IvaŠabović1、2 #盧卡·托尼1 #西蒙Tescari3.Vincenzo De菲利皮主持3.馬西莫Menegazzo1朱塞佩Opocher4卡洛Foresta1安德裏亞Garolla1 *
1帕多瓦大學男科和生殖醫學學部醫學部，意大利Via giusiniani*通訊作者:Andrea Garolla，帕多瓦大學男科與人類生殖醫學學部，Via Giustiniani，帕多瓦2,35128，意大利，電話:+ 39-049-8218518;電子郵件:andrea.garolla@unipd.it
膜膽固醇(Chol)在哺乳動物體內的轉運是細胞功能的關鍵過程，特別是在精子生理中，因為Chol的去除與運動能力的增加密切相關。此外，氧化的Chol衍生物，即氧甾醇，最近在精子功能的調節中被召喚出來。目前以色譜技術為基礎的研究方法，樣品利用率低，靈敏度不高，很大程度上阻礙了對人類精子中甾醇動態的研究。在本研究中，我們旨在開發一種可靠的基於液相色譜-質譜(LC-MS)的方法來定量精子中的Chol和主要羥甾醇7β- oh -膽固醇(7β -OHC)和7酮-膽固醇(7-KC)水平。特別地，通過對反相色譜參數的精細調整，可根據生物樣品中Chol、7β -OHC和7-KC的不同保留時間、準確的m/z測定和自然同位素豐度模式，對其進行明確的鑒別。最後，將該方法應用於12名捐精者的真實精子樣本，我們記錄了正常精子受試者(總精子數>39 × 106與少精子症(精子總數≤39 × 10)的受試者相比，細胞/射精顯示所有類固醇的代表性不足6細胞/射精;Chol P=0.048, 7β-OHC P=0.006, 7-KC P=0.001)。這些初步數據建議進一步研究生精過程的障礙對精子膜的組成和功能的影響。
精子膜，精子發生，膽固醇，氧甾醇，液相色譜，質譜
哺乳動物膽固醇(Chol)的合成和運輸是最嚴格調控的生物過程之一[1]。打破這種平衡會對細胞內穩態和個體健康狀況產生重大影響。例如，血管內膜和中膜層的炎症細胞和平滑肌細胞中不受控製的Chol積累代表了動脈粥樣硬化的一個已知特征，它逐步導致血管壁增厚和血管管腔[2]閉塞。此外，除了細胞內Chol水平的變化外，對Chol內穩態的控製似乎還依賴於其他機製。事實上，最近的研究支持Chol的其他單氧衍生物(在全球被稱為氧甾醇)的積極參與，它們可以從酶或非酶途徑中獲得[3綜述]。已知的膽固醇有30多種不同的氧化衍生物，但其中隻有少數具有定量重要性，包括通過非酶途徑[3]產生的7β-OH膽固醇(7β- ohc)和7-酮膽固醇(7-KC)。有趣的是，羥甾醇的產生已被證明影響Chol的穩態，與細胞Chol含量直接相關。一旦產生，羥甾醇隨後會通過參與肝髒x受體(LXR)或通過LXR獨立機製調節Chol的合成(圖1A)[3,4]。
圖1:在體細胞(A)和精細胞(B)中已確認的涉及膽固醇及其氧化衍生物的途徑。
一個。內質網(ER)中受控酶途徑(CYP)產生的羥甾醇通過兩種不同的途徑調節膽固醇內穩態:1)通過抑製甾醇調節元件結合蛋白(SREBP)，該蛋白在參與膽固醇生物合成的上調基因(nu)核內易位;2)通過激活肝x受體(LXR)，促進膽固醇的逆向運輸。非酶途徑(3)通過與活性氧(ROS)直接反應產生的氧甾醇與膜流動性和功能的改變以及線粒體(Mito)介導的細胞凋亡相關。
B。由細胞外受體從精子細胞中去除膜膽固醇，是運動獲得和與卵母細胞融合能力(頂體反應)的關鍵事件。目前正在調查非酶促生產羥甾醇(3)在這一過程中的作用。
膜Chol的動態運輸也被認為是精子生理調節中的一個關鍵事件。的確,早期在體外對哺乳動物的研究表明，細胞活力的增加是通過將精子與鈣離子、碳酸氫鹽以及(最重要的)Chol受體如白蛋白、HDL，甚至合成螯合劑如環糊精孵育而獲得的[5,6]圖1B。在這些基礎上，膜Chol的總量可能是實現適當生育潛力[7]的限製因素。因此，膜甾醇模式的準確評估可能是解決精子細胞功能狀態的一個有用的工具。
盡管了解精細胞中的Chol和羥甾醇水平將極大地有助於研究它們在男性配子功能狀態中的生理作用，特別是在不育患者中，但精膜含量的分析量化存在重大的敏感性問題。不是個案，大多數關於這一主題的研究都是在精液樣本相對廣泛的家畜上進行的[7-9]。本研究的目的是確定一個穩健的LC-MS方法評估精子膜的甾醇模式。為此，本研究重點定量研究了Chol和7β -OHC和7-KC這兩種與精子功能相關的主要羥甾醇。
膽固醇,13C同位素標記膽固醇、7β -OH膽固醇、7酮膽固醇和Supelclean TM LC-Si SPE Tube 1mL均購自Sigma Aldrich (St.Louis, MO, USA)。所有其他試劑、溶劑和鹽均來自Fluka AG或默克公司(德國達姆施塔特)。
