摘要

描述了一種測定hTERT mRNA水平的方法。該方法被指定用於檢測尿液沉積物中的癌細胞，並通過使用來自前列腺癌(PCa)患者的樣本進行驗證。PCR產物用ELISA-like技術(ELOSA)進行定量檢測。

通過分析PCa患者的標本，發現記錄的信號與cDNA的初始量成正比。通過與無前列腺癌的泌尿科患者或健康人的樣本進行工作，測量到的信號通常低於臨界值。但是，有時會觀察到假陽性結果的發展，盡管樣本來自明確的非癌症患者。在這些病例中，先證者主要受到泌尿生殖區域的各種炎症過程的影響，通常缺乏信號應答與[cDNA]之間的明顯關係。

通過同時分析同一cDNA樣本的幾種不同濃度，得到了濃度-響應曲線。每種情況下的實驗數據都用線性回歸逼近。大多數前列腺癌患者(>90%)對應的相關係數(r)等於或大於0,8(強相關)。在許多假陽性結果中，係數r的特征主要是另一個趨勢:從平均(很少)到非常弱的相關性(大多數情況下)。

它被認為是利用揭示的初始cDNA濃度和熒光值之間的相關性類型作為模板來識別超出Cut-Off信號的性質。這種方法和Cut-Off值的使用可以被視為評估hTERT mRNA測量的另一個跳板。基於這些原理，該方法的靈敏度和特異性分別為71%和91%。提出的方法使得在許多情況下區分真陽性和假陽性結果成為可能。

關鍵字

PCR-ELOSA;hTERT信使rna;尿液沉積物;假陽性結果;前列腺癌

簡介

直接參與癌症代謝的亞細胞成分可能是最有前途的生物標誌物。例如，在尿液標本中檢測到它們，使得對各種泌尿生殖器官癌症進行無創早期診斷成為可能。

在腫瘤標記中，首先應該提到的是不同基因的mRNA，它們在惡性過程中高度表達。對於前列腺癌(PCa)，最有信息的是前列腺特異性基因PCA3，嵌合基因TMPRSS2-ERG或hTERT基因。它們的單獨或聯合分析[1-3]比單獨的傳統PSA檢測獲得更多的信息，同時補充了其預測特性。

現代的基因表達分析方法通常是基於使用定量反轉錄PCR (RT-qPCR)方法。將結果與構成表達的參比基因的表達數據進行比較，可以監測所需基因“比活性”的振蕩。然而，在日常診斷中，這種做法是罕見的，因為這些方法首先是非常費力和昂貴的。此外，在分析期望基因和內參基因時，有時也會出現問題[4,5]。

簡化分析方法是非常可取的。至少在測量端粒酶基因表達時可以嚐試這樣做[6-8]。事實上，研究發現hTERT在所有泌尿生殖器官癌症或來自人類前列腺癌的細胞係中的表達與健康組織中不存在這種關係之間存在很強的關係[9-11]。這通常允許使用較簡單的傳統PCR檢測方法進行hTERT mRNA分析，工作在二元“是/否”分類模式中。然而，最近發現，端粒酶的激活也發生在所謂的“炎症”細胞中。這些細胞具有多種性質，並在尿中積累。因此，通過使用端粒酶作為癌症標誌物，考慮到這種酶外觀的來源是非常可取的在活的有機體內．有時，這可以使用實時定量PCR方法[13]的功能來完成。

本研究的目的是開發一種測量尿液沉積物中hTERT mRNA水平的方法，該方法是基於elisa樣檢測係統(ELOSA -酶聯寡核苷酸夾心試驗)完成的傳統PCR的另一種定量PCR。

材料和方法

參與者

該研究(2012-2014)已獲德國巴登-符騰堡州倫理委員會批準。18名泌尿科醫生參與了研究，並提供了49名疑似前列腺癌患者的尿液樣本。PSA分析也在我們的實驗室進行。在調查期間，大多數患者都沒有明確的診斷。34例經活檢證實為初步診斷。

對照組由32名年齡不超過36歲的健康誌願者組成(8名女性，24名男性)。一些年輕男性因為不同的問題而向醫生求助，而這些問題與前列腺疾病無關。由於他們的年齡，我們已經排除了在這個隊列中PCa存在的可能性。

