的分析顯示，與4小時和未治療的對照組相比，壞死人群顯著增加至40.8%(±13.7)(P<0.01)。壞死數量持續增加，治療後第3天達到峰值，為85%(±5.4)，第5天下降到54.8%(±17.0)。僅在-15°C冷凍樣品中，凋亡活性在任何時間點均未觀察到顯著變化。對順鉑/-15°C組合樣品的分析顯示，在冷凍後4小時和1天，與-15°C組合樣品的壞死和凋亡水平相似。雖然冷凍後4小時和第1天的情況相似，但冷凍後3天的分析顯示，與單獨冷凍相比，聯合樣本的壞死增加。重要的是，在第5天，聯合樣本的壞死水平維持在較高水平(81.9%(±13.4))，而僅冷凍樣本的壞死水平顯著下降(54.8%(±17.0)(P<0.01)。

圖4:有順鉑預處理和無順鉑預處理後-15°C冷凍後細胞死亡模式分析將scar細胞暴露於-15°C冷凍5分鍾，使用或不使用順鉑(1µM)預處理30分鍾，然後分別使用CellEvent Green、SytoxRed和Hoechest評估凋亡、壞死和活細胞(a)。定量圖像分析顯示，兩個樣本在冷凍後1-3天壞死顯著增加。重要的是，在順鉑/-15°C樣品中，壞死水平更高，持續時間更長，導致細胞死亡增加(B)。

討論與結論

本研究調查了兩種膀胱癌細胞係在冷凍損傷後的生存反應，以確定完全破壞細胞所需的最低致死溫度(劑量)以及兩次冷凍暴露的影響。這些研究是由於冷凍消融經常用於重複(兩次)冷凍治療許多癌症，包括前列腺癌、腎癌和肝癌[11-14,16,27]。這一劑量信息可能對未來應用冷凍消融治療膀胱癌發揮重要的指導作用，使其能夠擴大應用，同時降低與過度冷凍相關的負麵副作用的風險。此外，還對低劑量(亞臨床)順鉑預處理聯合輕度冷凍(-15°C)的影響進行了調查，因為許多研究詳細說明了輔助藥物/冷凍在作為單一治療(冷凍或單獨藥物)不致命的條件下增強癌症殺傷(提高最低致死溫度)的益處[16,22-25,28-38]。

研究使用兩種不同的分子變異膀胱癌細胞係(scaper和UMUC3)進行。scar細胞係來源於鱗狀細胞癌，代表一種侵襲性基底肌浸潤性膀胱癌(MIBC)，而UMUC3細胞係代表一種移行細胞癌(TCC)，是一種中高風險的癌症。先前的研究表明，來自同一組織的不同分子變體的癌症對輕度冷凍的反應不同，從而影響最低致死溫度[16,21,27]。例如，在前列腺癌中，研究表明雄激素受體表達的喪失(從激素反應性癌症轉變為無反應性癌症)或整合素表達的增加可導致對冷凍的耐受性增加，將最低致死溫度從-25℃轉移到-40℃[21,39]。此外，研究表明，與非癌症細胞相比，癌細胞一般具有更高的冷凍耐受性[27,40]。因此，scaper和UMUC3細胞係被用來確定在膀胱癌中是否觀察到冷凍反應的差異。

初始冷凍劑量反應研究檢測了膀胱癌細胞暴露在-10°C至-25°C溫度下的存活情況。這些研究表明，scer (SCC)和UMUC3 (TCC)細胞在-25°C冷凍5分鍾後完全被破壞，而暴露在-10°C時，細胞幾乎沒有死亡(圖1A和1B)。單次冷凍暴露於-15°C和-20°C的中間溫度導致細胞在冷凍後1天內大量死亡。然而，在治療後7天的評估間隔內，兩種細胞類型都被發現從這種治療中恢複。由於臨床上經常使用雙重冷凍方案進行冷凍消融，因此使用重複冷凍方案進行冷凍反應研究，即兩次5分鍾冷凍加中間10分鍾解凍(5/10/5)。這些研究表明，雙重冷凍的應用導致細胞死亡增加，暴露於-15°C後樣本再生減少(圖2)。重要的是，雙重冷凍方案的應用導致細胞在-20°C下完全死亡(最低致死溫度的升高)。最小致死溫度升高5℃具有顯著意義，因為當與已公布的由氬基JT冷凍係統產生的典型冰球的等溫分布相關時，其破壞體積從凍結質量的~36%轉移到~48%，破壞體積增加了~25%[41-43]。