該研究已獲得帕多瓦大學醫院倫理委員會的批準(第2208P號方案)，每位參與者都簽署了知情同意書。這項研究是根據《赫爾辛基宣言》所表達的原則進行的，12名自稱健康狀況良好的男性誌願者參與了這項研究。納入標準為年齡18-25歲，排除標準為精索靜脈曲張、代謝綜合征、惡性腫瘤、隱睾史、性激素改變。所有受試者在禁欲2-5天後，通過在無菌容器內自慰捐獻精液。樣品被允許液化30分鍾，並根據世界衛生組織標準[10]進行檢測。簡單地說，總細胞計數的評估是由Makler計數室(Santa Anna, CA, USA)進行的，它允許計數精子細胞的濃度為毫升，也允許計數總精子計數(每總射精量的濃度)。此外，射精後，在液化樣品30分鍾後評估精子活力，以限製脫水、pH值或溫度變化可能影響活力的有害影響。根據WHO標準對每個樣本的整體精子運動能力進行分級，評估漸進運動能力(PR)，即精子主動運動的百分比，無論是線性運動還是大圓圈運動，而不考慮速度;非進行性運動能力(NP)是指具有所有其他無進行性運動模式的精子細胞所占的百分比，例如轉小圈遊泳;不動率(IM)是指精子細胞不運動的百分比。 For this discrimination, the above mentioned Makler counting chamber was used as well. Sperm viability was evaluated by assessing the membrane integrity of sperm cells, for samples with less than 40% of progressive motility. The percentage of viable sperm was assessed by identifying those cells with an intact cell membrane by using eosin Y (St. Louis, Missouri, USA) staining. We considered as viable the unstained cells, based on the principle that the entry of eosin Y through plasma membranes is allowed only in damaged membranes of dead cells. Clinical and semen characteristics of male healthy donors are reported in Table 1. According to the definition of normozoospermia (total sperm count >39 × 106細胞/射精)，12例(33%)正常精子受試者中有4例在研究組中被發現。精液評估後，樣品在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌兩次，細胞顆粒保存在-80°C直到使用。
| 參數 | 平均值(範圍) |
| 年齡(年±SD) | 22.4±3.1 |
| 禁欲(天±SD) | 3.6±1.2 |
| 精子總數(106±SD) | 35.2±57.1 (0.01-195) |
| 進行性運動能力(%±SD) | 27.8±19.1 (2-60) |
| 精子活力(%±SD) | 76.8±0.1 (56-90) |
| 精子形態正常(%±SD) | 6.6±5.6 (0-16) |
表1:健康捐精者精液特征(N=12)
用氯仿/甲醇混合物[11]從精細胞顆粒中提取總脂質部分。精細胞顆粒來自於單個精液樣本，37℃與1 ml氯仿/甲醇混合物溫和混合培養。用氯仿和水稀釋將提取物分離為兩層，氯仿層包含所有的脂類，甲醇層包含所有的非脂類。然後，提取液在10000 g離心10分鍾，氯仿層在真空β濃縮器plus(德國漢堡)中凍幹。凍幹後用200 μ l氯仿重懸。然後在1ml矽膠柱上固相萃取(SPE)分離甾醇餾分。根據以前的報告[12]，用甲醇-氯仿(1:1 v/v)溶液預處理柱，用純氯仿洗脫分離磷脂組分，用丙酮洗脫甾醇部分。將凍幹後的甾醇組分溶於甲醇中，取20µl進行UPLC分析。
