摘要

背景:這項研究調查了主要抗氧化基因GCLM和GPX4單核苷酸多態性是否與哈薩克斯坦人的缺血性心髒病有關。

方法與結果:我們評估了166例缺血性心髒病患者和172名56歲(42 - 63歲)的健康受試者。所有受試者均在3'UTR區域存在GCLM基因啟動子多態性-588C/T和GPX-4 718C/T (rs713041)基因分型。采用多元邏輯回歸分析評估年齡、性別、吸煙狀況和基因分型多態性之間的差異。在我們的研究中，GCLM -588TT基因型與一般種族混合組缺血性心髒病的風險顯著相關(OR=11.75, p=0.02);GPX4 718CC基因型在缺血性心髒病發生的普通組中也表現出較高的危險(OR=2.16, p=0.02)。

結論:GCLM -588TT多態性似乎是哈薩克斯坦缺血性心髒病患者的一個強有力的危險因素。

關鍵字

氧化應激;抗氧化劑;缺血性心髒病;風險因素

簡介

缺血性心髒病(IHD)是世界上最常見的死亡原因，也是住院的主要原因。眾所周知，IHD是一種多因素疾病，有多種病理狀態。與單基因缺陷引起的遺傳疾病不同，這種疾病的特征是基於遺傳和環境因素[1]相互作用的形成表型機製。根據目前對IHD發生機製的了解，有一組候選基因，其蛋白產物參與或可能參與IHD的發病機製。越來越多的證據表明，自由基(氧化應激)的大量產生和抗氧化蛋白的活性在IHD發生的條件中起著重要作用。當體內自由基的產生和抗氧化係統的活性不平衡時，就會發生氧化應激。在IHD病理條件下，這導致脂質過氧化物的形成，內皮細胞成分功能障礙，動脈粥樣硬化斑塊的發展和血小板聚集增加。

在哺乳動物細胞中，穀胱甘肽和穀胱甘肽過氧化物酶構成了主要的抗氧化防禦係統[3]。穀胱甘肽是最強大的抗氧化劑之一，但不是必需營養素，因為它可以在體內由氨基酸l -半胱氨酸、l -穀氨酸和甘氨酸生物合成。兩步atp依賴性反應的催化作用由兩種主要酶進行:穀氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)和穀胱甘肽合成酶(GSS)。第一種酶的生物利用度對生物體的發育和功能至關重要，因為它是穀胱甘肽生物合成中的限速酶。GCL是一種由兩種不同亞基組成的異二聚乙二醇酶，稱為催化亞基(GCLC)和修飾亞基(GCLM)。

第一亞基GCLC在解毒反應中具有主要的催化活性，而V_馬克斯反應的反應率很低，但通過加入第二亞基GCLM而增加。樹枝亞基由位於不同染色體上的兩個獨立基因轉錄而成。GCL的表達調控在GCLC和GCLM基因的轉錄水平上進行，而購買的基因在其啟動子/增強子區域包含假定的氧化應激反應元件(作為抗氧化反應元件(AREs))。一些病例對照研究表明，GCLC和GCLM啟動子多態性與心血管疾病的發展可能存在關聯。然而，這些與心血管疾病發展相關的多態性研究結果並不完整且相互矛盾，這在很大程度上歸因於這種多態性的分布和頻率存在種族異質性。

GPx4亞型是穀胱甘肽過氧化物酶家族中唯一一種能夠在磷脂和低密度脂蛋白中還原複雜的氫過氧化物並通過影響細胞因子介導的信號通路調節炎症的酶。GPx4基因在mRNA 3 '端未翻譯區域對應的一個延伸上的多態性是功能性的，目前在亞洲和歐洲人群[4]中發現。有證據表明，來自具有多態T等位基因的純合子攜帶者的內皮細胞對氧化應激的影響更敏感，並表現出更高水平的單核細胞粘附，這使它們更容易發生血管病變。然而，這種多態性與心血管疾病的發展及其在人群中的患病率之間的許多方麵仍然知之甚少，需要進一步的研究。