大量研究詳細說明了在包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌和肝癌等多種癌症中，在低劑量化療、營養藥物或其他藥物的預處理下進行冷凍消融的輔助治療的益處[24,25,28- 36]。體外實驗和在活的有機體內涉及前列腺癌的研究表明，通過亞臨床(無毒)劑量的5-氟西爾、泰索蒂和順鉑的預處理，能夠將激素難治性前列腺癌的最低致死溫度從-40°C提高到-20°C[24,28,33]。其他研究已經證明了使用活性營養劑骨化三醇(維生素D)的組合方法_3.)可導致前列腺癌的最低致死溫度升高至-10至-15°C範圍[22,23,37,38]。基於這些報道和目前順鉑作為膀胱癌的主要治療方法的使用，我們研究了低劑量順鉑預處理與輕度冷凍相結合的潛力。

順鉑的抗腫瘤作用是通過鏈內和鏈間交聯破壞DNA。這些DNA加合物幹擾DNA複製和轉錄，激活細胞內的各種DNA修複機製。當修複不能執行時，DNA損傷誘導的細胞應激激活線粒體介導的凋亡通路[44]。將細胞冷凍到能反映低溫病變外圍的溫度(-10°C至-25°C)也被證明可誘導內在凋亡途徑[45,46]。因此，我們假設冷凍和順鉑的組合會放大細胞死亡信號，從而增加破壞。考慮到化療通常是在可行的情況下對膀胱進行局部治療，低劑量順鉑和冷凍消融術的聯合可能是改善預後的有力策略，即使是在癌症類型更嚴重的患者中。選擇冷凍前30分鍾和24小時的暴露時間，因為這些時間與臨床相關，方便，暴露時間短，可進一步縮短暴露間隔。在本研究中，我們研究了11和19 mg/m的順鉑劑量²(1和1.75 μ M)，代表典型臨床劑量範圍(35-100 mg/ M)的1/3至1/8²)治療膀胱癌[8]。亞臨床劑量的研究是為了增加癌症對凍傷的易感性，同時減少或消除與化療相關的負麵毒副作用。

在冷凍至-15°C前24小時用順鉑預處理scer和UMUC3群體，與單獨冷凍相比，在冷凍後第1天細胞存活率下降。然而，這些種群在7天的恢複間隔內開始重新繁殖(圖3A和3B)。24小時預處理和-15°C雙重冷凍的組合導致細胞完全破壞(圖3A)，在-15°C冷凍前將暴露時間縮短至30分鍾，導致scar和UMUC3細胞反應從最初死亡到恢複的轉變，如僅在-15°C和24小時順鉑/-15°C樣品中觀察到的那樣，向高度初始死亡和無再生(圖3A和3B)。有趣的是，在30分鍾1 μ M順鉑/-15°C scer和1.75 μ M/-15°C UMUC3樣品的情況下，在7天的恢複間隔內觀察到存活率的持續下降。這與任何其他情況不同，無論是最低限度的死亡(單獨使用順鉑)，還是最初死亡後恢複(-15°C, 24小時)。順鉑/-15°C)。對-15°C和順鉑/-15°C樣品的熒光圖像分析顯示，聯合治療導致壞死活性顯著增加，並持續了整個5天評估期(圖4A)。重要的是，第5天的分析顯示，與僅冷凍-15°C的樣品相比，順鉑/-15°C樣品的壞死活性增加了50%(圖4B)。我們假設在冷凍前立即應用順鉑(30分鍾)可能阻止了生存所必需的細胞修複機製的啟動，導致所觀察到的延遲細胞死亡，而在冷凍前24小時順鉑治療有足夠的時間執行DNA修複所需的信號通路，因此協同效應喪失。通過30分鍾順鉑預處理，然後在-15°C冷凍，將最小致死溫度轉移到-15°C是顯著的，因為當與由氬基JT冷凍係統產生的典型冰球的等溫分布相關時，表明破壞體積從凍結質量的~36%(-25°C等溫)轉移到~58%，破壞體積增加了~59%[41-43,47]。