所有患者都書麵同意進行研究。

樣品的采集和儲存

從所有先證者中收集50毫升自發排空尿液樣本。男性的尿液樣本隻在初步的前列腺按摩後收集。樣品在24小時內送到實驗室，沒有結冰或任何運輸的特殊條件。

在開始收集尿液沉澱物之前，有時將樣本置於37°C下數小時。在某些情況下(特別是樣品冷卻後)，需要這一步來溶解尿液中的沉澱物。

為了從尿液中獲得細胞球，使用所謂的分步離心(3 × 5min × 400 g)，每一步後去除上清。最初樣品(約50毫升)第一次離心後，使用連接到噴水泵的巴斯德移液器除去約35毫升尿液。剩餘的尿液被大力攪拌(用渦流)，並轉移到一個14毫升錐形管。第二次離心後，用同樣的方法從小瓶中取出約9毫升尿液。殘尿旋動後轉入1ml錐形epppendorf管。在最後一次離心後，試管底部出現了一個小的細胞顆粒“蛋糕”。除去約900-950 μ l的澄清尿，將顆粒重新懸浮在剩餘尿量(約50- 100 μ l)中，轉移到500 μ l的Trizol (Ambion)中。如果沉澱物懸浮液的體積超過100µl，我們使用Trizol溶液的更濃縮版本- Trizol LS。獲得的樣品在使用前保存在-80°C。

RNA的分離和cDNA的合成

根據製造商的協議，使用Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)從所有標本中分離總RNA。

RNA用隨機引物反轉錄，最終體積為20µl。反應混合物包含純化總RNA 10µl, 5 × RT緩衝液(Promega) 4µl，每個dNTPs的2 mM溶液0,8µl, HOH 2,2µl，隨機引物pd(N) 6 (Amersham, 0,26µg/µl)， RNase Inhibitor (Promega, 40u /µl)， M-MLV逆轉錄酶(Promega, 200 U/µl)。25°C孵育10 min, 70°C孵育7,5 min, 42°C孵育60 min;逆轉錄酶在97°C加熱5分鍾滅活。cDNA在-20°C保存直到測定。

PCR擴增與檢測

我們選擇了β -2微球蛋白(B2M)基因作為管家基因。根據[14]，用pcr法測定所有cDNA樣本中B2M mRNA的水平。該基因被用作cDNA合成的對照，表明所有樣本都含有不同來源的細胞。缺乏B2M表達的樣本將被排除出分析。

對於hTERT mRNA的檢測，我們選擇了一種用於快速冷凍組織或胰液樣品中hTERT定量分析的方法，並對[15]進行了一些修改。建立了兩輪嵌套PCR協議。試驗設計包括第一輪15個PCR循環(PCR A)，產物預稀釋(來自PCR A)和第二輪35個循環(PCR B)。引物和捕獲探針如表1所示。為了避免汙染基因組DNA的擴增，所有F-引物和所有r -引物被放置在不同的外顯子中(GenBank AF015950.1)。用外部引物(F11big和R12big)和內部引物(F11small和R12small) PCR分別得到145 bp和88 bp的DNA片段。每個樣本同時用四種不同的cDNA濃度進行分析。這是通過混合不同數量的1/10稀釋的cDNA溶液(9、4、2和1µl)、水和主混合物，保持反應介質總體積(20µl)的恒定來實現的。

	hTERT基因庫AF015950.1)	位置	外顯子	產品
PCRA	季大: 5 ' - GCG gaa gac agt GGT gaa ct-3 ' R12大: 5 ' - agc TGG agt agt CGC TCT gc- 3 '	2758→2777→2903 2884	11日12	145
PCRB	季小: 5 ' - TGT aga aga CGA GGC CCT gg-3 ' R12小: 5 ' -biotin-gta TCC agc agc agg CCG ca-3 '	2782→2801→2870 2849	11日12	88
捕獲探針	5 ' -C12-Aminolink-ctt ttg ttc aga tgc cgg ccc a-3 '	2811→2832	11