用Mettler-Toledo (Columbus, OH, USA) XPE分析天平按重量製備含有膽固醇或羥甾醇的原液(每1 mg/ ml甲醇)，用甲醇稀釋原液獲得校準標準。為了準確定量膽固醇氧化衍生物的含量，根據實際樣品的製備方法製備適當的甾醇混合物。特別是，通過在甲醇中添加膽固醇(100µg/ml)到羥甾醇標準混合物(10µg/ml)，研究了過量膽固醇對羥甾醇定量的影響。在10 ng到2000 ng範圍內測試了膽固醇和氧甾醇標準的質譜信號的線性關係。評估了從精子基質中回收的膽固醇。在SPE之前，所有來自健康捐獻者的精子樣本和校準標準都被添加了13C同位素標記膽固醇作為內部標準，以解釋樣品預處理過程中的變化。
LC-MS分析使用Agilent (Santa Clara, CA, USA) 1290無限超高高效液相色譜(UPLC)係統，配備反相(RP) Poroshell 120 EC-C18柱(4.6 mm × 150 mm, 2.7µm粒徑)，來自Phenomenex (Torrance, CA, USA)和920自動進樣器，下遊連接Waters (Milford, MA, USA) Xevo-G2S Q-TOF質譜儀。
洗脫是使用乙腈-甲醇混合物在等壓條件下進行的，其成分逐步變化，以實現分析物的最佳色譜分離。
在毛細管電位為1.50 kV、源溫度為110℃的正離子模式下，采用常壓電離法(APCI)實現出水的電離和汽化
對於選定的應用，質譜儀通過為每種分析物選擇m/z值來操作，並在±1 am .u的質量窗口內記錄檢測器的總離子電流(TIC)。(氧)甾醇質量測定的誤差始終<2 ppm。數據由Mass-Lynks軟件使用0.5的數據間距獲取。使用BioPharmaLynks套件(Waters)進行質量峰的整合。如前所述，用固相萃取法製備樣品後的甲醇標準溶液計算檢測極限，信噪比(s/n)為3。定量的下限和上限被表述為滿足變異係數(CV)低於20%的標準的濃度水平，其中CV被定義為一組測量值的標準差除以該組均值。
結果以均數±標準差(SD)表示。在數據分析之前，使用Kolmogorov-Smirnov檢驗來檢驗分布的正態性。未顯示正態分布的參數進行對數變換進行統計分析。Levene檢驗用於檢驗組間方差的齊性。若違反方差齊性假設，則進行Welch檢驗並報告各自的p值。用Pearson相關檢驗評估兩個變量之間的線性相關。P值<0.05為差異有統計學意義。使用SPSS 21.0版本Windows(芝加哥，伊利諾伊州，美國)進行統計分析。
首次用質譜儀直接灌注法測定了三種分析物的質譜。圖2A報道了Chol, 7β-OHC和7-KC的代表性質譜。與文獻[13,14]報道的數據一致，在APCI-MS分析中，Chol和7β-OHC發生失水和質子加成，檢測結果為[M+H-H]2O]+離子在369.35 m/z和385.33 m/z，而7-KC以分子離子[m]+離子在400.33 (m/z)和[m +H]離子在401.33 m/z檢測到。然而，甾醇的破碎模式非常複雜且不特異，這一證據迫使分析物在rp色譜過程中根據其不同的保留時間、準確的m/z測定和自然同位素豐度模式進行區分，從而在生物樣品中實現了明確的識別。由於氧甾醇的生理濃度很低，結構相似，膽固醇[15]可能過量幹擾，分析結果同樣具有挑戰性。在圖2B中報道了商業標準的典型LC-MS痕量的Chol, 7β-OHC和7-KC 1:1:1 (250-350 pmol)的混合物，在乙腈:甲醇組成的流動相中，90:10 v/v的等等條件下洗脫，記錄為總離子電流。事實上，7β-OHC和7-KC在幾乎相同的保留時間被洗脫，阻止了任何可能的明確識別。然而，稍微修改流動相(乙腈:甲醇，65:35 v/v)允許兩種分析物有足夠的分辨率。如圖3A所示，在單個分子離子上記錄的標準混合物的LC-MS痕跡顯示，7β-OHC和7-KC具有足夠的色譜分辨率，可以識別和定量峰(分別保留時間為5.80分鍾和6.09分鍾)。
圖2:A.將分析物直接注入質譜檢測器獲得的商業標準品的質譜。質量值在2ppm的精度內確定。
B. LC-MS分析在等容條件下(乙腈:甲醇，90:10 v/v)從反相色譜柱中洗脫的膽固醇、7β-高膽固醇和7酮膽固醇的標準混合物(250-350 pmol)，並記錄為總離子電流。本圖報道了峰洗脫時間為8.02分鍾的物種成分的質譜分析。
該方法根據當前FDA和EMA生物分析指南進行了驗證[16,17]。在低膽固醇濃度(2 μ M)和高膽固醇濃度(100 μ M)甲醇標準溶液中，通過每次運行3次分析每種溶液來確定測定內重複性。為了定量目的，構建了膽固醇、7β-OHC和7-KC的校正曲線，發現在廣泛的動態範圍內(10-2000 ng)呈線性，相關係數(r2)介於0.99至1.00之間(圖3B)。從精子基質中膽固醇的回收率估計為92±8%。LC-MS法測定膽固醇、7β-OHC和7-KC的重複性由分析內和分析間測量的變異係數(CV)估計，得到的值分別為9.5% ~ 15.00%。檢測限分別為:膽固醇9.2 ng、7β-OHC 11.9 ng和7-KC 6.0 ng。
