臨床與檢驗醫學

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研究文章
一種用於自動化化學分析儀的高通量通用維生素D測定方法

Fakhri B賽達莊元＊

美國加州波威市Gregg Ct 12889號Diazyme實驗室公司

*通訊作者:Chong Yuan, Diazyme Laboratories Inc.， Gregg Ct 12889, CA Poway, USA，電子郵件:chong.yuan@diazyme.com


摘要

越來越多的科學文獻已經表明了測量血清中25-OH維生素D水平的重要性(被認為是患者整體維生素D狀況的可靠指標)。自從第一個25-OH維生素D免疫測定法(40多年前)發展以來，25-OH維生素D血清水平的測定方法有了顯著改進。然而，與臨床環境中維生素D檢測的指數級需求相比，這些改進仍然滯後。事實上，目前25-OH維生素D的測定仍然很慢，通量低，仍然由有限的臨床實驗室進行。在這篇文章中，我們報道了一種快速測量血清25-OH維生素D的技術，隻使用兩種試劑，可以適應幾乎任何自動化分光光度化學分析儀。這項新技術使用聚苯乙烯(乳膠)納米顆粒，這些納米顆粒已被維生素d特異性抗體致敏。在最常見的臨床化學分析儀(Beckman AU680)上對這種新的25-OH維生素D測定法(即二酶EZ維生素D測定法)進行了廣泛的性能測試。結果表明，該方法靈敏、精確、線性、準確、快速(吞吐量超過600次/小時)。該方法已經獲得了美國食品和藥物管理局(FDA)的臨床使用批準，並得到了美國疾病控製和預防中心(CDC)的認證(準確性和精密度)。

突出了

  • 普通化學用雙試劑納米粒子基礎的25-OH維生素D測定法。
  • 分析已被驗證用於幾乎所有無處不在的化學分析儀。
  • 該方法每小時至少進行600次檢測，目的是使維生素D檢測常規化和負擔得起。

關鍵字

維生素D;Immuno-turbidimetry;納米顆粒;EZ維生素D測定

縮寫

25-羥基維生素D;VDBP:維生素D結合蛋白;1,25 -(OH) 2維生素D: 1,25 -二羥基維生素D;HPLC:高效液相色譜法;RIA:放射免疫分析法;LC-MS/MS:液相色譜串聯質譜法;CLIA:化學發光免疫分析法;酶免疫法;維生素D外部質量評估計劃

簡介

維生素D是一種類固醇衍生物，以多種形式存在，包括維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)[1]。人類無法合成維生素D2，隻能依靠從某些食物和維生素D補充劑中攝取。維生素D3由人的皮膚合成[1-4]。維生素D的活性形式(1,25 -(OH) 2維生素D)是通過兩個連續的酶催化羥化反應產生的:一個在肝髒(產生25-OH維生素D)，一個在腎髒(產生1,25 -(OH) 2維生素D)[2]。

科學家們普遍認為，25-OH維生素D水平(25-OH維生素D2和25-OH維生素D3的總量，也稱為總25-OH維生素D)是患者整體維生素D狀態最準確的臨床標誌物[5- 7]。此外，大量呈指數增長的科學研究已經將維生素D缺乏與各種疾病和生理障礙聯係起來，包括骨骼疾病、自身免疫疾病、糖尿病、傳染病、心血管疾病和癌症[5-12]。此外，由於實驗證據似乎表明維生素D受體基因多態性與某些患者的骨關節炎和椎間盤退變之間存在聯係，維生素D似乎也在這些疾病中發揮作用。因此，從21世紀初開始，美國內分泌學會等幾家機構就建議定期進行維生素D篩查，並解釋說，患有肥胖或骨質疏鬆症的患者，以及長期接受皮質類固醇治療或抗癲癇藥物的患者，維生素D缺乏的風險很高，因此應該定期進行維生素D檢測[7-10]。

目前25-OH維生素D的檢測方法僅限於LC-MS/MS、CLIA、HPLC和EIA[14-23]。盡管這些方法已經有了顯著的改進，現在可以實現自動化，但它們的吞吐量仍然很低。此外，這些方法通常需要專用設備和訓練有素的人員(即LC-MS/MS)。因此，有能力進行內部維生素D檢測的臨床實驗室數量仍然滯後。這是由於維生素D檢測無法在一般的臨床化學分析儀(用於進行常規的化學檢測，如葡萄糖、膽固醇等)上進行。由於這些限製，維生素D測試仍然是一種專業測試(隻由有限的幾個實驗室進行)，對患者、實驗室和保險公司來說仍然昂貴。

在這篇文章中，我們報道了一種簡單使用的，雙試劑，25-OH維生素D測定方法的開發，該方法被專門設計用於幾乎任何普通化學分析儀。由於其高通量和儀器無關的性能，這種納米顆粒基礎的檢測有望使維生素D檢測在臨床化學實驗室中更加普遍，並使所有利益相關方都能負擔得起。