表1:寡核苷酸引物和捕獲探針序列

在第一次PCR (PCR A)中，反應混合物中的試劑最終濃度為:1 × PCR緩衝液，0.1%吐溫-20，氯化鎂- 3,75 mM, 0.2 mM的每個dNTPs;酶活性[F11big]和[R12big]-0,4個單位，分別為375和125 nM。反應條件為:96°C變性20s, 70°C退火延伸120s 15個循環。

第二次PCR反應的總體積也為20µl，其中包括18µl的Master Mix和2µl的PCR a的1/2000預稀釋產物。在PCR B運行時，反應混合物中的最終試劑濃度為:1 × PCR-緩衝液，0.1%吐溫-20，氯化鎂-每個dNTPs的2,5mm, 0,2mm;酶活性[F11small]和[R12small] - 0,1個單位，分別為50和150 nM。PCR循環參數為96°C 10次15s, 70°C 150s + 96°C 10次15s, 70°C 120s + 96°C 15次15s, 70°C 90次

用ELOSA檢測係統完成PCR。為此，我們使用了帶有固定化捕獲探針(10 pmol/100 μ l/孔)的標準DNA結合96孔微板(Costar)。65℃(5µl擴增子/100µl雜交液)雜交1小時後，用鏈黴菌親和素(Novagen)共軛堿性磷酸酶溶液在室溫下處理15分鍾。通過記錄4-甲基傘形酰磷酸在室溫下反應1小時(或更長時間)後熒光的增加來觀察指示信號的進展。

結果

目的與實驗設計

我們建立了一種測定尿液沉積物中惡性細胞的方法。該方法適用於許多類型的泌尿生殖係統癌症，並基於對hTERT mRNA水平的測量。測試的主要目的是檢測PCa細胞。

收集尿液沉積物

在大多數致力於使用各種尿液生物標記物的出版物中，主要注意力通常集中在分析方法的詳細描述上。雖然沒有普遍接受和標準化的程序，但獲得尿液細胞沉澱物的方法規範僅被描述為通用的規則。然而，關於尿液濃度的異質性，這個問題遠非微不足道。

例如，尿液可能含有不溶性最小顆粒的懸浮液。這樣的顆粒能夠堵塞用於接收細胞沉澱的微米過濾器的孔隙。此外，有時即使在4-8°C下短暫儲存尿液也會形成沉澱。無論如何，獲得尿液沉澱物的方法對整個分析是至關重要的，在我們看來，值得更仔細地考慮。

細胞顆粒是從透明尿液樣本中收集的。如果尿液渾濁，則將裝有樣品的小瓶在37°C下加熱數小時，偶爾晃動。通常，由於光線變暖，渾濁度會慢慢溶解。分步離心獲得尿液沉澱物。在大多數情況下，即使使用完全透明的尿液，也可以在離心的最後一步實現沉澱的可視化

hTERT mRNA分析

所有尿液樣本均為B2M陽性(數據未顯示)。

為了識別細胞，表達端粒酶基因，我們使用了四個平行測量數據在不同的初始cDNA濃度。對疑似或確診癌症患者尿液樣本的研究結果如表2所示。

診斷	情況下/ 內部№	1µl cDNA在pcr中	2µl cDNA在pcr中	4 μ l cDNA在pcr中	pca中9µl cDNA	r	R2
主成分分析	1/65	531	1611	2429	2623	0, 82	0, 67
主成分分析	2/66	653	510	1221	1779	0, 96	0, 91
主成分分析	3/71	1181	1392	1786	3125	1日00	1日00
主成分分析	4/72	708	808	1398	2585	1日00	1日00
sus	5/73	468	748	855	1160	nd	nd
主成分分析	6/74	1465	1184	3174	3720	0, 89	0, 79
主成分分析	7/79	449	357	470	803	nd	nd
主成分分析	8/84	1932	2338	3412	4190	0, 96	0, 91
主成分分析	9/90	461	629	793	1218	1, 0	1, 0
sus	10/91	696	629	1953	2567	nd	nd
主成分分析	11/93	360	391	415	693	nd	nd
主成分分析	12/94	397	369	391	504	nd	nd
主成分分析	13/97	732	1135	1022	3095	0, 96	0, 91
主成分分析	14/101	1346	1428	1810	2722	1, 0	1, 0
sus	15/102	1578	1398	3479	5185	nd	nd
sus	16/103	1306	1407	nd	3067	nd	nd
主成分分析	17/104	7416	8134	10542	10081	0, 74	0, 55
主成分分析	18/105	2036	2402	6898	6870	0, 81	0, 66
主成分分析	19/106	9327	9950	10668	11851	0, 98	0, 97
主成分分析	20/107	8869	9705	9647	10078	0, 81	0, 65
sus	21/108	3409	2109	5500	6711	nd	nd
主成分分析	22/161	665	1697	1395	2634	0, 89	0, 80
主成分分析	23/164	397	742	1233	2191	1日00	1日00
		Cut-Off1/2 = 1000/1500