總之，我們的研究結果表明，膀胱癌的最低致死溫度為-25°C。采用重複冷凍方案可將最低致死溫度提高至-20°C。研究發現，這些溫度對鱗狀細胞(scader)和移行細胞(UMUC3)癌細胞都是致命的在體外．低劑量順鉑聯合冷凍預處理可導致細胞死亡水平升高，並抑製存活細胞的再生。重要的是，低劑量順鉑預處理30分鍾後冷凍的組合在-15°C時造成了高度的破壞。數據表明，這一組合導致膀胱癌的最低致死溫度從-25°C轉移到-15°C範圍。推斷這些在體外調查結果在活的有機體內數據表明，單獨冷凍或聯合順鉑治療膀胱癌均可獲益。這反過來又有可能改善結果，同時減少與冷凍(膀胱壁穿孔，冷凍邊緣陽性)和化療(惡心，疲勞，易感染等)相關的共病，同時為膀胱癌提供有效的微創治療策略。結合之前的在體外而且在活的有機體內這些數據表明，單獨冷凍消融或聯合低劑量化療可能為膀胱癌的治療提供一種改進的途徑。

確認

作者要感謝MS . Gabrielle String, MS對本文數據采集的貢獻。

聲明

資金

這項研究部分得到了美國國立衛生研究院授予CPSI生物技術公司的1R43CA210761-01A1的資助。

利益衝突

JMB, KLS, KKS和RVB是CPSI生物科技的員工。日本政府、AK和AC沒有相互競爭的利益。

作者的貢獻

KLS、JMB和KKS完成了本研究的所有實驗設計、實驗和數據分析。AK和AC對項目進行了審查，並提供了反饋和指導。RVB和JGB進行數據和實驗設計評審，並協助數據解釋。JMB和KLS準備了初稿。JMB、KLS、KKS、RVB、AK、AC、JGB對稿件進行了審閱和修改輸入。所有作者都閱讀並批準了最終的手稿。

數據和材料的可用性

支持本研究結果的數據可從CPSI生物技術公司獲得，但這些數據的可用性受到限製，這些數據是在當前研究的許可下使用的，因此不能公開。然而，在CPSI生物技術公司的許可下，作者可以在合理的要求下獲得數據。