材料和方法
原材料

用於納米粒子結合和試劑配方的化學物質來自Sigma-Aldrich。從Cerilliant中獲得維生素D衍生物和交叉反應物。生物標本來自ProMedDx。

設備

在貝克曼AU680分析儀(主分析儀)上廣泛測試了該方法的性能。性能進一步驗證了係列通用化學分析儀，包括Roche Modular P, Roche Cobas c501, Roche Cobas c701和Abbott Architect c8000。

試劑，校準器和控製裝置

該檢測試劑盒(即EZ維生素D檢測)包括兩種試劑(R1和R2)，一套5個校準器和一套2個對照。所有試劑、校準器和控製器都可以在2-8°C下使用並保持液體穩定，直到瓶/瓶上顯示的有效期為止。試劑R1包含擁擠劑，專有穩定劑和防腐劑。試劑R2含有納米粒子偶聯抗25- oh維生素D抗體和抗25- oh免疫複合物抗體，專有穩定劑和防腐劑。校準器和控製器由正常的人血清配製而成，並含有穩定劑和防腐劑，以滿足貨架期要求。

貝克曼AU680分析儀上的分析序列

貝克曼AU680全自動檢測序列描述如下。實驗開始時，依次加入3µL的血清樣品和160µL的試劑R1，然後在37°C下混合孵育4 min。然後加入試劑R2(40µL)並混合，觸發凝集信號，在700 nm處測量。

試驗性能和驗證

根據臨床和實驗室標準協會(CLSI)批準的標準和指南:CLSI EP5-A2、CLSI EP6-A、CLSI EP7-A2、CLSI EP9-A3和CLSI C28-A3分別對該方法進行評價，包括精密度、線性度、幹擾、方法比較和參考範圍。使用EP Evaluator軟件(11.0版本)和Excel (Microsoft)處理數據。

結果
試驗設計和劑量反應

對於在普通化學分析儀上運行的檢測，它必須有很少的試劑(最好是兩種)，並且應該在10分鍾內產生可靠的25- OH維生素D劑量反應。這是通過設計兩種試劑，即R1和R2來實現的。給定的患者血清樣本首先與試劑R1混合，試劑R1含有釋放劑，將25-OH維生素D部分從其血清轉運體(維生素D結合蛋白)中分離出來。當試劑R2加入後，試劑R1中的擁擠劑促進了納米顆粒的25-OH維生素d特異性凝集。特異性和劑量依賴性的凝集是由試劑R2中的兩種納米顆粒介導的。第一種納米顆粒塗有抗25- oh維生素D抗體。第二類納米顆粒被一種專有抗體包裹，這種抗體與由此形成的免疫複合物結合。因此，反應試管中25-OH維生素D的存在會引發一連串的抗體結合，從而導致納米顆粒的凝集。這種凝集的程度與患者血清樣本中25-OH維生素D的含量成正比。典型的劑量-響應曲線(由700 nm光散射監測)如圖1所示。

圖1:貝克曼AU680上的典型25-OH維生素D校準曲線。
y軸標記的活度對應於700nm處測量的光密度乘以104倍。x軸為25-OH維生素D的濃度，單位為ng/mL。

貝克曼AU680分析儀的分析性能

精度:使用三個獨立試劑批次，對兩個血清對照和9個血清樣品(跨越檢測的動態範圍)進行了複雜的精確研究。在20天的時間裏，每天兩次重複測量。每個血清樣本共獲得240個數據點。精度數據的統計分析如表1所示。結果表明，在15 ~ 147.8 ng/mL的樣品中，獲得的批內、批間、日間、批間和總CV百分比(對三個批次的試劑)小於10%，在7.6 ~ 15 ng/mL的樣品中小於20%。這些結果證明了一個非常精確的分析在廣泛的動態範圍。

樣本 的意思是 Within-Run Between-Run 天小 在 總計
(N = 240) SD %的簡曆 SD %的簡曆 SD %的簡曆 SD %的簡曆 SD %的簡曆
控製1 21.7 0.9 3.90% 0.6 2.80% 0.8 3.80% 1.3 5.90% 1.3 6.20%
控製2 42.5 1 2.40% 0.8 2.00% 1．1 2.50% 1.4 3.30% 1.7 3.90%
示例1 11.1 0.9 8.30% 0．5 4.40% 1．5 13.70% 1.9 16.80% 1.8 16.60%
示例2 18.2 0.9 4.90% 0.7 3.90% 1．1 6.00% 1．6 8.60% 1．6 8.70%
示例3 22.1 0.8 3.80% 0.8 3.80% 0.4 1.80% 1．2 5.60% 1．2 5.60%
示例4 42.8 0.9 2.00% 1 2.40% 0 0.00% 1.4 3.20% 1.3 3.10%
示例5 59.5 1 1.70% 0.7 1.20% 1 1.70% 1．6 2.70% 1．6 2.70%
示例6 80.2 1.3 1.60% 1．1 1.40% 1．1 1.40% 2 2.50% 2 2.50%
示例7 99.5 1.8 1.80% 1．5 1.60% 1.3 1.30% 2.7 2.70% 2.7 2.80%
示例8 117.6 2．2 1.90% 2 1.70% 2．2 1.90% 3．7 3.10% 3．7 3.20%
示例9 139.2 2.7 1.90% 2.6 1.80% 1.7 1.20% 4 2.90% 4．1 2.90%