表2:熒光信號與cDNA含量的相關性-疑似和確診前列腺癌患者尿液樣本分析數據*
*指示物反應持續時間為60分鍾。縮寫:nd -未確定，sus -懷疑;r, r²-分別為相關係數和決定係數

在研究PCa患者樣本時，熒光信號通常依賴於cDNA的初始濃度(如表2，病例1/65;2/66;3/71;4/72等)，其值與cDNA的用量成正比。

例如，圖1是檢測幾例前列腺癌患者的樣本得到的濃度-反應曲線(表2，病例1-4)。

圖1:對部分前列腺癌患者尿液樣本進行處理後，熒光信號與cDNA含量的相關性。檢查的患者的內部Nr如圖所示。(原始數據見表2，病例1-4，指標反應持續60 min)

對對照組先證者尿液樣本進行研究，獲得的hTERT mRNA檢測結果見表3。

案例/內部	1µl cDNA在pcr中	2µl cDNA在pcr中	4 μ l cDNA在pcr中	pca中9µl cDNA	r	R2
1/92	458	409	458	381	nd	nd
2/125	2817	2006	3201	2155	0, 28	0, 08年
3/126	1181	1108	2057	1141	0 01	0 00
4/127	1215	665	1654	797	0, 21	0, 04
5/128	1135	629	1382	726	0, 27	0, 08年
6/129	1553	1279	2487	1895	0, 41	0, 17
7/130	1520	1227	2197	1993	0, 63	0, 39
8/131	366	443	659	504	nd	nd
9/132	385	385	375	501	nd	nd
10/133	342	427	409	1834	nd	nd
11/134	513	378	476	409	nd	nd
12/135	595	391	635	482	nd	nd
13/136	385	427	436	339	nd	nd
14/137	339	446	476	369	nd	nd
15/138	351	385	369	400	nd	nd
16/139	397	586	507	534	nd	nd
17/140	476	678	629	1016	nd	nd
18/141	354	443	482	903	nd	nd
19/124	394	369	357	598	nd	nd
20/162	438	421	348	519	nd	nd
21/163	702	1257	1418	2213	0, 97	0, 94
22/165	412	372	433	461	nd	nd
23/166	534	461	696	1471	nd	nd
24/168	449	391	555	571	nd	nd
25 / F1	574	449	558	836	nd	nd
26 / F2	501	473	528	803	nd	nd
27 / F3	507	485	522	632	nd	nd
28 / F4	485	449	595	543	nd	nd
29 / F5	568	381	360	464	nd	nd
30 / F6	418	368	525	427	nd	nd
31日/ F7	394	388	415	690	nd	nd
32 / F8	400	403	516	409	nd	nd
	Cut-Off1/2 = 1000/1500

表3:對照組先證者尿液樣本cDNA分析數據與熒光信號的相關性*
*指示物反應持續時間為60分鍾。縮寫:nd -未確定;r, r²-分別為相關係數和決定係數。熒光數據>Cut-Off1以粗體顯示。

研究來自無前列腺癌的泌尿科患者或健康個體的樣本，測量到的信號通常低於臨界值(如表3，病例25F1 - 32F8)。然而，對這些結果的解釋並不總是明確的。在某些情況下，測量到的信號明顯超過了所有的截止值，盡管這些信號來自明確的非癌症患者(如表3，病例2/125 - 7/130或圖2)。