因此，本研究的目的是評估哈薩克斯坦人群中GCLM和GPX4多態性與IHD發展的關係。

材料與方法

研究主題。根據經驗豐富的醫學專家檢查IHD的臨床診斷和電生理數據，選擇“城市第一臨床醫院”心內科(阿拉木圖，哈薩克斯坦)和“哈薩克斯坦-俄羅斯醫科大學”的患者，研究遺傳危險因素在缺血性心髒病發展中的作用。收集了166名患者(平均年齡56歲(42-63歲))的血液樣本，並進行了詳細的問卷調查。參照患者組，取172例年齡、性別、民族相匹配的健康個體作為對照(表1)。對照組為無冠心病臨床表現、無動脈粥樣硬化家族史、心電圖無缺血性事件的健康個體。

基因組DNA分離和基因分型

使用Genomic DNA純化試劑盒»從冷凍樣品(-20°C)的外周血中分離DNA(Fermentas)．采用分光光度法測定DNA樣品的定性和定量特征(EppendorfBiophotometer +)．

我們研究了單核苷酸多態性- 588c /T和Leu220Leu (c. 718C/T)分別為GCLM和GPX4基因。在“Mastersycler”(Eppendorf)中采用PCR-RFLP法測定各多態性的基因型。在20µl PCR混合物中擴增50 ng目標基因組DNA，其中含有10µl 2 × PCR Master Mix (0.05 U/µl Taq DNA聚合酶，反應緩衝液，4 mM MgCl₂，每個dNTP (Thermo Scientific) 0.4 mM)和每個特定引物5 pM。放大多態Leu220低濃縮鈾我們設計了GPX4 - 220F 5 ' gagaaggacctgccccacta3 '和GPX4 - 220R 5 ' GTCATGAGTGCCGGTGGAAG3 '的引物。對於GCLM的-588°C/T多態啟動子區域，我們使用了Nakamura等人描述的引物和基因分型方案。PCR進行了35個循環，分別在95°C變性1 min，在61°C (GPX4)或60°C (GCLM)退火30秒，在72°C延伸1分鍾。為Leu220Leu(c. 718C/T) 96 bp PCR產物經StyI酶切後檢測，隨後用8%聚丙烯酰胺凝膠分析。TT基因型有68-、28 bp、TC - 96-、68-、28 bp和CC - 96 bp條帶。

統計分析

為了比較病例組和對照組之間變量的分布，使用了學生測試。根據標準Hardy-Weinberg平衡(HWE)計算等位基因頻率。相對風險係數的估計采用“比值比”(奇比- OR)方法，結合估計的95%置信區間(95% CI)和“卡方”檢驗(χ²)，則自由度為1。

使用軟件圖PadInstat™(V. 2.04)對相關性進行統計分析。Ralf Stahlman，普due大學)和基因專家公司(“GosNIIGenetika”俄羅斯聯邦國家科學中心，http://gen -exp.ru/calculator_or.php)的“病例對照研究估計計算器”。

結果

患者與對照組在年齡、性別、種族和吸煙狀況方麵無顯著差異。

GCLM -588C/ tangpx4基因型頻率Leu220Leu (c. 718C/T)如圖1所示．所研究多態性的基因型分布在HWE和對照組以及IHD患者中。為了解決已知抗氧化基因功能變異影響IHD風險的假設，通過使用一般、隱性和顯性模型評估數據，評估了單個snp與IHD風險的關聯。考慮到群體的種族異質性，對各類型多態性與ihd發展的關係進行了統計分析，包括全群體和主要族群。

表2顯示了采用一般遺傳模型計算的阿拉木圖(哈薩克斯坦)一般人群和主要民族中多態性GCLM和GPX4對IHD發展的相對風險影響。

多元通用模型顯示，GCLM -588TT基因型與IHD發病風險顯著相關(OR=11.75)。顯性模型證實了這一點，基因型TT與CC+CT也具有較高的關聯風險(OR=11.75, 95%CI=0.64 ~ 214.19， χ²= 5.26, p = 0.02)。