參考文獻

1. Alifrangis C, McGovern U, Freeman A, Powles T, Linch M(2019)晚期膀胱癌的分子和組織病理學指導治療。Nat Rev Urol 16: 465-483。［Ref。］
2. 膀胱癌:統計數據。［Ref。］
3. 膀胱癌統計。世界癌症研究基金會。［Ref。］
4. Siegel RL, Miller KD, Jemal A(2019)癌症統計，2019。CA癌症雜誌69:7-34。［Ref。］
5. 美國癌症協會，膀胱癌的存活率。［Ref。］
6. KD Sievert, B Amend, U Nagele, D Schilling, J Bedke等(2009)膀胱癌的經濟方麵:收益和成本是什麼?世界泌尿雜誌27:295-300。［Ref。］
7. holader N, Krapcho M, Miller D, Brest A, Yu M等(2019)SEER癌症統計綜述，1975-2016。貝塞斯達國家癌症研究所。［Ref。］
8. 美國癌症協會(2019)膀胱癌:治療方案。［Ref。］
9. Goel S, Sinha RJ, Bhaskar V, Aeron R, Sharma A，等。(2019)吉西他濱和順鉑作為肌肉浸潤性膀胱癌新輔助化療的作用:過去十年的經驗。中國泌尿學雜誌6:222-229。［Ref。］
10. Grossman HB, Bellmunt J, Black PC(2019)生物標誌物能否指導T2膀胱癌新輔助化療的使用?歐洲泌尿科雜誌2:597-602。［Ref。］
11. Babaian RJ, Donnelly B, Bahn D, Baust JG, Dineen M，等(2008)冷凍手術治療局限性前列腺癌的最佳實踐聲明。中華泌尿外科雜誌180:1993-2004。［Ref。］
12. Wagstaff P, Ingels A, Zondervan P, de la Rosette JJ, Laguna MP(2014)腎細胞癌的熱消融治療:一項全麵綜述。Curr Opin urrol 24: 474-482。［Ref。］
13. Hinshaw JL, Lee FT(2007)肝癌冷凍消融術。技術血管間隔放射10:47-57。［Ref。］
14. Bland KL, Gass J, Klimberg VS(2007)射頻、冷凍消融和乳腺癌消融的其他方式。北部外科診所87:539-550。［Ref。］
15. Baust JG, Snyder KK, Santucci KL, Robilotto AT, Van Buskirk RG，等(2019)冷凍消融:物理和分子基礎與假定的免疫後果。國際熱療雜誌36:10-16。［Ref。］
16. Baust JG, Bischof JC, Jiang-Hughes S, Polascik TJ, Rukstalis DB，等。(2015)重新利用冷凍消融:一種用於組織破壞的組合“療法”。前列腺癌雜誌18:87-95。［Ref。］
17. 劉鬆，張玲，鄒玲，文華，丁強，等。(2016)冷凍消融作為經尿道膀胱腫瘤切除術輔助治療的可行性和安全性:初步研究。低溫生物學73:257-60。［Ref。］
18. 張青，張世偉，張順，王偉，趙曉智，等(2017)經會陰冷凍治療不可切除的肌肉浸潤性膀胱癌:7例男性患者的初步經驗。BMC Urol 17: 81。［Ref。］
19. 孫玲，張偉，劉浩，袁傑，劉偉等。(2014)計算機斷層成像引導下經皮氬氦冷凍消融治療肌肉浸潤性膀胱癌32例初步體會。低溫生物學69:318-322。［Ref。］
20. 鄭亮，尹飛，倪麗芝，趙建英，鄭誌凱，等。(2014)經皮冷凍治療轉移性膀胱癌23例臨床體會。低溫生物學68:79-83。［Ref。］
21. Klossner DP, Baust JM, VanBuskirk RG, Gage AA, Baust JG(2008)雄激素受體表達對前列腺癌細胞冷凍反應的影響。BJU Int 101: 1310-1316。［Ref。］
22. Santucci KL, Snyder KK, Baust JM, Van Buskirk RG, Mouraviev V等(2011)在小鼠前列腺癌模型中使用1,25 α -二羥基維生素D3作為冷凍增敏劑。前列腺癌與前列腺疾病14:97-104。［Ref。］
23. Baust JM, Klossner DP, Robilotto A, Vanbuskirk RG, Gage AA，等(2012)維生素D冷凍敏化通過線粒體介導的凋亡和壞死增加前列腺癌對冷凍消融的易感性。BJU Int 109: 949-958。［Ref。］
24. Clarke DM, Baust JM, Van Buskirk RG, Baust JG(2004)添加抗癌藥物可增強冷凍誘導的前列腺癌細胞死亡:線粒體參與的意義。低溫生物學49:45-61。［Ref。］
25. 袁峰，周偉，張傑，張震，鄒超，等。(2008)抗癌藥與冷凍協同誘導肝癌細胞凋亡。低溫生物學57:60-65。［Ref。］
26. Rigondet G(1984)膀胱腫瘤冷凍療法。Prog臨床生物學雜誌162B: 355-358。［Ref。］
27. Klossner DP, Robilotto AT, Clarke DM, VanBuskirk RG, Baust JM，等(2007)冷凍外科技術:使用人類前列腺癌模型係統評估基本變量。低溫生物學55:189-199。［Ref。］