圖2:對無PCa的對照組的部分先證者尿液樣本進行處理後，假陽性信號與cDNA含量的相關性。檢查的患者的內部Nr如圖所示。(原始數據見表3，病例125-130，指標反應持續時間60min)

除了真陽性和假陽性結果的數據(表2和表3)和這些圖形的直觀描述(圖1和圖2)之外，我們還計算了每種情況的趨勢線方程。為了估計回歸線如何很好地代表實驗數據，相應的相關係數(r)和決定係數(r²)計算(r=√r²)．相關性大於0.8通常被描述為強相關性，而小於0.5通常被描述為弱相關性。

大多數PCa患者觀察到的決定係數等於或大於0,8(強相關)。假陽性結果的特征主要是另一個趨勢:從平均(很少)到非常弱的相關性(大多數情況下)。這個觀察表明r或r²可作為進一步改進試驗評價的參數。然而，精確確定係數的極限值仍然需要對大量的樣本進行分析。

敏感性和特異性

根據ELISA標準規則，僅以Cut-Off值為基礎，對敏感性和特異性進行初步計算。利用空白井的熒光強度計算Cut-Off1 (2 × blank)和Cut-Off 2 (3 × blank)。分析信號值在cut - 1以下為“負”，高於cut - 2為“正”，介於cut - 1和cut - 2之間為邊界。計算係統的後續更改和添加將在“討論”一節中討論。

34例確診為“前列腺癌”的患者尿液樣本中hTERT mRNA水平數據見表4。根據這些結果，PCR-ELOSA hTERT mRNA檢測方法的靈敏度為71%(邊界線結果為陰性)。

案例/內部 №	年齡	PSA	診斷,格裏森評分	hTERT尿液中	案例/內部 №	年齡	PSA	診斷,格裏森評分	hTERT 尿液中
1/65	69	7、4	主成分分析:4 + 4 = 8	pos	19/110	67	16日,52	主成分分析:4 + 5 = 9	pos
2/66	71	16日,89	主成分分析:3 + 4 = 7	pos	19/114	62	10日,38	主成分分析:4 + 4 = 8	pos
3/71	63	13日,54	主成分分析:3 + 3 = 6	pos	20/115	72	81	主成分分析:3 + 3 = 6	pos
4/72	63	31日,66年	主成分分析:4 + 5 = 9	pos	21/116	72	10、8	主成分分析:4 + 4 = 8	pos
5/74	72	4、6	主成分分析:4 + 3 = 7	pos	21/117	62	73	主成分分析:3 + 4 = 7	pos
6/79	69	13	主成分分析:3 + 3 = 6	負的	23/118	66	6, 52歲	主成分分析:3 + 4 = 7	pos
7/84	73	13	主成分分析:4 + 3 = 7	pos	24/119	70	33歲的1	主成分分析:4 + 4 = 8	雙相障礙
8/90	63	4, 73	主成分分析:4 + 5 = 9	雙相障礙	25/121	68	8日,38	主成分分析:3 + 3 = 6	pos
9/93	85	17	主成分分析:3 + 4 = 7	負的	26/143	48	10、13	主成分分析:2 + 2 = 4	負的
10/94	88	5、6	PCa 3 + 4 = 7	負的	27/145	72	8日,56	主成分分析:3 + 4 = 7	負的
11/97	67	65	PCa 4 + 3 = 7	雙相障礙	28/153	58	9日05	主成分分析:3 + 3 = 6	pos
12/104	72	3, 64	主成分分析。3 + 4 = 7	pos	29/155	76	40	主成分分析:5 + 4 = 9	負的
13/105	56	30日,2	主成分分析:3 + 3 = 6	pos	30/156	74	6日,43歲	主成分分析:4 + 4 = 8	負的
14/106	71	6、8	主成分分析:nd	pos	31/159	74	6、14	主成分分析:nd	pos
15/107	74	7、3	主成分分析:3 + 3 = 6	pos	32/160	63	4, 86	主成分分析:3 + 3 = 6	pos
16/109	75	11日,46	主成分分析:4 + 4 = 8	pos	33/161	66	218	主成分分析:4 + 4 = 8	pos
17/101	66	5、12	主成分分析:3 + 4 = 7	pos	34/164	67	21	主成分分析:5 + 4 = 9	pos