表1:複合精度研究的統計分析。

線性:為了評估線性關係，將人血清樣品與25-OH維生素D原液加到平均濃度為153.0 ng/mL(使用二酶EZ維生素D測定法在三次重複中測定)。然後用低25-OH維生素D血清樣品(平均4.7 ng/mL)稀釋這個高樣本，以創建11個均勻分布的線性水平。這11種水平是三倍重複測量的。得到的結果的線性回歸如圖2所示，並顯示出該含量在153.0 ng/mL時是線性的。

圖2:線性測試。
將高25-OH維生素D與低25-OH維生素D樣品混合，形成11個線性水平。測量結果是三份。

靈敏度:為了確定該方法的定量限(LOQ)，將5份25-OH維生素D血清樣品用25-OH維生素D貧血清稀釋，在5天內重複40次進行測定。通過繪製五種樣品的CV百分比來確定定量限與並將曲線擬合到CV為20%的95%置信區間(圖3)。結果表明，測定的定量限低至4.3 ng/mL。

圖3:定量限度的測定。

方法比較:為了進行方法比較，在Beckman AU680分析儀上用Diazyme EZ維生素D檢測單個血清樣本，並與之前批準的預測設備(k133410)進行比較。總共使用了171個樣品(跨越了測定的AMR)。這些樣品包括5個非常低的樣品(低於15ng /mL)和5個非常高的樣品(高於135 ng/mL，通過在單個血清樣品中添加25-OH維生素D獲得)。本方法比較研究中改變樣本的總百分率為9.4%。所有的測量都是在singlet中完成的。結果的線性回歸如圖4所示，表明新開發的測定方法是準確的，基本上等同於商業上可用的測定方法。

圖4:方法比較。
171份血清樣本用25- OH維生素D酶促測定法(謂詞，k133410)和新開發的測定法(候選)測定。

比較矩陣:為了評價抗凝劑的效果，采用雙酶EZ維生素D法測定匹配組血清、K2-EDTA血漿、K3- EDTA血漿和Li-Heparin血漿25-OH維生素D濃度。每個樣品和每個矩陣的報告值都是從貝克曼AU680分析儀的單次測量中獲得的。測試的匹配集總數為54個。結果如圖5A-5C所示。結果表明，新建立的檢測方法適用於血清、K2-EDTA、K3-EDTA或LiHeparin血漿組成的人體標本。

圖5:矩陣的比較。
(一)Li-Heparin等離子體與血清。
(B) K3.-EDTA-Plasma與血清。
(C) K2-EDTA-Plasma與血清。

參考區間:為了確定測定的參考區間，對145個明顯健康的美國人群的25-OH維生素D血清濃度進行了測量。來自賓夕法尼亞州(美國北部)47個樣本，來自田納西州(美國中部)49個樣本，來自德克薩斯州(美國南部)49個樣本。參與者的選擇基於年齡(21-67歲)，沒有服用任何維生素D補充劑，沒有甲狀旁腺或鈣調節疾病的曆史，沒有攝入任何已知影響維生素D吸收或分解代謝的藥物，包括膽固醇吸收抑製劑，如Vytorin®，Inegy™或Zetia);抗驚厥藥，如Neurontin, Depakine®和Trileptal;糖皮質激素，如皮質醇、強的鬆和地塞米鬆;HAART(艾滋病治療)或抗排斥藥物。

非參數統計數據代表中間95%的人口，如圖6所示。該方法的參考區間為7.2 ng/mL ~ 41.6 ng/mL。這個區間與已發表的科學文獻[24]一致。

圖6:參考區間估計。

穩定性:試劑、校準器和對照物的加速穩定性在37°C下持續22天，結果表明，該檢測方法在精度、靈敏度、線性度和樣品回收率方麵仍符合預期(見圖7)。基於這些結果，在2-8°C下，檢測試劑盒的貨架期可達24個月。圖8顯示了一個13個月舊的檢測試劑盒的樣品回收率基本上等同於新製造的試劑盒。