28. Clarke DM, Robilotto AT, VanBuskirk RG, Baust JG, Gage AA。(2007)通過TRAIL和冷凍消融靶向誘導細胞凋亡:一種治療前列腺癌的新策略。前列腺癌雜誌10:175-184。［Ref。］
29. Valérie Foresta, Michel Peoc 'hab, Claude Ardietc, Lydia Camposa, Denis Guyotata, et al. (2005)在活的有機體內人類肺癌模型的冷凍化療。低溫生物學51:92-101。［Ref。］
30. Forest V, Peoc 'h M, Campos L, Guyotat D, Vergnon JM(2006)在非小細胞肺癌模型中，冷凍療法和化療聯合治療對腫瘤生長和晚期冷凍誘導血管生成的益處。肺癌54:79-86。［Ref。］
31. 池川，石原，田中，池田(1985)小鼠腫瘤係統冷凍化療的基礎研究。低溫生物學22:477- 483。［Ref。］
32. 蔣娟，王誌強，王誌強，等。(2008)腫瘤壞死因子誘導低溫損傷的發生機製在體外而且在活的有機體內．Mol Cancer Ther 7: 2547-2555。［Ref。］
33. 李誌強，李誌強，李誌強，等。(2004)超聲引導聯合冷凍消融和微囊化5-氟尿嘧啶對人前列腺腫瘤生長的抑製作用。techl Cancer Res treatment 3: 135-142。［Ref。］
34. Mir LM, Rubinsky B(2002)冷凍化療治療癌症。癌症雜誌86:1658-1660。［Ref。］
35. 範文傑，李誌剛，李誌剛(1999)在活的有機體內抗凍蛋白輔助冷凍手術的研究。低溫生物學38:169-175。［Ref。］
36. 王春玲，韓斌(2008)氨基酸佐劑增強MCF-7乳腺癌細胞低溫損傷的研究。低溫生物學57:52-59。［Ref。］
37. 木村M, Rabbani Z, Mouraviev V, Tsivian M, Caso J，等。(2010)維生素D作為小鼠前列腺癌模型冷凍消融的敏化劑作用:初步體內研究。泌尿外科雜誌76:764。e14燈頭- 764. - e20。［Ref。］
38. Santucci KL, Baust JM, Snyder KK, Van Buskirk RG, Baust JG等(2018)在前列腺癌模型中，維生素D3劑量增加產生與單劑量暴露相似的冷凍手術結果。癌症控製25。［Ref。］
39. Baust JG, Klossner DP, Vanbuskirk RG, Gage AA, Mouraviev V等(2010)整合素參與雄激素不敏感型前列腺癌的抗凍性。前列腺癌前列腺雜誌13:151- 161。［Ref。］
40. 陳誌強，陳誌強，陳誌強，等。(2007)腎癌冷凍消融與細胞死亡的關係。科技癌症雜誌治療6:69 -79。［Ref。］
41. Baust JM, Robilotto A, Snyder KK, Santucci K, Stewart J等。(2017)利用3D組織工程癌症模型評估冷凍手術設備性能。Technol Cancer Res治療16:900-909。［Ref。］
42. Littrup PJ, Jallad B, Vorugu V, Littrup G, Currier B，等。(2009)幻影研究中冷凍消融的致死等溫線:熱負荷、探針尺寸和數量的影響。血管間隔放射20:1343-1351。［Ref。］
43. Shah TT, Arbel U, Foss S, Zachman A, Rodney S，等。(2016)在一種基於凝膠的新型模型中建模冷凍治療冰球尺寸和等溫線，以確定臨床實踐中潛在使用的最佳冷凍針配置和設置。泌尿外科91:234- 240。［Ref。］
44. Basu A, Krishnamurthy S(2010)順鉑誘導的DNA損傷的細胞反應。J Nucleic Acids 2010: 201367。［Ref。］
45. Robilotto AT, Baust JM, Van Buskirk RG, Gage AA, Baust JG(2013)人類前列腺癌模型冷凍消融過程中差異凋亡通路的溫度依賴性激活。前列腺癌雜誌16:41-49。［Ref。］
46. 楊偉林，楊偉林，陳誌明，陳誌強，陳誌強(2003)低溫損傷誘導人結直腸癌細胞凋亡與線粒體功能障礙的關係。國際癌症雜誌103:360-369。［Ref。］
47. Robilotto AT, Santucci KL, Snyder KK, Van Buskirk RG, Baust JM，等(2019)使用前列腺癌和腎癌組織工程模型評估新型超臨界氮冷凍手術設備。醫療器械診斷工程5:1 -8。［Ref。］

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Santucci KL, Baust JM, Snyder KK, Van Buskirk RG, Katz A，等。(2020)膀胱癌細胞對冷凍消融和輔助順鉑低溫/化療的反應研究。Clin Res Open Access 6(1): dx.doi.org/10.16966/2469-6714.154

版權:©2020 Santucci KL等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可的條款發布，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是要注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2019年12月20日

接受日期:2020年1月30日

發表日期:2020年2月7日