根據對主要族群的單獨分析，GCLM -588TT基因型與俄羅斯人IHD發病風險的增加密切相關(OR=10.32, CI 95%= 0.52-203.37， χ²=4.2, p=0.12)，隱性模型差異顯著(OR=10.32， χ²= 4.19, p=0.04);而對於哈薩克族，該基因型在研究組中不存在，並且在不同模型中沒有顯示出任何關聯。此外，僅根據隱性模型，哈薩克族-588CC基因型IHD的風險較高(OR=1.59， χ²= 3.45, p = 0.06)。

我們的統計資料顯示，普通組GPX4 718CC基因型與IHD的發展高度相關(OR=2.16, CI 95%=1.25 ~ 3.73， χ²=8.05, p=0.02)，認為隱性遺傳模型具有較強的顯著性水平(OR=2.16， χ²= 7.78, p = 0.005)。一般遺傳模型也顯示GPX4 718TC具有保護作用(OR=0.53)，但對TT基因型無保護作用(OR=1.05)。哈薩克組分析結果相似，GPX 718CC基因型也具有IHD的高危狀態(OR=2.48, CI 95%= 1.32-4.66， χ²=8.22, p=0.02)和隱性模型(OR=2.48， χ²= 8.22, p = 0.004)。相反，俄羅斯人TT基因型為IHD高危基因型(OR=2.88, CI 95%=0.11 ~ 74.24， χ²=0.95, p=0.62顯性模型;或χ= 2.88²=0.94, p=0.33隱性模型)，但這些數據無統計學意義。

表1:對照組和IHD患者的特征，分析GCLC、GPX4基因、多態性與IHD的關係

圖1:基因型多態性頻率:a) GPX4基因的Leu220Leu(約718C/T)(對照χ²= 57.62, p = 0;案例χ²=22.35, p<0.0001)， b) GCLM基因的for-588C/T(對照χ²= 16.31, p = 0.00005;案例χ²IHD患者與健康組比較，差異均為1.43,p=0.23)。

討論

2002年，Nakamura et al.[6]發現了GCLM的兩個啟動子多態性(5 ' -flanking region) -588 C/T和23 G/T，它們完全相連。他們還發現-588C/T多態性對該基因的氧化應激表達有功能性影響，特別是-588T等位基因攜帶者的血清gsh1水平較低，這可能是由於觀察到-588CT細胞中GCLM mRNA的表達比-588CC細胞低。他們的病例對照研究顯示-588T等位基因可能是日本[6]人群心肌梗死的獨立危險因素。他們進一步的研究表明-588T多態性對大的和抵抗性冠狀動脈中內皮依賴的血管舒縮反應性(異常低擴張效應或高收縮)有負麵影響，並可能影響冠狀動脈疾病的發展，認為血管細胞中GSH合成受損，從而增加對no介導的內皮血管舒縮功能受損的易感[7]。文獻中有少量關於該多態性在心血管疾病發展中的作用的進一步報道。Katakami等[8]顯示-588T基因型與2型糖尿病患者頸動脈內膜-中膜厚度顯著相關，是動脈粥樣硬化和進一步IHD和MI發展的有力預測因子[8]。但是，Nao to Katakami等人[9]中未發現該多態性對2型糖尿病心肌梗死的影響。此外，Muehlhause等人[10]在德國隊列[10]中也未發現C-588T多態性與IHD風險和程度的關聯。它強調關聯分析高度依賴於種族、年齡、等位基因頻率、疾病類型和抗氧化酶在每種疾病中的作用。

在我們的種族混合病例對照研究中，我們發現-588TT變異具有更高的IHD風險(OR=11.75)。對各民族的詳細分析顯示，隻有俄羅斯人出現這種趨勢(TT OR=10.32，尤其是TT與CC+CT相比)，但這些數據不具有統計學意義，這可能是由於該群體在混合人群中數量有限(病例(n)=25，對照組(n)=24)。對於哈薩克人來說，這種關聯沒有被觀察到，這在一項研究中強調了種族遺傳特異性。