圖7:加速試劑穩定性。
(y)軸表示用熱應力試劑(37°C下22天)進行的測量。(x)軸表示用2-8℃的試劑進行的測量。檢測試劑盒(2-8°C)的實時穩定性是持續的。

圖8:試劑的實時穩定性。
8份血清樣本用新鮮試劑測定(x軸，第0個月)，13個月後用相同的測定試劑盒測定相同的血清樣本(冷凍)(y軸)。

吞吐量:為了估計該試驗的吞吐量，血清樣品以批模式加載在AU680分析儀上，在30分鍾和45分鍾時測量血清樣品結果的數量。吞吐量通過30分鍾和45分鍾的平均結果推斷到一個小時。發現該試驗是最快的25- OH維生素D，在貝克曼AU680分析儀上每小時產生625個測試結果。

驗證分析:為了評估新開發的25-OH維生素D試劑盒的多功能性，我們在不同的化學分析儀上對其性能進行了評估和驗證。表2列出了分析方法得到充分驗證的分析儀(數據未顯示)，並表明該方法可以在6個不同製造商生產的至少13種不同的通用化學分析儀上運行。這種多功能性非常重要，因為它幾乎為任何臨床化學實驗室帶來了25-OH維生素D的檢測能力。

分析儀的名字 製造商
AU680 貝克曼
AU400 貝克曼
AU5800 貝克曼
建築師c4000 阿伯特
建築師c8000 阿伯特
DZ-Lite c270 Diazyme
模塊化P 羅氏公司
Cobas c501 羅氏公司
Cobas c701 羅氏公司
Cobas c702 羅氏公司
日立917 羅氏公司
Pentra 400 Horiba
Biolis 30我 東京正信

表2:EZ維生素D測定驗證的分析儀列表。

討論

25-OH維生素D測試在過去幾十年裏一直在發展。從20世紀70年代開發的最早的方法(ELISA和RIA)到液相色譜法、質譜法和化學發光法的發展，維生素D檢測在準確性、精密度、自動化和通量方麵逐漸提高[25-26]。與此同時，臨床證據表明監測25- oh維生素D水平的重要性呈指數級增長，因此更需要一種簡單、快速、準確和具有成本效益的25- oh維生素D[25]方法。

本文描述的納米顆粒增強檢測方法是檢測25-OH維生素D的最新進展。使用簡單的光度檢測(與化學發光和其他複雜的技術(如RIA、HPLC和LC-MS)相反，隻包含兩種試劑，新開發的檢測方法代表了向幾乎所有臨床化學實驗室提供維生素D檢測能力的重大飛躍。傳統的維生素D方法需要訓練有素的人員(HPLC, LC-MS和RIA)或特殊的化學發光檢測分析儀。中小型臨床化學實驗室往往缺乏這些要求，他們最終將維生素D測試外包給大型實驗室測試公司。這延誤了病人的治療結果，增加了成本。有了本文描述的新的維生素D檢測方法，任何臨床化學實驗室都可以在任何無處不在的化學分析儀上進行內部維生素D檢測。

此外，由於可追溯性和與其他25-OH維生素D方法的協調問題，目前的25-OH維生素D測定方法可追溯至國家標準與技術研究所(NIST)標準SRM972a，目前已通過美國疾病控製與預防中心(CDC)維生素D標準化認證計劃(VDSCP)認證。該檢測方法還加入了兩個第三方能力測試(PT)項目:英國的維生素D外部質量評估計劃(DEQAS)和美國病理學家基於維生素D準確性學院(CAP ABVD)。

考慮到25-OH維生素D檢測在預防醫學中的重要性，我們相信新開發的維生素D檢測方法將為維生素D檢測的“民主化”做出巨大貢獻。這最終將有助於改善患者的健康結果，降低美國和其他國家的醫療成本。

結論

本文報道了一種檢測人血清和血漿中25-OH維生素D的新方法。該方法被命名為EZ維生素D，是一種免疫濁度法，通過測量塗有特定維生素D抗體的納米顆粒的凝集程度來評估患者的25-OH維生素D水平。這種簡單的雙試劑分光光度法測定維生素D的性能已經在幾種自動化化學分析儀上得到了成功和廣泛的測試。該檢測方法已被美國食品和藥物管理局批準用於臨床，並獲得了美國疾病控製與預防中心的認證。

資金

這項研究沒有從公共、商業或非營利部門的資助機構獲得任何具體的資助。


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條信息

文章類型:研究文章

引用:Saida FB，袁c(2019)一種用於自動化化學分析儀的高通量通用維生素D測定方法。臨床檢驗醫學4(2):dx.doi.org/10.16966/2572-9578.132

版權:©2019 Saida FB，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2019年11月26日,

  • 接受日期:2019年12月10

  • 發表日期:2019年12月17日