圖3:a . LC-MS分析從等容條件下(乙腈:甲醇，65:35 v/v)的反相色譜柱中洗脫的膽固醇、7β-高膽固醇和7-酮膽固醇的標準混合物(250-350 pmol)，並記錄在每個分子離子上(膽固醇分別為369.35 m/z, 7β-高膽固醇為385.33 m/z, 7 -KC為401.33 m/z)
B.膽固醇(30- 600ng)、7β-OHC (12- 100ng)和7-KC (8- 100ng)定量測定的校準曲線。在LC-MS儀中注入增加用量的每種(氧)甾醇標準物，繪製相應質量峰與注入分析物量的積分麵積，得到曲線。峰麵積相對於注入的最大分析物量取為100%。將LC-MS數據進行線性插值，得到校正曲線方程。
圖4A報道了來自健康捐獻者的精子細胞中羥甾醇的代表性LC-MS分析。所開發的方法在很大程度上可以明確識別7β-OHC和7-KC並進行相應的定量。圖3B報告了我們健康誌願者組中檢測到的三種甾醇水平的散點圖。結果顯示為每百萬細胞ng的甾醇。這些甾醇種類分布廣泛，分別為2.9 ~ 25.9 ng/106細胞(平均值9.5±7.8 ng/10)6在0.64 ~ 2.88 ng/106 cells之間(平均值1.61±0.70 ng/10)67β-OHC含量為0.23 ~ 1.26 ng/106細胞(平均值0.82±0.34 ng/1067-KC細胞)。正常精子症患者精子中Chol水平明顯低於低精子症患者(精子總數≤39 × 10)6細胞/射精(分別為3.5±0.7 ng/106細胞vs 11,7±7,3 ng/106細胞,P = 0.048)。此外，與正常精子受試者相比，低精子受試者的精子細胞中發現了更高水平的Chol氧化衍生物(分別為:7β-OHC 0.81±0.17 ng/10)6細胞normozoospermicvs1.82±0.58 ng/106細胞oligozoospermic, P = 0.006;7-KC 0.36±0.16 ng/106細胞正常精子vs 0.93±0.23 ng/106細胞oligozoospermic, P = 0.001)。
圖4:a .從一名男性捐獻者的真實精子樣本中提取的膽固醇、7β -膽固醇和7酮膽固醇的代表性LC-MS分析。在每個分子離子上記錄LC跡(膽固醇為369.35 m/z, 7β -OHcholesterol為385.33 m/z, 7 -KC為401.33 m/z)。
B.散點圖顯示12名男性精子樣本中膽固醇(圓圈)、7β -膽固醇(正方形)和7酮膽固醇(三角形)的定量。數據報告為ng of固醇/106精子細胞。在每個散點圖中還報告了平均值(橫條)，標準偏差(須)和來自正常精子樣本的數據(紅色指標)。
在本研究中，我們描述了一種快速和可靠的方法的發展，使用LC-MS分析，定量人類精子細胞中的Chol和主要的oxy甾醇。此外，盡管樣本量較小，這些初步數據表明，生精過程的紊亂通過調節甾醇模式對精膜的組成、結構和功能產生重要影響。此外，考慮到7β-OHC和7-KC是Chol的氧化衍生物，被認為在精子功能中有作用[3,13]，它們在精子細胞中的定量可能是評價試驗暴露於具有毒理學重要性的環境因素(如汙染物或熱應激[18,19])的一個有吸引力的標記，或相反，驗證抗氧化劑治療的有效性。在這方麵，有必要對更大隊列的精細特征患者進行進一步研究，以解決這些假設。
我們描述了一種用於檢測人類精子細胞中膽固醇和主要氧甾醇的穩健LC-MC方法。該方法為研究羥甾醇(作為Chol的氧化衍生物)在精子生理中的作用提供了一個有用的工具。
Marino Bellini博士(帕多瓦大學藥學和藥理科學係)在MS分析方麵提供的專家技術援助非常感謝。
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文章類型:研究文章
引用:Šabović I, De Toni L, Tescari S, De Filippis V, Menegazzo M，等(2017)通過快速可靠的LCMS方法檢測人精子膜中的膽固醇及其氧化衍生物。中華臨床檢驗醫學2(1):doi http://dx.doi。org/10.16966/2572 - 9578.109
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