表4:確診前列腺癌患者尿液中hTERT mRNA檢測結果
縮寫:pos - positive;否定——消極;bd -邊緣。

方法特異性的計算基於對對照組先證者尿液樣本的檢測結果(表3)。在PCR A / b的所有模板濃度下，來自女性的數據明顯低於CutOff 1，對男性對照組尿液樣本的檢測顯示，有一些結果的熒光值明顯高於CutOff 2，因此必須被視為“假陽性”。在此反應條件下，該方法的特異性約為78%。

討論

我們提出了一種測量尿液沉積物中端粒酶基因mRNA水平的方法。該方法基於傳統的巢式PCR與ELISA-like檢測係統(ELOSA)，旨在早期診斷前列腺癌(或其他泌尿生殖係統癌症)。這項技術被廣泛接受，並被用於商業試劑盒中，用於測定尿液中端粒酶活性，具有同樣的目的[16,17]。pcrelosa串聯過程是實時RTqPCR的低成本替代方法。其優點之一是，創建的程序隻需要標準的PCR和elisa設備，這通常是在大多數分子生物學實驗室中可用的。此外，傳統的PCR更簡單，更可靠。

傳統的結果呈現方式是所用檢測係統的另一個非常重要的優點。事實上，在實時RT-qPCR中，結果通常用擴增周期數表示(如規則-閾周期值C_t)，而不是濃度[18]。相反，在ELOSA中，可檢測信號(吸光度或熒光)與分析物濃度成正比。這樣就可以很容易地使用測量值而不是計算參數，並直接觀察到比較檢測信號強度的幾個樣品之間的mRNA濃度的微小差異。

基於上述特性，我們決定不進行精確和多次重複的測試，而是在不同濃度下對每個cDNA樣本進行並行測量。的確，根據文獻數據，類似實驗的結果通常要複查幾次(兩到三次)。在我們的例子中，對最終結果(正的或負的)的評估不會基於幾個信號的單個值或中間值，而隻考慮它們彼此之間的某種關係。換句話說，每次後續測量都必須確認或否定先前的結果。這種動力學方法和Cut-Off值的使用可以被視為測量結果評估的額外墊腳石。這意味著，例如，在樣品中存在癌細胞的情況下，分析信號的增長必然是隨著聚合酶鏈反應模板初始濃度的增加而預期的。換句話說，根據Michaelis-Menten酶動力學，必須觀察到熒光值與cDNA用量之間的線性關係。

因此，表2中表示的是對23例疑似或確診前列腺癌患者的樣本進行檢測後收到的原始熒光值。信號值與[cDNA]之間的線性關係(相關係數為>0,8)在超過90%的PCa病例中表現最為明顯。

最近，越來越明顯的是，在hTERT mRNA的測量中，炎症細胞往往是出現假陽性結果的罪魁禍首。通過對尿細胞[12]的形態學和免疫細胞化學研究，使用抗hTERT單克隆抗體證實了這一結論。由於細菌感染、尿結石疾病和許多其他原因引起的炎症過程是導致尿液中出現高濃度不同性質炎症細胞的原因[12,18-21]。因此，為了避免得到假陽性結果，一些研究人員建議隻有在初步研究血液中是否存在活化的t淋巴細胞後才進行hTERT mRNA分析:來自含有活化的cd25陽性淋巴細胞的患者的樣本被排除在進一步的研究中[6]。在這類病例中，其他作者隻在先前的抗生素治療過程中提出了hTERT基因表達分析[19,22]。

因此，由於炎症過程，尿液中端粒酶激活的炎症細胞(如淋巴細胞)濃度急劇增加，因此在分析的樣本中也如此。這種情況是非惡性細胞出現“陽性”信號的原因之一。從分析目的的角度來看，這些結果應被認為是假陽性。例如，通過檢測對照組先證者的尿液樣本，有9個潛在陽性結果(表3;情況下2/125-7/130 10/133;21/163和23/166)。根據醫師記錄，5例(表3;病例2/125、6/129、7/130、21/163和23/166)來自泌尿生殖道炎症先證者