根據GPX4基因的不同早期研究，一個同義多態性Leu220Leu (c. 718C>T)顯示了一個功能後果;有人提出它可能會影響獨特的蛋白質結合

GPX4 mRNA的3 '非翻譯區(3 ' utr)的特性(在硒化半胱氨酸插入序列(SECIS)內)，從而調節Gpx4通過形成gpx4mrna -蛋白複合物[11]進行合成。最初的研究通過測量不同718C/T基因型白細胞中的5-氧合酶(5-LOX)代謝物，證明了它對白三烯(LT)生物合成的功能。與718T和718T/C[12]相比，718C變體的LT水平升高。後來在表皮樣癌腫瘤細胞係[13]中也得到了類似的結果。這證實了GPX4 mRNA

(3'UTR)莖環區上調花生四烯酸代謝，對LT合成和隨後的炎症反應發展，包括血管血管擴張，在血管上皮損傷和動脈粥樣硬化的發展中起著重要作用。由於GPX4具有硒依賴性，研究發現718C/T載體中硒蛋白及其mRNA水平受硒供給和細胞類型的不同影響;停止硒飲食後，C型純合子的淋巴細胞中Gpx4濃度比t型更穩定;而T載體對硒飲食的反應不太敏感，而內皮細胞的數據顯示相反的結果[14,15]。一些病例-對照組報告顯示該多態性與疾病發展可能存在關聯:718C可增加乳腺癌[16,17]、結直腸癌[18]和原發性高血壓(EH)[19]患者的腦卒中(CS)的死亡風險。但這些數據似乎與GPX4功能數據研究相衝突:LOX-5代謝活躍且增加的718C變體表明與疾病有更高的關聯風險。在我們的病例對照研究中，基因型718CC在普通人群中也顯示出較高的HID風險(OR=2.16, CI 95%=1.25 ~ 3.73， χ²(OR=2.16, CI 95%=1.25 ~ 3.73， χ²= 7.78, p = 0.005)。單獨的種族分析顯示，哈薩克人和俄羅斯人有不同的關聯。哈薩克族718CC基因型與IHD總體相關顯著(OR=2.48, CI 95%=1.32 ~ 4.66， χ²=8.22, p=0.02)和隱性模型(OR=2.48, CI 95%=1.32 ~ 4.66， χ²= 8.22, p = 0.004)。俄羅斯人與IHD的相關性無統計學意義(TT基因型OR=2.88, CI 95%=0.11 ~ 74.24， χ²=0.95, p=0.62)，可能是本組人數較少，大病例對照組需要進一步研究。

綜上所述，目前的數據表明抗氧化基因GCLM -588TT和GPX-4 718CC中的兩個SNP與哈薩克斯坦混合人群的IHD相關，並可能證明了這些基因SNP在心血管疾病發展中的重要功能作用。但這些數據也顯示出族群間的異質性關聯，需要對每個族群的更大群體分別進行更詳細的研究。然而，目前的病例對照研究存在局限性。首先，IHD的發病機製非常複雜，涉及機體不同的抗氧化係統，GCLM和GPX4酶在該疾病中的具體作用機製尚不清楚。其次，沒有用於分析的附加脂質生化參數(低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和甘油三酯(TG))的數據;根據IHD的臨床表現和電生理資料選擇患者，無冠脈造影顯示動脈粥樣硬化分期發展。此外，在本研究中，我們沒有考慮患者的合並症，如高血壓、糖尿病等。第三，目前的樣本量對相互作用的檢測能力有限，需要進一步擴大樣本量，進一步研究所研究的多態性對IHD發展的遺傳影響。此外，其他GCLM和GPX4基因的多態性也可能影響GCLM而且GPX4酶活性及其對IHD發病機製的影響。

表2:病例對照研究中GCLM和GPX4多態性與IHD的相關性

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條信息

文章類型:研究文章

引用:王曉燕，王曉燕，王曉燕，等。(2015)哈薩克斯坦人群抗氧化基因GCLM和GPX-4多態性與缺血性心髒病發病的關係。clinin Res Open Access 1(1): doi: http://dx.doi.org/10.16966/2469-6714.104

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出版的曆史:

收到日期:2015年7月20日

接受日期:9月2015

發表日期:2015年9月14日