當然，尿液中炎症細胞的數量取決於炎症的強度。然而，在這些情況下，端粒酶活躍的相應非惡性細胞的數量將更經常顯著超過前列腺癌初始階段癌細胞的潛在數量。隻是，由於被分析的炎症細胞中hTERT mRNA的數量過多，在指示的反應條件下，信號的大小和相應的[cDNA]之間的線性關係很可能是不存在的。事實上，從所提供的數據可以看出，在大多數情況下(表3;病例2/125 - 7/130)，“假陽性”信號與[cDNA]的相關性具有隨機分布(圖2)。這使我們假設，初始cDNA濃度與超過Cut-Off的分析信號值之間缺乏可靠的相關性可能是假陽性結果的一個特征。

因此，濃度-響應曲線的分析可以為評估«陽性»信號(>截止)的性質提供額外的標準。當樣本中存在癌細胞時，應觀察到cDNA的初始濃度與信號值之間的正比關係，這是一個規則。缺乏這種依賴性或隨機分析信號(>Cut-Off)分布與[cDNA]可能表明樣本中存在大量炎症細胞。當然，情況並非總是如此(見表3,case 21/163)。然而，也許這一次觀察到的信號值和cDNA濃度之間的線性依賴性(完全模仿PCa樣本研究中獲得的模式)可以簡單地用輕度炎症的存在來解釋，這就是例外證實規則的情況。

此外，需要注意的是，不僅是上述的“醫學指征”或所謂的“尿路上皮病變”[3,23]，還有檢測本身的一些不完善，甚至反應條件的輕微變化，都是出現假陽性結果的原因。例如，pccrb的反應混合物在pccra後不能“超載”DNA片段:中間pcr產物初始稀釋量減少10倍(1/200而不是1/2000)會導致假陽性結果增加兩倍以上(增加100%)，而真陽性結果的數量變化不超過10%(數據未列出)。因此，由於假陽性結果出現的不同性質，所提出的評價方法不能是全麵的。同時，這一原則允許我們將9個潛在“陽性”測量中的6個結果(表3，病例2/125-7/130)視為假陽性。在這種情況下，該方法的重新計算特異性從78%增加到91%。

結論

我們描述了一種測定hTERT mRNA水平的方法。該方法指定用於檢測尿液沉積物中的癌細胞，並通過使用前列腺癌患者的樣本進行驗證。PCR產物的定量測定采用ELISA-like技術。該方法的主要特點是同時進行幾種不同cDNA濃度的平行實驗。對最終結果(積極或消極)的評價將基於考慮所有的測量，並相互之間有一定的關係。它被認為是利用已揭示的初始cDNA濃度和熒光值之間的相關性類型作為模板來識別超出Cut-Off信號的性質。這種方法和Cut-Off值的使用可以被視為評估hTERT mRNA測量的另一個踏腳石。基於這些原理，該方法的靈敏度和特異性分別為71%和91%。該方法可以在許多情況下區分真陽性和假陽性結果，而無需測量hTERT/參考基因mRNA水平的比值。管家基因的檢測隻需要確認尿液細胞的成功分離和證明提取的遺傳物質的質量用於擴增。

確認

作者感謝Karl-Ernst Ambs博士、Peter Dorner博士、Markus Hack博士、Dieter Egle博士、Samir Salameh博士、Christoph Gudemann博士、Joachim Felgner博士、Roland Britzelmaier博士、Gerhard Rimmelspacher博士和其他為本研究提供臨床和補充資料的醫生。作者感謝我們的同事David Seiller、Klaus Schneider博士、Hennrik Schroeter博士、Beate Boldrin博士和Anke Colberg的技術支持和有益的討論。

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文章類型:研究文章

引用:Alexandrovski JA, Kraus KH (2017) PCR-ELOSA檢測前列腺癌患者尿液沉積物中hTERT mRNA水平。中華臨床檢驗醫學2(2):doi http://dx.doi。org/10.16966/2572 - 9578.114

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出版的曆史:

收到日期:2017年6月15日

接受日期:05年9月2017年

發表日期:2017年9月11日